7種十字花科種子中黑芥子酶降解油菜籽餅粕中硫苷的產物比較分析

丁 艷，李麗倩，顧振新，韓永斌

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

油菜籽餅粕富含蛋白質和氨基酸，是一種潛在的食用蛋白源。但是硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）等抗營養因子的存在，限制了其在食品和飼料的利用，大部分作為肥料造成資源的浪費[1]?，F有研究[2-5]表明硫苷降解產物之一——異硫氰酸酯類物質不僅是形成十字花科蔬菜和調味品風味的化合物，還具有參與植物防御、生長素動態平衡及人類癌癥預防等生物活性，受到國內外學者廣泛關注。

黑芥子酶（EC3.2.3.1）是一種可以降解硫苷的水解酶，主要分布于十字花科植物體內[6-7]，可將硫苷降解成硫氰酸酯、異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮和腈等物質[8]，這些降解產物的組成和比例受黑芥子酶性質、硫苷側鏈、pH值及金屬離子的影響[9-12]。由于亞基、分子質量及糖基化程度不同，植物中形成不同形式和結構的黑芥子酶。黑芥子酶的三維結構，以及黑芥子酶結合蛋白和協助蛋白對硫苷降解的影響，主要表現在不同來源的黑芥子酶對相同硫苷的降解率[13]和硫苷的降解產物組分[14]存在差異。Shen Lianqing等[15]添加西蘭花種子黑芥子酶能提高西蘭花種子異硫氰酸酯含量，減少腈類等物質的產生，但關于不同來源的黑芥子酶對硫苷降解產物組分的研究鮮有報道。本研究比較了十字花科種子中黑芥子酶對油菜籽餅粕中硫苷降解組分的影響，以期獲得能減少有毒副作用的惡唑烷酮及腈類物質產生、盡可能多的生成異硫氰酸酯的黑芥子酶，為油菜籽餅粕的合理利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜籽、油菜籽餅粕 南京隆盛油脂有限公司；白菜籽（抗病北京3號大白菜）、蘿卜籽（夏秋白蘿卜）、西蘭花籽（綠玉80 d）、芥藍籽（香港白花芥藍）、芥菜籽（花葉香芥菜）、甘藍籽（精選8132F1甘藍） 南京金盛達種子公司。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇、甘油、硫酸銨、二氯甲烷、聚乙二醇均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；黑芥子硫苷酸鉀（＞99%）標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

12～14 kD透析袋 美國Pharmacia公司；FSD-100A型電動粉碎機 臺州市新恩精密糧儀有限公司；JA2003電子天平 上海滬粵明科學儀器有限公司；AUY120精密天平 日本Shimadzu公司；Orion818型pH測定儀日本Orion公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；TDL-40B離心機 上海安亭科學儀器廠；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；UV-2802型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Agilent 7890/5975C氣質聯用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 黑芥子酶的提取

黑芥子酶（西蘭花籽、油菜籽、白菜籽、蘿卜籽、芥藍籽、甘藍籽和芥菜籽黑芥子酶分別簡寫為BSm、RPSm、WCSm、RDSm、KSm、CSm、MSm）提取方法參照文獻[16]，6 g種子經電動粉碎機碎成粉末，加入60 mL 10 mmol/L磷酸鉀緩沖液（其中添加1 mmol/L EDTA、3 mmol/L二硫蘇糖醇、5%甘油）（pH 7.2），冰浴研磨，冰浴條件下超聲破碎20 min，4 層紗布過濾除濾渣，濾液在4 ℃、16 000 r/min離心30 min，取上清液50 mL，加入固體硫酸銨使上清液飽和度達到55%，4 ℃放置1 h，16 000 r/min冷凍離心30 min，使黑芥子酶聚集，取沉淀溶于4 mL去離子水中，并用去離子水透析4 ℃過夜，透析袋取出后表面擦干，放入盛有聚乙二醇的燒杯內，4 ℃放置0.5 h，得到黑芥子酶提取濃縮液，0.066 7 mol/L 磷酸鉀緩沖液定容至30 mL。

