袁慰,王永秋
(淮北師范大學化學與材料科學學院,安徽淮北235000)
分析測試
HPLC法測定L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量
袁慰,王永秋*
(淮北師范大學化學與材料科學學院,安徽淮北235000)
建立了HPLC法分離測定L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量。色譜條件為:Shim-packVP-ODS柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-NaH2PO4水溶液,NaH2PO4溶液濃度為0.05mol·L-1、pH值為6.50(H3PO4調節),甲醇與NaH2PO4溶液體積比為1∶9;流速0.80mL·min-1;柱溫為30℃;檢測波長為210nm;進樣量5μL。該方法的建立為L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的測定提供了新方法。
HPLC;L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽;L-丙氨酸
以氨基酸為原料合成的氨基酸甲酯鹽酸鹽在藥物化學、生物合成化學、食品加工和光學活性材料等領域發揮著重要作用[1-4]。氨基酸甲酯鹽酸鹽不但有較強的吸水性,而且穩定性較高,干燥后可保存備用,十分方便[5]。目前,有關氨基酸衍生物測定的方法正在不斷發展,色譜法、電化學法、毛細管電泳法、分光光度法是常用的方法,但采用液相色譜檢測L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽及L-丙氨酸的方法未見報道。本文建立的高效液相色譜測定方法,為生產和使用該產品的企業提供一種檢測手段。
1.1 試劑和儀器
L-丙氨酸,L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽,NaH2PO4,KH2PO4均為分析純,甲醇為色譜純,超純水。
島津LC-20A高效液相色譜儀;島津SPD-M20A二極管陣列紫外檢測器;島津LC-Solution色譜工作站;Mole超純制水機(上海摩勒生物科技公司);pHS-3C酸度計(上海雷磁)。
1.2 溶液配制
精密稱取一定量L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽,分別用流動相溶解,并定容到100.0mL。將L-丙氨酸再分別稀釋,得到不同濃度的標準品溶液。
1.3 色譜條件
Shim-pack VP-ODS柱(150mm×4.6mm I.D, 5μm);流動相為甲醇-Na2HPO4水溶液,甲醇與Na2HPO4溶液體積比為1∶9,Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1、pH值為6.50(用H3PO4調節);流速為0.80mL·min-1;柱溫為30℃;檢測波長為210nm;進樣量為5μL。
2.1 色譜條件的確定
2.1.1 流動相的選擇采用Shim-pack VP-ODS柱,用甲醇-KH2PO4混合水溶液做流動相。分別考察了甲醇與KH2PO4溶液體積比、KH2PO4溶液濃度、pH值對L-丙氨酸和L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽分離的影響,結果表明L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽與L-丙氨酸均不能實現基線分離。
當用甲醇-Na2HPO4混合水溶液為流動相時,L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-丙氨酸的分離度明顯增加。當Na2HPO4溶液的濃度由0.01mol·L-1增加到0.05mol·L-1時,分離度增加,繼續增加磷酸鹽溶液濃度至0.1mol·L-1,發現兩者的分離度又變小。
在Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1(pH值8.40)不變的前提下,用H3PO4調節其pH值,降低磷酸鹽溶液的pH值,分離度有所增加,但pH值低于6.5時,分離度變小。
在Na2HPO4溶液濃度為0.05%mol·L-1,pH值6.5不變的前提下,調節甲醇與Na2HPO4溶液的體積比,由3∶7到2∶8到1∶9,發現兩者體積比減小,分離度增加。
故選用Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1,pH值6.5(H3PO4調節),甲醇與Na2HPO4溶液體積比為1∶9,作為本研究的最佳流動相參數。
2.1.2 流速和柱溫的選擇按照上述確定的流動相參數,改變流速(從0.2到1.0mL·min-1)時,發現流速越小,分離效果越好,但是相應的分析時間也會變長,流速為0.8mL·min-1時可達到基線分離。當改變柱溫時發現,將柱溫升高會導致基線不穩,以30℃較好。
綜上所述,色譜條件可確定為:Shim-pack VP-ODS柱(150mm×4.6mm I.D,5μm);流動相為甲醇-Na2HPO4混合水溶液,Na2HPO4溶液濃度為0.05mol·L-1、pH值6.5.00(H3PO4調節),甲醇與Na2HPO4液體積比為1∶9;流速為0.80mL·min-1;柱溫為30℃;檢測波長為210nm;進樣量5μL。色譜見圖1。
