對山東某豬場一起仔豬腹瀉的流行病學調查

（中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

對山東某豬場一起仔豬腹瀉的流行病學調查

張 志，董雅琴，劉 爽，吳發興，邵衛星，李曉成

（中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032）

本文針對發生腹瀉疫情的某豬場開展了實驗室檢測和流行病學調查，實驗室檢測表明該疫情的病原為豬流行性腹瀉病毒。流行病學調查顯示，此次腹瀉疫情于2013年11月份開始暴發，2014年3月份結束，發病豬的種類具有明顯的次序，育肥豬首先發生，其次是母豬，新生仔豬最后發??；發病率和死亡率與豬的種類、日齡密切相關，育肥豬和母豬發病后僅出現腹瀉癥狀而不死亡，仔豬發病后腹瀉癥狀明顯而且死亡率隨著年齡的增長急劇下降，3日齡以下仔豬死亡率可達100%，1周齡仔豬死亡率降至72.73%，12日齡仔豬死亡率僅有10%。對豬場風險因素分析表明，飼料車輛直接進入豬場、賣豬車輛與飼養人員接觸、糞便通道沒有封閉、飼養人員流動等是影響此次腹瀉疫情的高風險因素，通過降低高風險因素很好地控制了疫病。

豬流行性腹瀉；流行病學調查；檢測

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV）是引起豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀特征的豬腸道傳染病病原，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發病，但哺乳仔豬發病和死亡最為嚴重[1]。2011年以來，因豬流行性腹瀉病毒引起的腹瀉在我國豬群迅速傳播，仔豬一旦感染發病，死亡率可達60%～100%，給養豬業帶來了巨大的經濟損失[2-4]。2014年3月，山東某養殖場暴發腹瀉疫情，仔豬出現大規模的腹瀉、嘔吐、死亡等癥狀，該場迅速采樣送我中心進行檢測，經實驗室檢測證實樣品全部為豬流行性腹瀉病毒陽性，為進一步尋找病原來源，提出防治措施，我中心對該場又進行了流行病學調查，并針對此次疫情提出了針對性的防控建議。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

7頭呈現腹瀉癥狀的死亡小豬，日齡分別為2-12日齡，來自山東某豬場，剖檢后取其腸道和糞便樣品進行實驗室檢測。

1.2 試劑

PEDV RT-PCR的引物由本實驗室自行設計，RNA提取試劑盒TRIzol購自Invitrogen公司，反

轉錄酶AMV、Taq酶等購自TakaRa公司，其余試劑均為分析純產品。

1.3 實驗室PEDV 核酸檢測

1.3.1 豬糞便樣品的處理和RNA的提取

每一份糞便和腸道樣品均在一起，按照1∶5的比例加入PBS緩沖液，5000rpm 4℃離心10min，然后吸出上清液用于提取RNA和接種細胞。RNA的提取根據試劑盒的說明書進行，即取糞便懸液250μL于1.5mL的離心管中，加入750μL TRIzol（Invitrogen公司），混勻，室溫放置5min；再加入200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置10min；12000r-min、4℃離心15min，取上清500μL，加等體積-20℃預冷的異丙醇室溫靜置10min或-20℃靜置30min，12000r-min、4℃離心10min；棄上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC處理水配制），8000～9000g離心5min；棄上清，倒置風干，用20μLDEPC處理水溶解，-20℃凍存備用。

1.3.2 檢測引物

根據參考文獻[5]，設計2對引物，進行巢氏PCR擴增，一擴引物的擴增產物預計為854 bp，序列為：L12：5’-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3’；L13：5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’；二擴引物的擴增產物應為412 bp，其序列為：PA：5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’；PB：5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。引物由上海生工合成。使用時稀釋至20μm。

