雙酚A對斑馬魚精巢性激素生成酶基因表達的影響

云丹，劉曉麗，程樂華，周忠良

華東師范大學生命科學學院，上海200241

4－二羥基二苯基丙烷，簡稱雙酚 A(bisphenol A，BPA)，系苯酚衍生物，廣泛用于如聚碳酸脂(polycarbonate，PC)、環氧樹脂(epoxideresin，EP)等化工產品的制造。研究發現BPA不僅通過與肝臟雌激素受體結合誘導雄魚產生卵黃蛋白原［1－2］，也干擾魚類性激素調節并影響魚類的性別分化［3－4］，是典型的擬雌激素化學物。BPA對精巢發育的影響也有大量的報道，BPA能導致精子數量減少、活力降低、畸形率增加而損害雄性生殖功能［5－6］，損傷生精細胞、支持細胞和間質細胞的結構和功能，干擾和阻礙精子的發育和成熟及對精子有直接毒性［7］。然而，BPA對精巢發育影響的檢測仍停留在組織病理層面，且關于BPA調節精巢發育的分子機制以及精巢結構與分子機制相結合的研究不多，BPA對精巢結構影響的機理還不是很清楚。

魚類與所有其他脊椎動物一樣，其性腺發育過程受性激素的調節和控制。在性激素的合成途徑中，細胞色素 P450酶起著重要的作用。其中，CYP17基因參與精巢中膽固醇轉化為睪酮的過程［8］;CYP11B基因能催化雄魚精巢中的睪酮轉化為11－KT;CYP19A基因編碼的細胞色素P450芳香化酶(CYP19A)控制雄激素轉換為雌激素的過程。性腺的活動是受下丘腦和垂體分泌激素的控制，下丘腦釋放的促性腺激素釋放激素(GnRHs)，作用于垂體上的受體，從而控制促性腺激素的合成和釋放，包括黃體化激素(luteinizing hormone，LH)和促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)［9］。在雄性動物中，FSH可以通過促卵泡激素受體(FSHR)的介導來刺激精子的發生并促進雄激素的合成［10－13］。研究發現，環境擬雌激素化學物壬基酚(NP)可影響斑馬魚精巢性激素合成酶基因的表達。BPA也是擬雌激素化學物，但分子結構區別于NP。BPA對精巢發育的作用途徑至今不很清楚。本文以模式動物斑馬魚(Danio rerio)為實驗對象，通過不同濃度BPA暴露以及同一濃度不同暴露時間的動力學實驗，以成魚精巢性激素合成酶基因(相關P450酶基因)及雌雄激素受體基因、促卵泡激素受體基因為靶點，結合精巢組織病理學特征，研究BPA對性激素合成酶基因表達的影響，并深入研究環境內分泌干擾物對精子發育和精巢結構影響的作用途徑。

1 材料與方法(Materials and Methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:電動勻漿器(Fluko公司)，PCR儀和CEX96TMReal－Time PCR 儀(Bio－Rad)，UV－VIS7500紫外分光光度計(天美公司)，熒光顯微鏡(Leica，DM4000B)。

試劑:雙酚 A(純度 ＞99%，Fluka)，RNAiso Plus試劑(TaKaRa)，Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)。

1.2 實驗材料

實驗魚:斑馬魚(Danio rerio)，體長(2.83±0.16)cm，體重(0.40±0.05)g，為性成熟雄性個體，購于上海銀河熱帶魚養殖場，在實驗室馴養兩周后進行暴露實驗，馴養魚用水為曝氣除氯后的自來水。

1.3 實驗設計

濃度－效應實驗:設置4個BPA試驗濃度組，分別為500、1 000、2 000 和4 000 μg·L－1;每個濃度組設兩平行，丙酮作為溶劑，試劑對照組丙酮濃度為10 μL·L－1;暴露試驗在5 L的玻璃缸中進行，放試液3 L，隨機放入試驗魚8尾;試驗期間每天喂食3次，換1/3試液，持續增氧，水體溫度控制在(28±1)℃，光照周期為14 h:10 h(光暗比)，暴露期為21 d。取樣時將斑馬魚置于冰面上，凍僵后取精巢，過液氮，－80℃冰箱保存待用;精巢組織學研究以Bouin液固定。