1.3.2 黑芥子酶活力的測定

在Eylen等[17]的基礎上改進，1.50 mL 0.066 7 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）、500 μL抗壞血酸溶液（1 mmol/L）、50 μL黑芥子硫苷酸鉀溶液（25.18 mmol/L）和20 μL酶液，分別在37 ℃條件下保溫，混合平衡1 min。置于1 cm光路石英比色皿中，37 ℃反應30 min，測定227 nm波長處吸光度計算酶活力。分別取25.18 mmol/L黑芥子硫苷酸鉀標品0、12.5、25、37.5、50、70 μL，用緩沖液將其定容至2.07 mL，測定其在227 nm波長處的吸光度，以濃度（mmol/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=0.948 4X-0.002 8（R2=0.999 4）。

酶活力單位定義[16]：在pH 6.5、37 ℃條件下，1 min催化1 μmol的黑芥子硫苷酸鉀所需要的酶量稱為1 個活力單位（U）。酶比活力（U/mg）單位定義為每毫克蛋白質中黑芥子酶的活力。

式中：N為反應時間內黑芥子酶降解黑芥子硫苷酸鉀的量/μmol；t為反應時間/min；VE為酶液體積/mL；VEX為提取液體積/mL。

1.3.3 總蛋白的測定

參照考馬斯亮藍G-250染色法[18]。

1.3.4 硫苷降解產物的制備與提取

油菜籽餅粕粉碎后過60 目篩，90 ℃干燥4 h至恒質量。

取1.3.1節黑芥子酶提取液5 mL，與5 mL 0.066 7 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）混合，加入1.00 g油菜籽餅粕，40 ℃水浴反應2 h，100 ℃滅酶15 min。加入5 mL二氯甲烷提取30 min，5 000 r/min離心15 min，取有機層過0.45 μm膜，35 ℃旋轉真空濃縮，得到降解產物提取物。

同時制得黑芥子酶提取液和不加酶的油菜籽餅粕的降解產物提取物。

1.3.5 GC-MS分析條件

色譜柱：Hp-5ms石英毛細管柱；載氣：氦氣；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫條件：起始35 ℃保持5 min，以10 ℃/min升溫至210 ℃保持5 min。

質譜條件：EI離子源溫度：240 ℃；接口溫度：250 ℃；四極桿溫度：150 ℃；EI能量：70 eV；掃描范圍m/z：50～240。

1.4 數據統計與分析

GC-MS數據通過化學工作站數據處理軟件分析譜圖，檢索NIST08譜圖庫，結合人工圖譜解析及資料分析，確定揮發性物質的各個化學成分的結構式，按峰面積歸一化法求得各成分相對百分含量，僅當匹配度大于80%（完全匹配為100%）的鑒定結果才予以報道。

2 結果與分析

2.1 7種十字花科植物種子黑芥子酶比活力比較

圖1 7種十字花科植物種子黑芥子酶活性比較Fig.1 Myrosinase activities in seven cruciferous seeds

由圖1可知，7 種十字花科植物種子黑芥子酶的比活力從高到低依次為，西蘭花籽、油菜籽、白菜籽、蘿卜籽、芥藍籽、甘藍籽、芥菜籽。其中BSm酶比活力最高，為69.4 U/mg，顯著高于其他酶比活力（P＜0.05）。RPSm次之，為59.8 U/mg，MSm酶比活力最低，為14.5 U/mg。

2.2 不同來源黑芥子酶對油菜籽餅粕中硫苷降解產物組分的影響

對7 種來源不同的黑芥子酶液及其酶解油菜籽餅粕中的硫苷降解產物GC-MS總離子流圖進行計算機譜庫檢索，總離子流圖見圖2。

圖2 不同來源黑芥子酶酶解硫苷產物及黑芥子酶提取物總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of hydrolysates of glucosinolates by myrosinases from different cruciferous seeds and compounds in the extract of myrosinase