圖1 L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽色譜圖Fig.1The HPLC Chromatograms of L-alanine methyl ester hydrochloride
2.2 標準曲線及線性范圍
選取5個適宜濃度的L-丙氨酸標準樣品溶液,按照上述確定的色譜條件進樣,進樣前用0.45 μm膜過濾,按峰面積對濃度進行線性擬合,得到L-丙氨酸的線性回歸方程。結果表明,L-丙氨酸在1.01~5.05g·L-1濃度范圍內有較好線性關系,線性回歸方程為Y=203193X-5466,相關系數為0.9998。L-丙氨酸檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為0.00588和0.0196g·L-1。
2.3 方法的精密度
將L-丙氨酸標準樣品溶液分別放置0、1、2、3、4、5h以及0、1、2、3、4、5d,經0.45μm膜過濾后,按上述確定色譜條件進樣,記錄色圖譜數據,按面積-外標法計算日內、日間的RSD,分別為0.77%和1.9%,表明實驗精密度較好,誤差較小,穩定性較好。
2.4 方法的準確度和重復性
2.4.1 回收率的測定稱取一定量L-丙氨酸標準樣品,加到L-丙氨酸甲酯混合液中,0.45μm膜過濾,按上述確定的色譜條件進樣,平行測定9次,記錄數據,按照峰面積-外標法計算含量和回收率,結果見表1。
表1 回收率的測定結果Tab.1The Results of the recovery
由表1可知,平均回收率和RSD均符合正常測定要求,該方法的準確度較高。
2.4.2 重復性的測定稱量同一批次的L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽樣品6份,每份100.0 mg,用100.0mL流動相溶解,得到樣品溶液,用0.45μm膜過濾后,按上述確定色譜條件進樣5μL,記錄數據,按照峰面積-外標法計算雜質含量,結果見表2。
表2 重復性的測定結果Tab.2The Results of the repetition
由表2可知,RSD為1.97%,說明利用HPLC測量L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中L-丙氨酸含量重復性較好,試驗方法可靠,符合正常檢測要求。
本方法精密度和準確度較高,線性關系良好,且均達到要求,可以定量檢測L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽中的L-丙氨酸雜質,為生產和使用L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的企業提供一種檢測手段。
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Determination of L-alanine in L-alanine methyl ester hydrochloride by HPLC
YUAN Wei,WANG Yong-qiu*
(Department of Chemistry and Materials Science,Huaibei Normal University,Huaibei 235000,China)
A method for determining the L-alanine in L-alanine methyl ester hydrochloride by HPLC was established.The chromatography separation was performed on an VP-ODS(150mm×4.6 mm,5μm);Mobile phase: methanol and disodium hydrogen phosphate aqueous;the concentration of disodium hydrogen phosphate is 0.05 mol·L-1,pH=6.50;methanol:disodium hydrogen phosphate=1∶9;the flow rate is 0.80mL·min-1;column temperature is 30℃;the detection wavelength is 210 nm;the injection volume is 5μL.The establishment of this method for producing L-alanine methyl ester hydrochloride provides a new method for the determination of analysis.
HPLC;L-alanine methyl ester hydrochloride;L-alanine
O657.7
A
1002-1124(2014)02-0017-02
2013-12-10
袁慰(1989-),女,在讀碩士研究生,研究方向:氨基酸酯的合成與檢測。
導師簡介:王永秋(1962-),男,研究方向:化學應用技術開發。