時間－效應實驗:在濃度－效應實驗的基礎上，選取 BPA2000 μg·L－1濃度組進行時間－效應實驗，暴露期間的實驗方法與濃度－效應實驗相同。分別在暴露后第6天、12天、18天、21天進行取樣，樣本處理同濃度－效應實驗。

1.4 實驗步驟

1.4.1 斑馬魚精巢中相關基因Real－time PCR測定

取50 mg精巢組織加入1 mL RNAiso Plus提取出總RNA，分光光度儀測出RNA濃度(A260/A280在1.8～2.0范圍內)，UVP凝膠圖像分析儀上觀察RNA完整性及有無降解情況。之后用Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA:根據每20 μL反應體系可最大使用1000 ng RNA，計算出加入RNA的體積，加入5×Prime Script RT Master Mix 4 μL，再加入 RNase Free H2O補足至20 μL，混勻后，放入PCR儀，37℃保持15 min，85℃作用5 s。從Genebank獲得斑馬魚ERβ、FSHR mRNA序列，應用Primer 5.0軟件設計分析得到特異性引物(上海英濰捷基貿易有限公司合成)，其他引物引用自文獻，具體見表1。Real－time PCR反應體系包括SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μL，正向引物和反向引物各 0.5 μL(10 μmol·L－1)，樣品 cDNA模板 1 μL，加入 RNase Free H2O 補足至 25 μL。擴增條件為:95℃預變性30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，40次循環;65℃ 5 s至95℃，在最后1個循環結束后做溶解曲線驗證引物特異性。實驗數據用2－ΔΔCt方法分析，以β－actin為內標基因，空白對照組為參照因子進行計算。

1.4.2 精巢組織石蠟切片

精巢組織學研究采用常規石蠟切片:樣品用Bouin氏液固定24 h，各級乙醇沖洗，脫水，經二甲苯透明，浸蠟包埋(溫度不超過58℃)，制成5 μm切片，展片，用2%的明膠涂抹的載玻片撈片，30℃恒溫箱烤片過夜，脫蠟復水，H.E.染色，脫水，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察并拍照。

表1 引物的序列、序列號和來源Table 1 Sequence of the primers，accession number of primers and references of the primers

1.4.3 數據統計分析

數據采用SPSS16.0軟件進行統計分析。用單因素ANOVA法分析暴露引起的差異，若差異顯著則用Tukey法比較不同暴露組之間的差異(p＜0.05時即被認為差異顯著)，實驗數據采用平均值±標準差表示。

2 結果(Results)

2.1 PA暴露對成年斑馬魚精巢CYP17、CYP11B和CYP19A基因表達的影響

圖1所示的是不同濃度BPA暴露21d后斑馬魚精巢性類固醇合成相關細胞色素P450酶類的基因表達量。從圖1a中可以看出，CYP17 mRNA的表達量與BPA的濃度存在一定的負相關性，隨著BPA濃度的增加，CYP17mRNA的表達量下降，分別為對照組的(0.84±0.25)、(0.40±0.15)、(0.32±0.16)和(0.01±0.01)倍。與對照相比，BPA濃度大于1 000 μg·L－1的各實驗組，差異顯著(p ＜0.01)。CYP11B mRNA 的表達量，除 4 000 μg·L－1外，其余各實驗組雖有變化，但與對照組無顯著性差異(圖1b)。4 000 μg·L－1組的 CYP11B mRNA 的平均表達量為對照組的(5.50±2.19)倍，可能是組內個體差異較大，統計處理未能顯示差異。BPA可誘導CYP19AmRNA的表達量上調，其中BPA濃度為2 000 μg·L－1時 CYP19AmRNA 的表達量最高，為對照組的(2.68 ±0.72)倍(p ＜0.05)，在 4 000 μg·L－1有所下降，但仍高于對照(圖1c)。