2.2.1 添加外源RPSm降解油菜籽餅粕中硫苷的產物

由表1可知，油菜籽餅粕中的硫苷經RPSm降解后的產物（稱為基本產物）主要包括6 種，即3種異硫氰酸酯：1-丁烯基-4-異硫氰酸酯（31.20%）、烯丙基異硫氰酸酯（1.46%）、2-苯乙基異硫氰酸酯（1.04%）；1 種腈類物質：苯丙腈（3.90%）和2 種惡唑：致甲狀腺腫素（28.59%）、2,1-苯并異惡唑（2.11%）。而對照只檢測到4 種物質：烯丙基異硫氰酸酯（0.13%）、1-丁烯基-4-異硫氰酸酯（1.73%）、致甲狀腺腫素（2.38%）、2,1-苯并異惡唑（0.14%）。與對照相比，外加RPSm后，1-丁烯基-4-異硫氰酸酯相對含量從1.73%增至31.20%，致甲狀腺腫素相對含量從2.11%增至28.59%，烯丙基異硫氰酸酯從0.13%升至1.46%，2,1-苯并異惡唑從0.14%升至2.11%?？梢钥吹?，外加RPSm不僅能增加產物組分種類，還增大了各組分的相對含量。

2.2.2 6種其他來源的黑芥子酶降解油菜籽餅粕中硫苷生成產物的組成差異

與基本產物相比，6 種其他來源的黑芥子酶降解產物中新物質的種類明顯增加。WCSm降解油菜籽餅粕中的硫苷不僅產生基本產物，還產生了1-丁基異硫氰酸酯（0.93%）、1-戊烯基,5-腈（0.62%）和3-吲哚乙腈（1.16%）3 種新物質。RDSm的降解產物中有丁腈（0.3%）、硫雜環戊烷-3,4-二腈（9.67%）、2,4-二甲基惡唑（4.05%）和5-甲氧基-4-甲基-2,1,3-苯并惡唑（11.35%）。BSm降解產物中同樣產生3 種新產物：硫雜環戊烷-3,4-二腈（3.82%）、2-乙基-4甲基-惡唑（5.94%）、3-吲哚乙腈（1.56%）。KSm和CSm產生1-丁基異硫氰酸酯、3-吲哚乙腈、2-氰基甲基-1,3-苯并惡唑等3 種新產物。添加來自MSm產生2 種新物質，即1-丁基異硫氰酸酯（3.75%）和3-吲哚乙腈（2.74%）。

表1 十字花科植物種子黑芥子酶降解油菜籽餅粕中硫苷產物組分Table 1 Glucosinolate degradation products in rapeseed meal hydrolyzed by myrosinases from different cruciferous seeds

添加外源黑芥子酶，降解產物中出現了新物質，同時減少了基本產物的組成和含量。RDSm降解產物中未檢測到烯丙基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯，MSm中未檢測到1-丁烯基-4-異硫氰酸酯。這6 種黑芥子酶均未檢測到2,1-苯并異惡唑。推測是不同來源的黑芥子酶影響硫苷降解產物的組成[13]。

2.2.3 6種其他來源的黑芥子酶對基本產物相對含量的影響

1-丁烯基-4-異硫氰酸酯是主要降解產物，在CSm、RPSm、WCSm、BSm和KSm 5 種黑芥子酶降解產物中含量較高，相對含量分別為33.22%、32.20%、29.46%、26.91%和26.61%；RDSm含量最低為0.54%，而MSm未檢測到。但MSm和RDSm降解產物中苯丙腈含量顯著高于其他黑芥子酶的產生量，分別為7.94%和7.01%。此外，MSm降解產物中致甲狀腺腫素含量最高，為29.35%；WCSm與RPSm生成量相近，分別為28.83%和28.59%；CSm、BSm、KSm和RDSm生成致甲狀腺腫素相對含量分別為17.50%、15.94%、13.59%和12.59%。MSm不產生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯，但致甲狀腺腫素含量高于其他黑芥子酶的生成量，可能與黑芥子酶降解硫苷的特異性有關[23]。

