牛乳酪蛋白檢測方法研究進展

倪小琴，賴衛華*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

牛乳酪蛋白檢測方法研究進展

倪小琴，賴衛華*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

牛乳含有豐富的蛋白質，是比較理想的營養物質，但也是常見的過敏原之一。酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白，常作為牛乳過敏檢測的主要參考指標之一。其檢測方法主要包括基于免疫學的方法、聚合酶鏈式反應技術（polymerase chain reaction，PCR）、毛細管電泳分析、色譜法、質譜法等，本文就其檢測方法的原理、特性及實際應用進行綜述，并對未來檢測的發展方向進行展望。

酪蛋白；過敏原；檢測方法

牛乳制品是一種營養豐富的蛋白制品，同時也是常見的八大過敏物質之一，其致敏性嚴重影響了嬰幼兒的身體健康。根據修訂后的2007/68/EC[1]，歐盟法規規定在食品的生產加工過程中，若原料或產品中的某種成分來自附件Annex Ⅲa指定的過敏物質時，必須在食品標簽上明確標出這些物質的成分。據調查[2]，在發達國家中，牛乳過敏占過敏事件的3%～7.5%，嚴重影響了嬰幼兒的健康，部分甚至導致兒童死亡。而目前，對于食物過敏的最好最直接的辦法是嚴格避免食用含過敏原的食物，但在食品的加工生產過程中，會摻雜著少量潛在的致敏物質，所以，人們亟需研究出能夠快速檢測食物中致敏物質的方法，達到預防的目的。

牛乳過敏原引起的過敏反應是一種由IgE介導和非IgE介導的超敏反應，可引起皮膚、腸胃道、呼吸系統的反應，嚴重時甚至會導致系統過敏反應或休克。牛乳蛋白常作為一種常見的食品添加劑，應用在食品生產的很多方面，這些殘留的成分可能會引起致敏反應。本文通過總結歸納目前國內外常見的檢測牛乳酪蛋白的方法，簡述各種方法的原理及其應用，并對未來檢測的發展方向進行展望。

1 檢測酪蛋白的原理

牛乳中含有3%～3.5%的蛋白質，其中酪蛋白占總蛋白的80%[3]，是牛乳中最主要的過敏原之一。由于牛乳中酪蛋白含量較高，實驗可通過檢測酪蛋白的有無來判斷食物中是否含有牛乳成分，以此作為過敏人群判斷食品成分的一個依據?；诖?，本文主要對目前應用在酪蛋白上的檢測方法進行總結歸納。

2 牛乳過敏原酪蛋白的檢測技術

2.1 基于免疫學的分析技術

基于免疫學原理建立的檢測方法，是借助酶標記的抗體或抗原進行特異性結合的抗原抗體反應，并根據顯色顏色的深淺來進行定量或定性的分析方法。根據標記物的顯色物質的類型，將免疫類型可分為酶聯免疫吸附技術、免疫熒光技術、火箭電泳免疫技術、時間分辨熒光免疫分析這四類。

在應用免疫學方法檢測過敏物質時，考慮到酪蛋白的種類較多，且有研究表明過敏患者中，存在著對酪蛋白的各種成分過敏的 人群，并且，發現人群中對β-、κ-酪蛋白過敏的同時也對α-酪蛋白過敏[4]，故在檢測食品中是否含有過敏物質時，許多學者根據檢測特定的不同的物質選用對應的抗體和檢測原理，而在應用抗體方面，主要有兩種來源：采用混合酪蛋白進行免疫制備的多克隆抗體和購買的針對某一種酪蛋白的單克隆抗體，本文在此基礎上，總結歸納了各種實驗方法。