圖2 所示為暴露在 BPA 2 000 μg·L－1時，不同時間下斑馬魚精巢性類固醇合成相關細胞色素P450酶類的表達量。從圖2a可以看到，在BPA作用下，CYP17 mRNA的表達是有波動的，在6 d時最低，為對照組的(0.11±0.01)倍，12 d時平均表達量有所回升，但始終低于對照組(p＜0.01)。CYP11B mRNA的平均表達量則有一個先降后上升的調節過程。12 d時顯著下調，為對照組的(0.54±0.05)倍(p＜0.01);18 d時回升到對照水平;21 d時略高于對照，差異均不顯著(圖 2b)。BPA 2 000 μg·L－1誘導精巢CYP19A mRNA的表達有時間效應，暴露18 d的樣本中，部分個體出現上調，21 d時，大部分個體上調顯著，平均值為對照組的(2.77±0.50)倍，差異顯著(p＜0.01)。

圖1 BPA暴露對斑馬魚精巢性激素合成相關酶基因表達的影響(a.CYP17 mRNA的表達，b.CYP11B mRNA的表達，c.CYP19A mRNA的表達，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)Fig.1 Effects of BPA on the expression of steroidogenic genes in testis of zebrafish(a.expression of CYP17 mRNA，b.expression of CYP11B mRNA，c.expression of CYP19A mRNA，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)

圖2 不同暴露時間下BPA對斑馬魚精巢性激素合成相關酶基因表達的影響(a.CYP17 mRNA的表達，b.CYP11B mRNA的表達，c.CYP19A mRNA的表達，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)Fig.2 Effects of BPA on the expression of steroidogenic genes in testis of zebrafish under different exposure times(a.expression of CYP17 mRNA，b.expression of CYP11B mRNA，c.expression of CYP19A mRNA，*p＜0.05，＊＊p＜0.01，n=6)

2.2 BPA暴露對成年斑馬魚精巢性激素受體及促卵泡激素受體基因表達的影響

圖3顯示了暴露于不同濃度BPA21 d后斑馬魚精巢內雌激素受體(ERα和ERβ)、雄激素受體(AR)和促卵泡激素受體(FSHR)mRNA的相對表達量。從圖中可看到，BPA 濃度大于 2 000 μg·L－1時，精巢ERα的表達量明顯上調，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)，對ERβ也有影響，但上調的量少于ERα(圖 3a，b)。BPA 濃度大于 1 000 μg·L－1個試驗組樣品，精巢AR mRNA的表達略有上調(圖3c)，但與對照組差異不顯著。BPA對精巢FSHR mRNA表達影響的濃度－效應曲線呈倒“U”字型(圖3d)。500 μg·L－1組FSHR mRNA表達量顯著大于對照(p＜0.05);1 000 μg·L－1組最高，為對照組的(6.31 ±1.13)倍;而 2 000 μg·L－1組的表達量雖明顯大于對照，但低于 1 000 μg·L－1組。濃度 4 000 μg·L－1組中部分個體的表達量低于對照，其平均表達量與對照無差異。

圖4 所示為暴露在 BPA2 000 μg·L－1時，不同時間下斑馬魚精巢內的ERα mRNA、ERβ mRNA、AR mRNA和FSHR mRNA的表達量。如圖4a、4b，BPA的暴露時間對ERα mRNA和ERβ mRNA的表達產生了明顯的累積效應，隨著暴露時間的增加，ERα mRNA和ERβ mRNA的表達量逐漸升高，在18 d時分別為對照組的(1.98±0.87)、(1.32±0.27)倍(p＜0.05)，在21d時分別為(4.36±2.12)倍(p＜0.05)和(2.02±0.47)倍(p＜0.01)。從圖4c可以看出，AR mRNA的表達量與對照組沒有差異性.圖4 d顯示，FSHR mRNA的表達量隨著暴露時間的延長而增加，在暴露21 d時，與對照組差異顯著，為對照組的(2.8±0.81)倍(p＜0.05)。

2.3 BPA暴露對成年斑馬魚精巢組織結構的影響

圖5a所示為正常精巢生精小管的結構，在組織切片中可以看到精子(Sp)均勻的分布于管腔中央，緊貼同一生精小管管壁排列緊密的是多個精小囊，每個精小囊中內有處于精原細胞(Sg)、初級精母細胞(PS)、次級精母細胞(SS)、精細胞(St)等不同發育時期的生殖細胞。圖5b、5c所示為暴露于BPA引起的斑馬魚精巢組織學變化。圖5b顯示，暴露于2 000 μg·L－1BPA 引起斑馬魚精巢生精小管內非細胞區域增加，精子濃縮嚴重，精原細胞(Sg)和精母細胞(PS 和 SS)數目都有所減少;BPA 4 000 μg·L－1組斑馬魚精巢退化(圖5c)，精小囊破裂，各個時期的細胞散亂分布在精小管中。