RDSm降解產物中未檢測到烯丙基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯，其他6 種十字花科種子黑芥子酶降解產物中均檢測到。這2 種產物在KSm降解產物中含量最高，分別為1.86%和2.18%；CSm相對含量最小，分別為1.12%和1.45%。不同黑芥子酶生成這2 種異硫氰酸酯在的含量差別較小。

3 討 論

3.1 7種黑芥子酶活性差異分析

本實驗比較了7 種黑芥子酶比活力，不同來源的黑芥子酶比活力存在顯著差異。朱磊[16]研究本實驗7 種黑芥子酶活性，BSm的活性最高，KSm活性最低。Bones[19]測定RPSm、WCSm和RDSm活力，發現RPSm活性最低。以上報道均與本實驗結果不同，可能與黑芥子酶的活性與植物種類、品種和器官有關[3]。據報道，黃芥籽中的內生黑芥子硫苷酸鉀含量較高，其內源黑芥子酶對黑芥子硫苷酸鉀的比活力很低，但對于4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷的降解率較高[16]，說明酶的底物也是影響黑芥子酶活性的重要因素[9]。

3.2 7 種黑芥子酶對油菜籽餅粕中硫苷降解產物組分差異分析

不同來源的黑芥子酶降解油菜籽餅粕中的硫苷，同一種產物的相對含量存在差異。實驗中BSm的活性最高，顯著高于CSm，但CSm產生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯高于BSm生成量，在相同硫苷含量的前提下，硫苷降解產物相對含量并未隨酶活的增加而增加，不同來源的黑芥子酶對同一底物硫苷的降解率存在差異[16]，有研究發現在植物體內硫苷含量與黑芥子酶活性無直接關系[19]?？梢?，酶活不是決定硫苷降解產物含量的必要條件。不同植物種類、器官的存在不同黑芥子酶形式的同工酶，是影響硫苷降解產物含量和種類的重要因素之一[14]。此外，Halkier等[20]研究表明，不同來源的黑芥子酶對硫苷的特異性不同，同時朱磊[16]在研究中指出親緣性較近的植物中黑芥子酶性質基本相似。

RDSm產物中未檢測到烯丙基異硫氰酸酯和2-苯乙基異硫氰酸酯，在關于蘿卜中風味物質的研究中[21-22]，相關物質也未見報道。MSm降解產物中未檢測到1-丁烯基-4-異硫氰酸酯，在芥菜中[23-24]未檢測到或相對峰面積在0.11%。主要是由于蘿卜和芥菜的親緣性與油菜較低，酶的專一性影響黑芥子酶與硫苷的結合[16]。WCSm、KSm、MSm和CSm降解油菜籽餅粕中硫苷后產生丁基異硫氰酸酯，研究表明這4 種黑芥子酶具有降解硫苷生成丁基異硫氰酸酯的特性，這種特性在植物的不同形態下選擇性表達[25-26]。

與基本產物相比，6 種其他來源的黑芥子酶降解產物中腈類和惡唑類種類增加。7 種黑芥子酶降解產物中均檢測到苯丙腈和甲狀腺腫素，但是相對含量不同，這可能與黑芥子酶對前體硫苷降解率不同相關[13]。3-吲哚乙腈是WSm、BSm、KSm、MSm和CSm降解硫苷的產物，是黑芥子酶、黑芥子酶協助蛋白和pH值等共同作用的結果，也有硫苷代謝途徑研究表明3-吲哚-乙腈途徑是植物中的黑芥子酶遭遇脅迫（如缺硫）產生[27-28]，參與生長素合成以及植物的防御反應。丁腈（0.3%）、硫雜環戊烷-3,4-二腈（9.67%）、2,4-二甲基惡唑（4.05%）和5-甲氧基-4-甲基-2,1,3-苯并惡唑（11.35%）是RDSm產生的新物質。以上4 種新產物在劉賢嫻[21]、Bla?evi?[22]等關于多品種蘿卜及蘿卜葉的研究中并未檢測到。RDSm產生腈類和惡唑種類比其他來源的黑芥子酶多，可能是蘿卜與油菜的物種的親緣性較低，還與RDSm相關蛋白會將硫苷?；痆29-30]有關，但這些還未被完全證實。