1.3.3 RNA病毒的檢測

首先制備cDNA，cDNA反應體系為：RNA 5μL，dNTP 4μL，5×AMV Buffer 4μL，反轉錄引物L131μL，AMV 0.5μL，HPRI 0.5μL，加入適量DEPC水，總體積為20μL。42℃恒溫水浴鍋中水浴1.5h，取出后放入-20℃冰箱保存備用。PCR擴增：取反轉錄的cDNA 2.0μL作為模板，加入10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol-L）2μL，分別加入PEDV的引物L12和L13各0.5μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 17.25μL?；靹蚝蟛捎萌缦鲁绦蜻M行PCR擴增：94℃預變性3min；94℃ 40s，56℃1min，72℃ 1min，30個循環；72℃延伸10 min。巢式PCR擴增：取上述PCR產物0.5μL，用引物PA和PB進行二次擴增，反應條件如下：94℃預變性3 min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 30s，32個循環；72℃延伸10 min。

1.3.4 PCR產物檢測 取10μL 一次和二次擴增的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中進行觀察有無特異性條帶。

1.4 流行病學調查

發放和填寫《豬群腹瀉等常見病流行病學調查表》，進行現場調查和談話，重點調查發病史、發病背景、發病范圍、發病率、死亡率、豬場與外界的接觸史、豬場衛生管理情況、防疫管理措施、生產記錄、用藥記錄以及現有疫苗的臨床免疫保護效果等，對返回的數據及時進行統計分析。

1.5 分析方法

用描述性流行病學方法和Excel軟件對采集的數據進行分析。

2 結果

2.1 樣品的實驗室檢測結果

該豬場共送來7頭死亡仔豬剖檢，分別來自7頭不同母豬，這些仔豬生前均出現嘔吐、拉稀、脫水等癥狀，剖檢后發現仔豬的腸道變薄腫脹（7/7）、充滿黃白色液體（7/7）、腦回溝變深充血和彌漫性出血（7/7）、胃內充滿白色乳樣凝塊（5/7），其他組織沒有發現明顯病變。每頭仔豬分別采集腦組織、糞便和一段小腸（約30cm長）混勻后進行多種病原檢測，結果7份樣品均檢測到了PEDV，而沒有檢測到TGEV、CSFV、PRRSV、PRV等病原。

2.2 流行病學調查結果

該豬場2008年建設和投入生產，引種后采取自繁自養的養殖模式，現存欄公豬17頭，能繁母豬700頭，后備母豬120頭，斷奶前仔豬800頭，保育豬1200頭，育肥豬4300頭。豬場有專職獸醫，養殖環境相對獨立，有門禁、消毒設施，采取進場前消毒、換膠鞋等衛生防疫措施。妊娠母豬產前20和40天分別免疫豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎二聯滅活苗。2013年12月份，豬場開始出現腹瀉，抗生素治療無效。從發病時間看，最初為育肥豬，其次為母豬和仔豬，母豬和育肥豬基本沒有死亡，

呈一過型，但仔豬死亡率很高，可達70%以上。

2.3 病例的時間分布

該場豬群出現腹瀉的時間與豬的種類密切相關。首先是育肥豬，然后是母豬，最后是仔豬。時間分布詳見圖1。

圖1不同豬發病和結束時間

表1不同種類豬腹瀉發生的狀況

表2仔豬日齡與發病的關系

圖2豬場平面圖

2013年11月5日左右，育肥后期豬（約200斤）最先開始發病，接著育肥前期、育肥中期豬和保育豬發病，主要癥狀為不吃料、拉稀、水樣腹瀉，持續1周，然后自愈，截至11月22日，無新發病例出現，4300頭育肥豬共有3912頭豬出現發病，發病率為91%，1200頭保育豬共有1056頭發病，發病率為88%，但沒有一頭豬死亡。2013年12月15日，母豬開始出現腹瀉癥狀，至12月31日，母豬無新發病例出現，700頭母豬中有50頭表現拉稀，發病率為7.2%，但一般2天后自愈，呈現一過性，無母豬死亡。2014年1月，仔豬開始集中發病，至3月中旬，除了50頭發病母豬所產仔豬以外，其余母豬所產的新生仔豬都發病。1-3月期間，共有6棟產仔舍進行使用，每半月輪換一批母豬，先后有220頭母豬生產，共產活仔2089頭，3月上旬第6棟母豬舍在使用，該棟有40頭母豬存欄，已經生產23窩，其中16窩仔豬（163頭）也出現拉稀，但呈一過型，沒有出現仔豬死亡，其余7窩（80頭）的仔豬出現明顯的腹瀉癥狀，10日齡以上仔豬不死亡，但3日齡以下仔豬100%死亡，這7窩仔豬的平均死亡率為61.25%，如果考慮到16窩一過性仔豬，總體平均死亡率為20.16%，詳見表1。