圖3 BPA暴露對斑馬魚精巢性激素受體基因表達的影響(a.ERα mRNA的表達，b.ER mRNA的表達，c.AR mRNA的表達*p＜0.05，n=6)Fig.3 Effects of BPA on the expression of AR mRNA and ERα mRNA in testis of zebrafish(a.expression of ERα mRNA，b.expression of ERβ mRNA，c.expression of AR mRNA*p＜0.05，n=6)

圖4 不同暴露時間下BPA對斑馬魚精巢性激素受體基因表達的影響(a.ERα mRNA的表達，b.ERβ mRNA的表達，c.AR mRNA的表達*p＜0.05，n=6)Fig.4 Effects of BPA on the expression of AR mRNA and ERα mRNA in testis of zebrafish under different exposure times(a.expression of ERα mRNA，b.expression of ERβ mRNA，c.expression of AR mRNA*p＜0.05，n=6)

圖5 暴露于BPA對斑馬魚精巢結構的影響(a. 對照;b.2 000 μg·L-1;c.4 000 μg·L-1;Sg 精原細胞;PS 初級精母細胞;SS次級精母細胞;St精細胞;Sp精子;SC支持細胞;LC間質細胞;ST生精小管;標尺=10μm)Fig.5 The effects of BPA on the testis of zebrafish(a.Control;b.2 000 μg·L－1;c.4 000 μg·L－1;Sg Spermatogonium;PS Primary Spermatocyte;SS Secondary Spermatocyte;St Spermatids;Sp Spermatozoa;SC Sertoli Cells;LC Leydig Cells;ST Seminiferous Tubules;Scale bar=10μm)

3 討論(Discussion)

魚類性腺發育受到下丘腦－垂體－性腺(HPG)信息通路的調節和控制，激素及其受體在信息傳遞中起重要作用，也成為環境內分泌干擾物(EDCs)作用的主要靶點［17］。細胞色素P450系列酶參與了類固醇激素的合成過程。其中，由CYP17基因編碼的細胞色素 P450 17α－羥化酶(17α－hydroxylase)、17，20－裂解酶(17，20－lyase)能參與精巢中膽固醇轉化為睪酮的過程，控制著精巢中性激素合成的總量［8］;CYP11B基因編碼的P45011β－羥化酶(P45011β)能催化雄魚精巢中的睪酮轉化為11－酮基睪酮(11－KT);P450芳香化酶(P450arom)是調控脊椎動物體內雌激素形成的關鍵酶，魚類CYP19A基因編碼性腺中的P450arom，主要分布于卵巢［18］，在精巢間質細胞中有少量表達，調控原始精原細胞的增殖［13］。

小鼠研究表明，E2可干擾精巢CYP17 mRNA的表達，抑制睪酮的合成［19］。在魚類中也存在類似結果，暴露于 E2和 EE2可導致雄性黑頭呆魚(Pimephalespromelas)CYP17mRNA表達下調［20－21］，暴露于 250 μg·L－1壬基酚(NP)的斑馬魚精巢CYP17 mRNA表達顯著下調［14］。本研究結果顯示，暴露于 1 000 μg·L－1BPA 也可使斑馬魚精巢CYP17 mRNA表達顯著下調，且具有顯著的劑量－效應關系?？梢酝茢?，BPA抑制斑馬魚精巢CYP17基因表達是一種擬雌激素效應。BPA對斑馬魚精巢的擬雌激素效應還體現在對編碼雌激素受體ER基因，ERα mRNA和ERβ mRNA表達的誘導。本研究結果顯示，BPA 濃度為 2 000 μg·L－1時，斑馬魚精巢ERα mRNA和ERβ mRNA的表達量顯著上調，且存在著明顯的時間累積效應。這種現象與 E2［22］及NP［14］暴露結果是相似的。