4 結 論

7 種十字花科植物種子中黑芥子酶的比活力由高到低的順序依次為BSm、RPSm、WCSm、RDSm、KSm、CSm和MSm；BSm酶比活力最高，為69.4 U/mg，而RPSm為59.8 U/mg，MSm酶比活力最低，為14.5 U/mg。不同來源黑芥子酶的比活力存在顯著差異。

添加不同來源黑芥子酶會使油菜籽餅粕中硫苷降解產物的種類和相對含量產生明顯差異。WCSm、KSm、MSm及CSm降解產物檢測到新組分丁基異硫氰酸酯，相對含量分別為0.93%、1.35%、1.18%和1.36%。CSm產生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯含量最高（33.22%），RPSm產生1-丁烯基-4-異硫氰酸酯相對含量為32.20%；RDSm生成量較少（0.54%），而MSm產物中未檢測到。除RPSm外，其他6 種降解產物中幾乎不產生2,1-苯并異惡唑，但其他惡唑類及腈類產物種類增加，惡唑類有4 種：2,4-二甲基惡唑，2-乙基-4甲基-惡唑，5-甲氧基-4-甲基-2,1,3-苯并惡唑，2-氰基甲基-1,3-苯并惡唑。腈類主要有3 種：丁腈、1-戊烯基,5-腈和3-吲哚乙腈。不同來源的黑芥子酶在相同實驗條件下降解油菜籽餅粕中硫苷產生的產物種類和相對含量存在明顯差異。在油菜籽餅粕中添加RPSm，能有效減少硫苷轉化為惡唑類和腈類物質。

[1]ROSENTHAL A, PYLE D L, NIRANJAN K, et al.Combined effect of operational variables and enzyme activity on aqueous enzymatic extraction of oil and protein from soybean[J].Enzyme and Microbial Technology, 2001, 28(6): 224-228.

[2]林旭輝, 李榮, 姜子濤.辣根揮發油化學成分的研究[J].食品科學,2001, 22(3): 73-75.

[3]WINDE I, WITTSTOCK U.Insect herbivore counteradaptations to the plant glucosinolate-myrosinase system[J].Phytochemistry, 2011, 72:1566-1575.

[4]AGERBIRK N, de VOS M, KIM J H, et al.Indole glucosinolate breakdown and its biological effects[J].Phytochemistry Review, 2009,8: 101-120.

[5]KEUM Y S, JEONG W S, KONG A N.Chemoprevention by isothiocyanates and their underlying molecular signaling mechanisms[J].Mutation Research, 2004, 555(1/2): 191-202.

[6]WALLACE S K, EIGENBRODE S D.Changes in the glucosinolatemyrosinase in theBrassica junceacotyledons during seedling development[J].Journal of Chemical Ecology, 2001, 28: 243-256.

[7]WITTSTOCK U, HALKIER B A.Glucosinolate research in theArabidopsis era[J].Trends in Plant Science, 2002, 7: 263-270.

[8]MCGREGOR D I.Glucosinolate content of developing rapeseed(Brassica napusL.Midas) seedlings[J].Canadian Journal of Plant Science, 1988, 68: 367-380.

[9]RASK L, ANDREASSON E, EKBOM B, et al.Myrosinase: gene family evolution and hethivore defense in Brassieaeeae[J].Plant Molecular Biology, 2000, 42: 93-113.

[10]BONES A M, ROSSITER J T.The enzymic and chemically induced decomposition of glucosinolates[J].Phytochemistry, 2006, 67: 1053-1067.