進一步分析這7頭母豬所產仔豬的發病和死亡時間，可以發現，仔豬日齡越大，死亡率越低，3日齡以內發病的仔豬死亡率為100%；1周左右時，發病率降至72.73%，當達到12日齡時，死亡率只有10%（表2）。

2.4 病例的空間分布

該豬場占地面積72畝，離周邊最近居民1.2公里，隔離屏障相對較好，豬場分為生產區和辦公區，但二者之間只有一條道路相隔，沒有明顯的隔離屏障（豬場的平面圖如圖2所示）。此次疫情中，最先發病的是育肥舍5，然后是育肥舍6、2、1、3、4、7、8、9、10和保育舍。育肥舍與產仔舍的最短距

離為250m。產仔舍的發病順序是2、4、5、3、1。產仔舍6用于50頭出現腹瀉癥狀的母豬，該50頭母豬所產仔豬均沒有發病。從圖中可以明顯地看出，疫病是從育肥舍傳向母豬舍，然后傳向產仔舍，顯然育肥舍5是最初的傳染源。

2.5 病例的群間分布

此次腹瀉疫情，涵蓋了育肥豬、母豬和仔豬，但不同種類的豬出現的癥狀、持續時間和最終轉歸結果明顯不同，差異非常顯著。育肥豬發病快，傳播迅速，感染率高，一般呈一過性，癥狀主要表現水樣腹瀉，病程1周左右，能夠自愈，沒有出現死亡；母豬呈散在發生，發病率低，癥狀較輕，以拉稀為主，病程短，多2天自愈，沒有出現死亡；仔豬則表現發病快，傳播迅速，癥狀嚴重，表現水樣腹瀉、嚴重脫水、極度消瘦等，一窩仔豬往往全部發病，死亡率與豬的日齡密切相關，出生3日齡內出現腹瀉癥狀，死亡率100%；出生1周內出現腹瀉癥狀，死亡率可降至60%；超過10日齡的仔豬，死亡率不超過20%。

2.6 風險因素分析

在調查中，結合該豬場的養殖模式考慮了以下幾種引發疫病發生和傳播的風險因素，以及這些風險因素在該養豬場引發風險的可能性高低，其中，風險性比較高的因素有飼料車輛直接進入豬場、賣豬車輛與飼養人員接觸、糞便通道沒有封閉、飼養人員流動等，詳見表3。

表3豬場腹瀉風險因素分析表

通過此次調查，針對風險性高的風險因素，我們提出了加強豬舍消毒，更換腹瀉疫苗，母豬強化免疫，嚴防外來車輛進入豬場等措施，該豬場的腹瀉很快停止，取得了明顯的效果。

3 討論

流行病學調查是流行病學的一種基本研究方法，旨在通過調查了解疫病的空間、時間和群間分布，判斷病因，提出相應的防控措施。本文也是作者將流行病學調查和實驗室檢測相結合的一種嘗試，通過這種方式，既能夠明確病因，確定風險因素，也能夠更有針對性地提出有效合理的防控措施[6-7]。

2011年以來，我國部分豬場暴發了仔豬腹瀉，一些學者先后從腹瀉樣品中檢測到PEDV，甚至PEDV的陽性率可達80%以上[3-4]。但直到2013年底，仔豬腹瀉仍在我國部分豬場肆虐，最近美國又大規模暴發了豬流行性腹瀉，這些結果提示，僅僅依靠病原的分離鑒定并不能完全阻止腹瀉疫情的暴發，必須開展相關的流行病學調查。