2.1.1 酶聯免疫吸附技術（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是在建立在酶標記免疫的基礎上，通過酶標記的抗體或抗原進行特異性結合，同時根據酶反應底物的顯色顏色深淺來進行定量或定性分析的方法。目前，國內外ELISA檢測的技術日益成熟，在過敏原檢測方面的研究很多。ELISA的種類有很多，應用于食品過敏原檢測的常見方法主要有雙抗體夾心法和競爭法兩類。鄧小芳[5]通過免疫BALB/c小鼠建立雙抗體夾心方法檢測到酪蛋白的最低檢出限為0.55 ng/mL，線性范圍為0.78～100 ng/mL。王碩等[6]也通過建立雙抗體夾心ELISA定量檢測牛乳中酪蛋白方法，以免疫BALB/c小鼠制備的抗酪蛋白單克隆抗體包被，HRP標記抗酪蛋白的多抗，標準曲線在6～1 666 ng/mL范圍內線性良好，R2=0.994 9，測得最低檢出限為7 ng/mL。在此基礎上，宋宏新等[7]以雞卵黃抗體為多克隆抗體包被酶標板，封閉后，加入等量酶標抗原和待測物進行競爭反應，建立的競爭ELISA最低檢出量為5.1 ?g/mL，變異系數小于5%。除此之外，也有學者采用間接ELISA來檢測。Atrick等[8]結合了十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白質印跡、免疫染色方法和間接ELISA多種方法來檢測白葡萄酒中是否存在酪蛋白物質，結果表明在不同的檢測樣品中，均可以檢測到酪蛋白的存在，其估計的檢測量在0.9 mg/L左右，甚至更低。同時，張濤等[9]通過制得的兔抗牛αs-酪蛋白的多克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為二抗，以牛αs-酪蛋白包被抗原間接ELISA檢測方法，檢測的線性范圍是25～1 200 ng/mL，相關系數是0.982 5，回收率在91.97%～115.61%之間，從而可計算出牛乳中酪蛋白的含量。近年來，市場上已有多種商品化的過敏原檢測ELISA試劑盒銷售，如Tepnel、R-Biopharm、ELISA Systems等，這些試劑盒可在短時間內實現過敏原的定性和半定量檢測。李妮等[10]通過對多種品牌的酪蛋白殘留試劑盒進行對比實驗，得出ELISA Systems試劑盒對檢測食品中的酪蛋白成分特異性高，并與其他幾種過敏食品均無交叉反應，試劑盒體現出了較高的精密度（變異系數＜5%）和準確度，定性檢測限小于1.56 mg/L，定量范圍為0.244～1.926 mg/L。

ELISA法靈敏性高、特異性強、快速、費用低，因而在過敏原檢測中得到了廣泛的應用，特別適用于食物中少量過敏原檢測，但這種方法也有其局限性，檢測的蛋白在食品加工處理過程中可能會發生變化，導致ELISA法假陰性的出現。故對于ELISA法，學者需要進一步的考慮食品加工處理過程中過敏原性質的變化，克服其對檢測結果產生的不良影響。

2.1.2 免疫熒光法

免疫熒光技術是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，結合物在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光，根據熒光的強弱，來進行定量分析的方法。這種方法的特異性強、靈敏度高、速度快，主要缺點是非特異性染色問題會導致結果判定的客觀性不足，且技術程序比較復雜。應用熒光標記的方法，Young等[11]從小鼠腺體內提取酪蛋白進行檢測，通過標記免疫熒光素來檢測標記的抗體來檢測酪蛋白，結果表明熒光標記的方法特異性很強，對今后酪蛋白檢測方法的發展具有一定的參考價值。

2.1.3 火箭電泳免疫技術（roket immunoele-ctrophoresis，RIE）

以半固態透明的瓊脂凝膠為支持介質，使置于孔中的抗原和抗體相向擴散，兩者相遇后，在濃度比例適當處結合成復合物形成沉淀峰，根據形成的峰行高度來判斷抗原量的多少。Moen等[12]將RIE和ELISA兩種方法進行了比較，選取了市場上的13種樣品，分別用ELISA試劑盒和RIE進行檢測，前者只能檢測到酪蛋白在3種產品中的含量，而后者卻檢測到了每種產品中的酪蛋白含量，對比說明RIE的檢測靈敏度比ELISA高，能檢測到含量低的過敏原產品，從而提高了食品的準確性和擴大其應用范圍。