[11]BURMEISTER W P, COTTAZ S, DRIGUEZ H, et al.The crystal structures ofSinapis albamyrosinase and a covalent glycosyl-enzyme intermediate provide insights into the substrate recognition and activesite machinery of anS-glycosidase[J].Structure, 1997, 5: 663-675.

[12]TAIPALENSUU J, ANDREASSON E, ERIKSSON S, et al.Regulation of the wound-induced myrosinase-associated protein transcript inBrassica napusplants[J].European Journal of Biochemistry, 1997, 247: 963-971.

[13]ANDERSSON D, CHAKRABARTY R, BEJAI S, et al.Myrosinases from root and leaves ofArabidopsis thalianahave different catalytic properties[J].Phytochemistry, 2009, 70: 1345-1354.

[14]MATUSHESKI N V, JEFFERY E H.Comparison of the bioactivity of two glucoraphanin hydrolysis products found in broccoli, sulforaphane and sulforaphane nitrile[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 5743-5749.

[15]SHEN Lianqing, SU Guangyao, WANG Xiangyang, et al.Endogenous and exogenous enzymolysis of vegetable-sourced glucosinolates and in fl uencing factors[J].Food Chemistry, 2010, 199: 987-994.

[16]朱磊.十字花科植物種子黑芥子酶酶學性質研究[D].北京: 北京化工大學, 2011.

[17]van EYLEN D, INDRAWATI, HENDRICKX M, et al.Temperature and pressure stability of mustard seed(Sinapis albaL.) myrosinase[J].Food Chemistry, 2006, 97: 263-271.

[18]李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京: 高等教育出版社,2000: 184-185.

[19]BONES A M.Distribution ofβ-thioglucosidase activity in intact plants, cell and tissue cultures and regenerant plants ofBrassica napusL.[J].Journal of Experimental Botany, 1990, 41: 737-744.

[20]HALKIER B A, GERSHENZON J.Biology and biochemistry of glucosinolates[J].Annual Review of Plant Biology, 2006, 57: 303-333.

[21]劉賢嫻.蘿卜營養及風味物質積累規律研究[D].泰安: 山東農業大學, 2009.

[22]BLA?EVI? I, MASTELI? J.Glucosinolate degradation products and other bound and free volatiles in the leaves and roots of radish(Raphanus sativusL.)[J].Food Chemistry, 2009, 113: 96-102.

[23]劉明春.榨菜加工過程中揮發性風味物質的形成及變化研究[D].重慶: 重慶大學, 2009.

[24]肖華志, 牛麗影, 廖小軍, 等.芥末油、青芥辣、沖菜的揮發性風味成分的SPME/GC/MS測定[J].中國調味品, 2004(6): 42-45.

[25]吳春燕, 何啟偉, 宋廷宇, 等.大白菜風味物質的氣相色譜-質譜分析[J].食品科學, 2009, 30(4): 145-148.

[26]吳春燕, 何啟偉, 宋廷宇, 等.白菜揮發性組分的氣相色譜-質譜分析[J].食品科學, 2012, 33(20): 252-256.

[27]KENDREW S G.YUCCA: a flavin monooxygenase in auxin biosynthesis[J].Trends Biochemistry Science, 2001, 26(4): 218.

[28]COHEN J D, SLOVIN J P, HENDRICKSON A M.Two genetically discrete pathways convert tryptophan to auxin: more redundancy in auxin biosynthesis[J].Trends Plant Science, 2003, 8: 197-199.

[29]TAIPALENSUU J, ERIKSSON S, RASK L.The myrosinase-binding protein fromBrassica napusseeds possesses lectin activity and has a highly similar vegetatively expressed wound inducible counterpart[J].European Journal of Biochemistry, 1997, 250: 680-688.

[30]TAIPALENSUU J, FALK A, RASK L.A wound- and methyl jasmonate-inducible transcript coding for a myrosinase associated protein with similarities to an early nodulin[J].Plant Physiology, 1996,110: 483-491.