2011—2013年，我中心對全國29個省份的7021個豬場開展了腹瀉流行病學問卷調查，結果表明有4060個豬場（57.83%）發生過腹瀉，而且豬場免疫豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎二聯活疫苗或二聯滅活苗保護仔豬的效果并不顯著，本文的調查也顯示同樣的結果。另外，本文調查也顯示，育肥豬特別是距離售豬口最近的育肥豬是此次疫情發生的傳染源。據豬場主回憶，2013年10月份，每隔1周，該豬場都會出售一批豬，最近一次10月25日時，有一頭豬趕上車輛后又逃回豬場，這頭豬當時沒有出售，我們推測這頭豬很可能是此次疫情的污染源。其原因在于去年冬季，山東省不少豬場發生了豬流行性腹瀉，一旦豬場發病后，場主往往急于銷售病豬，豬販子收購病豬以后，裝載該病豬的車輛就會攜帶豬流行性腹瀉病原，加上冬季病原不易滅活，病原可以長時間存活，并隨著車輛的運輸而長距離傳播。當豬販子的載豬車輛在不同的豬場之間來回流動購豬時，就會成為下一家豬場的傳染源。如果豬場的衛生防疫措施不嚴格、豬場內的糞便運輸和處理等管理措施不當，就會導致全場暴發疫病。

針對相關風險因素，經實施加強豬舍消毒、更換腹瀉疫苗、嚴防外來車輛進入豬場等措施，該豬場疫情停止，證實我們對風險因素的判斷是正確的。

[1] Daesub Song，Bongkyun Park. Porcine epidemic diarrhoea virus： a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines[J]. Virus genes，2012 ，44 （2）：167 -175.

[2] Yueyi Gao，Qiuwen Kou，Xinna Ge，et al. Phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus field strains prevailing recently in China[J]. Arch Virol，2013，158（3）：711-715.

[3] Qian Zhang，Ruiming Hu，Xibiao Tang，et al. Occurrence and investigation of enteric viral infections in pigs with diarrhea in China[J]. Archives of virology，2013 ，158（8）：1631-1636.

[4] Sun Rui-Qin，Cai Ru-Jian，Chen Ya-Qiang，et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J]. Emerging Infectious Diseases，2012，18（1）：161-163.

[5] 張志，李嵐，董雅琴，等. 豬流行性腹瀉病毒PCR檢測及其M基因的遺傳變異分析[J]. 動物醫學進展，2013，34（8）：13-18.

[6] 黃保續. 獸醫流行病學[M]. 北京：中國農業出版社，2010.

[7] 張傳亮，陳星宇，趙靈燕，等.浙江省豬病毒性腹瀉流行病學調查及防控對策[J].中國動物檢疫，2013，30（7）：47-48.

A epidemic survey of porcine diarrhea in a pig farm

Zhang Zhi，Dong Yaqin，Liu Shuang，Wu Faxing，Shao Weixing，Li Xiaocheng

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

A epidemic survey and laboratory detection were carried out for a pig farm which occurred diarrhea. The detection of virus was conf rmed the epidemic agent was porcine epidemic diarrhea virus. Further information of survey showed that this outbreak of diarrhea took place during Nov 2013 and Mar 2014 in sequence of fattening pigs，sows and piglets. However，the morbidity and mortality of different pigs were closely related to the pieces and birth days. Fattening pigs and sows had no deaths although they had been infected，while the piglet less than 3 old days had 100 percent mortality. If the piglets grown up to one week and 12 days，the mortality would drop to 72.73% and 10% separately. The risk analysis indicated that vehicles directly went into pig farms，a closed contact with their keepers by selling pigs，unclosed transfer channel of feces and urine，circulating of feed workers were all high risk factors inf uencing the diarrhea outbreak，which could be reduced to control the disease.

porcine epidemic diarrhea；epidemic survey；detection

S852.65

：B

：1005-944X（2014）10-0052-05

青島民生計劃項目（13-1-3-91-nsh）

李曉成