在實際操作中，RIE制膠和染色過程操作過程復雜，穩定性不好，故需要進一步提高其準確性。

2.1.4 時間分辨熒光免疫分析（time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA）

TRFIA是一種非同位素免疫分析技術，用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數，進行信號分辨，由于鑭系元素發射熒光效應時間長，可通過延遲檢測時間而將標本或環境中的非特異熒光扣除，極大地提高了分析靈敏度。Sletten等[13]用TRFIA、Indirect TRFI、ELISA 3種不同的方法去檢測不同食品中的酪蛋白的含量，對比發現三者都能在1～1.5 mg/kg范圍內做定量的檢測，其中，TRFIA和i-TRFIA（60～68 ng/mL）的檢測結果相近，敏感度和特異性比ELISA（30～38 ng/mL）低，為進一步找到與ELISA互補的方法提供了借鑒。

應用此方法具有檢測范圍寬、對標記物分子生物活性影響小、無放射性污染、標記物保存時間長等優點，尤其是能夠同時檢測不同的食品，節省時間。

2.1.5 生物免疫傳感器（immunosensor）

生物免疫傳感器是使用光敏元件作為信息轉換器，將生物識別分子固化在傳感器，通過與光學器件的光的相互作用，產生變化的光學信號，通過檢測變化的光學信號來檢測免疫反應。這種方法具有快速靈敏、選擇性高、操作簡單、便于自動化等特點。目前應用在過敏原檢測的免疫傳感器有光纖表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）、電化學免疫傳感器等。

SPR技術是指當樣品與芯片表 面的生物分子識別膜相互作用時，會引起金膜表面折射率的變化，導致SPR角度的變化，通過檢測SPR角的變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數和特異性等信息。SPR傳感器是將SPR技術與免疫傳感器結合，通過獲取抗原抗體反應過程中SPR角的動態變化，得到生物分子之間相互作用的特異性信號，來檢測各種蛋白質抗原的方法。Hiep等[14]將標記了酪蛋白抗體的膠體金顆粒固化在表面等離子體共振傳感器上，通過優化反應條件，在最適條件下檢測到的酪蛋白最低質量濃度為10 ng/mL。應用新型傳感器檢測時，不需要對樣品進行復雜繁瑣的前處理，節省大量的時間，并且便于攜帶，敏感度高。應用不同的設備，研究者研制了基于不同材料的傳感器。Cao等[15]通過電聚化改造電極，形成了具有聚精氨酸復合薄膜的新型電極，該電極能夠吸附納米金，使其固定在電極表面，將其置于抗酪蛋白溶液中，抗體就能固化在這種新型電極上。上述方法構造的傳感器，在最適的條件下，其檢測限在1×10-7～1×10-5g/mL范圍內，R2=0.993，最低檢測值為5×10-8g/mL，這種方法已經成功的應用到奶酪中的酪蛋白的檢測中。近年來，國內一些研究者也開始了這一方面的研究，研究人員正在開發新型的耦合材料石墨烯等，將會進一步的改進傳感器的性能，提高檢測準確性。

2.1.6 免疫膠體金標記技術（lateral flow assay，LFA）

LFA作為一種以膠體金為標記物，再利用抗原抗體的特異性反應以達到檢測目的的一種新型免疫標記技術，已得到了廣泛的應用，如致病菌[16]、瘦肉精[17]、黃曲霉毒素[18]的檢測等。這種層析試紙條具有快速、方便、準確、操作簡單等優勢，具有廣闊的應用前景。在此原理基礎上，Tepnel、R-Biopharm、ELISA Systems等生物公司已經推出相應的產品，而在國內，有關過敏原的研究起步較晚，相關的研究和產品還很少[19]，需要學者做進一步的研究。