11－KT是魚類以及其他脊椎動物維持雄性功能的關鍵激素，調節精原細胞的減數分裂［23－24］，以及精子形成等關鍵步驟［13］。自然條件下隨著精巢的發育、精子的形成直到排精，血漿11－KT的含量逐步升高［23，25］。有報道稱，青鳉(Oryzias latipes)、斑馬魚精巢中CYP11B mRNA表達可被外源擬雌激素化合物戊基酚(PP)、NP 抑制［14，26］，并呈現濃度－效應關系。本實驗結果顯示，BPA暴露21 d時，斑馬魚精巢CYP11B mRNA的表達不僅沒有被抑制，而最高濃度組(4 000 μg·L－1)的表達顯著上調(圖 1b);時間效應結果顯示，暴露在 BPA 2 000 μg·L－1，斑馬魚精巢CYP11B mRNA呈現先抑后升的變化，在12d時該基因表達顯著下調，隨后逐步回升，21 d時則高于對照(圖2b)。由此可見，雖然 NP、PP和BPA都是公認的環境擬雌激素化合物，但是在對魚類精巢的作用可能存在不同的途徑。BPA不直接干擾睪酮轉化成11－KT的過程。

外源內分泌干擾物對魚類CYP19A影響的研究多集中于卵巢，對精巢CYP19A影響報道較少。劉曉麗等［14］報告NP對斑馬魚精巢中CYP19A mRNA影響，125 μg·L－1NP 可使其表達上調。Hatef等［2］報告BPA暴露可使金魚(Carassius auratus)精巢雄激素受體以及芳香化酶基因轉錄增加，并支持BPA通過抗雄激素和雌激素雙重途徑導致金魚精子數量減少的觀點。本實驗中結果支持這個觀點。2 000 μg·L－1BPA 暴露 18 d 時斑馬魚精巢 CYP19A及ER基因表達明顯增加(圖 2c、4a、4b)，此外，雖然BPA沒有改變 ARmRNA的表達(圖3c)，但是CYP17 mRNA表達顯著抑制。因此，可以認為BPA對斑馬魚精巢發育的影響存在雌激素和抗雄激素雙重效應，不僅直接作用于雌激素受體，也可能通過提高CYP19A基因表達促進內源雌激素的合成，增強雌激素效應。

下丘腦－垂體－性腺軸的控制不是單向的，腦垂體通過分泌LH和FSH作用于性腺，而性腺類固醇激素的變化對下丘腦也有反饋作用。實驗結果顯示，BPA暴露6 d斑馬魚精巢CYP17 mRNA表達受到明顯抑制，其下游基因CYP11B的抑制發生在暴露后的12 d左右，其后逐漸回升，精巢中FSHR mRNA的表達量增加發生在暴露后的18 d左右(圖4d)。Baudiffier等［27］在研究抗真菌藥物克霉唑對斑馬魚精巢類固醇合成影響時，發現斑馬魚垂體的FSH與精巢的FSHR基因表達都隨之發生上調，認為克霉唑導致的精巢11－KT合成減少激活了FSH/FSHR通路，引起腦垂體對精巢雄性激素合成的補償調節作用。BPA暴露是否也引發類似的補償機制還有待于進一步研究。

Lahnsteiner等［28］認為，高劑量的E2可使成熟雄魚精液量下降，精子密度增加，并有可能導致不育。Hatef等［2］認為BPA的干擾效應使金魚精子數量減少。本實驗結果顯示，BPA暴露對斑馬魚成魚精巢組織有傷害。2 000 μg·L－1濃度組斑馬魚精巢組織中精液減少，精子濃縮，生精小管內非細胞區域增加。類似的現象在NP暴露試驗中也有報道［14］。

綜上所述，BPA對斑馬魚精巢發育的內分泌干擾效應是雙重的。通過誘導ER和CYP19A基因表達以增加雌激素作用;抑制CYP17基因表達以干擾雄激素的生成。性激素的紊亂最終可導致斑馬魚精巢發生組織傷害。性腺雄激素合成的減少有可能啟動下丘腦－垂體－性腺(HPG)軸的負反饋調節，其作用機制還有待進一步研究。通訊作者簡介:周忠良(1957—)，男，副教授，碩士生導師，主要從事魚類學和生態毒理學研究。

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