2.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術

PCR操作類似于DNA的天然復制過程，由于DNA分子在加工過程中性質穩定，可對特定過敏原的基因片段進行擴增，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。目前PCR檢測已成為一種可靠、準確的檢測過敏原的方法，廣泛地應用到了花生[20]、芝麻[21]、堅果類[22]等過敏原的檢測。PCR檢測方法可以克服蛋白含量低而被食品基質掩蓋的缺點，同時DNA的特異性也較高，但易受食品基質的影響，而檢測不出過敏原，且操作過程復雜，設備昂貴，容易產生 假陽性的結果。Schulmeister等[23]已從牛乳腺中分離出編碼酪蛋白的基因，將其在合適的條件下進行重組，將重組后的基因植入大腸桿菌體內進行表達，結果顯示表達的基因能夠引起過敏反應，這為以后過敏原引物的設計和應用PCR技術進行檢測做好了鋪墊。目前，此方法應用在牛乳過敏檢測上的文章還尚未見報道，但它將是檢測過敏物質的一個具有前瞻性的發展方向。

2.3 毛細管電泳技術

毛細管電泳技術是以毛細管為分離通道，高壓直流電場為驅動力，根據樣品的多種特性（電荷、大小、等電點、極性、親和行為、相分配特性等）的不同，實現液相微分離分析技術。毛細管電泳的技術有很多，國內外學者已經建立了基于毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速聚焦電泳方法的研究。張東送等[24]運用毛細管電泳技術對牛乳中的蛋白組分進行了快速分析，并根據不同牛乳的毛細管區帶電泳圖譜，利用32Karat Software軟件計算出牛乳中酪蛋白的含量，該方法具有快速、高效、用樣少、經濟等特點。但由于毛細管電泳設備昂貴，操作人員需要一定的訓練，制約了此項技術普及。王麗娜等[25]用毛細管電泳技術來分離南方水牛奶酪蛋白，并對其成分進行定量分析，實驗測得α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白在0.5～5.0 g/L范圍內，具有良好的線性關系，相關系數均不低于0.998 0，且加標回收率為98%～106%。Mayer等[26]將等電點聚集電泳技術與HPLC方法聯合使用來檢測奶酪中酪蛋白的含量，以此來判斷是否適應于生產奶酪，實驗根據不同乳制品中酪蛋白含量的不同，對比不同的校正曲線來判斷乳制品中是否摻假了羊乳的酪蛋白。應用這種方法可以測定到酪蛋白的含量，可適用于過敏物質的檢測。

2.4 儀器分析

儀器分析是指采用比較復雜或特殊的儀器設備，通過測量物質的某些物理或物理化學性質的參數及其變化來獲取物質的化學組成、成分含量及化學結構等信息的一類方法，主要包括色譜法和質譜法等。在實際應用中，往往將兩者結合來為提高準確性，具有靈敏度高，準確性好，檢出限低，專一性強等優點。但是其儀器設備較復雜，需要專門的培訓人才，且價格昂貴，不便于普通操作。

2.4.1 色譜法

色譜法是一種分離分析法，利用混合物中各組分在不同的兩相中溶解、解析、吸附、脫附或其他親和作用性能的差異而互相分離的現象，對此現象進行分析的方法。反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是將不同的有機官能團通過化學反應共價鍵結合到硅膠載體表面的游離基上，而生成不同極性的化學鍵合固定相，使其選擇性得到提高?；诜蛛x的基礎上，Wang Juan等[27]通過特定的分析柱對樣品進行分離，在波長240 nm、45℃條件下，定量檢測到牛乳中的6種蛋白質，包括酪蛋白、乳清蛋白等，檢測的峰值在74.8%～132.5%范圍內波動，應用此種方法具有很好的準確性，可操作性和重復性。王浩等[28]通過此種方法對牛奶及其乳制品進行了定量分析，分離出7種主要蛋白成分（包括酪蛋白），各組分分離度均大于1，達到基線分離，回收率達88.9%～97.1%，相對標準偏差為0.8%～5.1%，具有準確、靈敏、快速等特點，可用于牛奶及其乳制品的質量控制盒定量檢測。色譜檢測法的重現性好，具有良好的選擇性，并可用于梯度洗脫操作。

2.4.2 質譜法

質譜法是用電場和磁場將運動的離子按它們的質荷比分離后進行檢測的方法，測出的離子準確質量即可確定離子的化合物組成。質譜法的檢測需要對樣品進行前處理，提高其純度，所以，在實際應用中，質譜法多與色譜儀等聯用，來提高其準確性。目前，在檢測生物蛋白大分子方面，基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀（matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-MS）具有很大的應用前景。MALDI-MS是指用一定強度的激光照射樣品和基質，使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，依據樣品的質荷比（m/z）的不同來進行檢測，并測得樣品分子的分子質量。此方法具有靈敏度高、準確度高、分辨率高、圖譜簡明、質量范圍廣及速度快等特點，在操作上制樣簡便、可微量化、大規模、并行化和高度自動化處理待檢生物樣品，而且在測定生物大分子和合成高聚物應用方面有特殊的優越性。Mamone等[29]通過建立的方法鑒定酪蛋白成分，并分析得到酪蛋白多肽的多糖的排列順序。向明霞等[30]通過利用雙向電泳和MALDI-MS聯用技術對水牛乳酪蛋白與其他乳源蛋白的差異性進行了研究。根據Image Master 2D Platinum圖像分析軟件對不同乳源酪蛋白的雙向電泳（2-DE）圖譜進行蛋白斑點的匹配分析，獲得21個水牛乳中主要分布在低豐度蛋白區的差異蛋白點，經質譜分析，得到4個屬于水牛乳酪蛋白的主要組分，另外發現兩個與水牛乳中的蛋白有較高同源性的新組分。在實際應用中，這兩種方法通常共同來檢測食品中的物質。Heick等[31]從食品基質中提取到的蛋白，在胰蛋白酶的水解下，經過LC-MS儀器進行分析，同時檢測包括牛乳在內的7種過敏原，檢測的濃度范圍從10 ?g/g到1 000 ?g/g，被證實是一種可以的用于進行定量檢測的方法。

3 結 語

近年來，隨著人們的生活水平日漸提高，以及牛乳制品的廣泛普及，其引起的過敏問題得到了人們的廣泛關注。牛乳蛋白作為一種常用的食品添加劑，在食品加工中會有部分殘留，給過敏人群帶來潛在的致敏危害，故需要找到一種快速準確的檢測方法。

目前，在應用免疫學方法檢測方面，抗體的質量與反應模式是影響檢測結果的關鍵因素。應用此種方法時，需要獲得高質量的抗體，選取合適的反應模式和有效的提取過敏原方法。而作為具有高靈敏性和低檢測值的PCR技術，因其在食品中獲得相關的基因片段有一定的難度，再加上需要更加昂貴的設備和專業人才，在應用方面受到一定的約束。同樣，毛細管電泳技術雖然具有高效，需要少量的樣品和緩沖液等特點，但在定量分析的精確性方面需要進一步的改善。為彌補以上檢測值低，易受食品基質影響的不足，學者采用了精密的儀器分析方法，能夠精確檢測過敏物質的含量，在獲得純度足夠高的樣品時，會有更好的檢測效果。但由于設備昂貴和操作復雜，不適用于快速檢測中。新技術的開發應用促使過敏原的檢測向高靈敏度、簡便快速、準確性高方向發展，為我國食物過敏原的快速檢測和食物過敏原標簽標示制度的實施提供重要的技術支撐，以便早日開發出具有自主知識產權的產品。

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Research Progress in Methods for Detecting Cow’s Milk Allergen Casein

NI Xiao-qin, LAI Wei-hua*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Cow’s milk is rich in proteins, and an ideal nutritional substance, but it is also a common allergen in foods. Casein is the highest content of protein in milk, and is often used as a major index for detecting the allergenicity of cow’s milk. The currently available detection methods include mainly immunological techniques, polymerase chain reaction (PCR), capillary electrophoresis, chromatography, and mass spectrometry. This article reviews the principles, characteristics and applications of these detection methods, and proposes future trends in the development of new detection methods.

casein; allergen; detection methods

TS207.3

A

1002-6630（2014）03-0290-05

10.7506/spkx1002-6630-201403057

2012-12-07

倪小琴（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品質量安全。E-mail：xychun555@163.com

*通信作者：賴衛華（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：talktolaiwh@163.com