鈾酰與多肽和蛋白質相互作用研究進展

劉洋，肖成梁，梅雷，屈國普，石偉群，*

1.南華大學核科學技術學院，湖南衡陽421001;2.中國科學院高能物理研究所，核輻射與核能技術重點實驗室，北京100049

鈾酰與多肽和蛋白質相互作用研究進展

劉洋1，2，肖成梁2，梅雷2，屈國普1，*，石偉群2，*

1.南華大學核科學技術學院，湖南衡陽421001;2.中國科學院高能物理研究所，核輻射與核能技術重點實驗室，北京100049

隨著核能事業的快速發展，人們越來越關注錒系核素對生態環境和生物體所造成的影響，其中錒系元素的生物毒理行為正成為核能基礎研究熱點之一。錒系陽離子與生物分子特別是多肽和蛋白質的相互作用研究對于理解其在生物體內轉運、吸收和沉積等基本毒理學問題至關重要。鈾作為核燃料循環中主要的錒系元素，其毒理學問題更具研究意義。本文綜述了鈾酰離子(UO22+)在分子水平上與氨基酸、多肽和蛋白質之間相互作用機理的研究進展。分析了所形成配合物的配位模式、分子結構以及熱力學數據等;評價了血漿蛋白對鈾在人體內轉運、吸收和沉積所起的作用;討論了能特異性識別UO22+的多肽和蛋白質的設計原理，對本領域今后的發展動向也進行了展望。

鈾酰;氨基酸;多肽;蛋白質;相互作用;分子水平

隨著核能事業的快速發展、核電產業的迅速增長，對鈾的需求量也不斷加大。在鈾礦開采、核燃料制造、乏燃料后處理和核廢物處理與處置等核燃料循環的環節中，放射性核素均有可能在工業活動和地質運動中通過遷移、擴散、轉移和轉化等途徑進入到環境中，從而直接或間接對人居環境和生物體造成嚴重影響。

對生物體而言，鈾不僅具有與放射性比活度相關的放射毒性，且具有重金屬的化學毒性。毒理學研究表明:盡管所有鈾的同位素及其衰變子體均具有放射性，會對人體器官造成內照射損傷，但鈾中毒通常不是放射學效應引起的，而是來自于體內的生物化學相互作用［1］。因此人們普遍認為內污染導致損傷主要是源于鈾的化學毒性。鈾的化學毒性與其在進入人體途徑、價態、體內化合物的形式有密切關系［2］。通常，鈾元素進入人體的暴露途徑主要有吸入、食入和傷口滲入等。大多數四價鈾化合物都不溶于水，水溶液中大多以六價的鈾酰(UO22+)形式存在，因此體液中鈾主要以UO22+形式存在。在人體血液中鈾主要以鈾酰鹽或者鈾酰－蛋白質復合物的形式存在［3］，并通過血液循環迅速分布到各組織器官中，如腎臟、骨骼、肝臟和脾臟等。

盡管關于鈾與生物體相互作用的研究工作已有大量的文獻報道，但是大部分側重于研究鈾在生物體內不同組織中的分布與沉積情況［4－5］，以及其毒理效應［6］、促排劑［7］等。人們對UO22+生理毒性的分子機制尚未明確了解。蛋白質是UO22+在生物體內的主要結合分子，但是在分子水平上關于UO22+與多肽及蛋白質相互作用的機理同樣還不明確，定量研究UO22+與多肽及蛋白質結合性能的結果還很少。因此，在分子水平上從結構特征及熱力學穩定性等因素定量研究鈾與氨基酸、多肽和蛋白質的相互作用機理，對于理解鈾在生物體內的轉運、吸收和沉積的分子機制等基本毒理問題至關重要。同時，該方向的研究將對設計高效低毒的錒系元素陽離子促排藥物及研發能特異性結合UO22+的分子并用于鈾生物監測和修復亦具有重要的現實意義。

1 UO2+2與多肽相互作用研究

1.1 氨基酸

氨基酸作為構成蛋白質的基本單位，能賦予多肽及蛋白質特定的分子結構形態，使其分子具有生化活性。因此，在分子水平上研究氨基酸與鈾的相互作用將為研究多肽及蛋白質等更復雜的生物大分子提供參考依據。

從20世紀50年代開始，UO22+與氨基酸的相互作用研究便已展開，該時期的研究主要關注UO22+與氨基酸配合物的結構，即確定氨基酸是通過氨基還是羧基或者兩個基團共同參與UO22+的配位。眾所周知，氨基酸屬于兩性電解質，羧基和氨基都能與UO22+相互作用。而這些功能基團屬于Lewis和Bronsted酸堿，其配位形式與pH值相關。氨基酸的氨基和羧基的lg K值分別為9和2。電位滴定的結果顯示，在較低的pH值(2～4)下，氨基的質子化作用阻止其與UO22+的絡合，而只是通過羧基上的兩個氧原子與UO22+雙齒配位。pH較高時，氨基去質子作用使得氨基酸的氨基氮原子和羧基氧原子同時參與配位。在幾乎所有關于UO22+與氨基酸的研究中都發現羧基基團是比較活躍的UO22+結合位點。Lagrange等［8］通過電位滴定和紫外光譜以及紅外光譜證實了多種氨基酸中羧酸和氨基基團同時與UO22+配位。通過晶體學和核磁共振對甘氨酸及其—SH—衍生物與UO22+配合在結構上的研究證實了UO22+更傾向于與羧酸基團配位［9］。不同的側鏈基團也可能改變氨基酸與UO22+的配位形式。通過13C NMR結果表明，天冬氨酸(R=—CH2—COO－)的側鏈羧基上的氧原子替代氨基與UO22+配位，而半胱氨酸側鏈巰基并沒有參與配位［10］。這也印證了作為硬受體的鈾原子更傾向于與硬氧原子而不是軟硫原子配位。側鏈基團為脂肪族羥基的絲氨酸和蘇氨酸同樣也并未發現側鏈羥基與UO22+配位［11］。表1總結了文獻中已報道的各種氨基酸與UO22+配合物穩定常數值。從表1可以看出，文獻中都只考慮了四種配合物的累積穩定常數值，分別為(UO2)LH2+、(UO2)L2H22+、(UO2)L+和(UO2)L02(L為氨基酸);α－氨基酸與UO22+配合物的穩定常數幾乎都相同，根據平衡UO22++L=(UO2)L+，形成常數的加權平均值為lg K1=8.4±0.7(I= 0.1 mol/L)，其中氨基對該值的貢獻為5.8±0.5，羧基為2.6±0.2。

表1UO22+與氨基酸配合物的穩定常數值Table 1Summarized stability constants of uranyl－amino acid complexes

通過對比表1中的UO22+與氨基酸的各種配位行為，UO22+－氨基酸配合物的穩定性主要取決于以下因素:(1)羧酸和氨基基團之間的—CH2—基團的個數和最終形成螯合環尺寸的大小;(2)在氨基酸上α－碳上其它能與UO22+結合基團的數量、種類及所處位置;(3)體系中的pH值、溫度、離子強度等條件。

1.2 多肽

在眾多能與UO22+相互作用的蛋白質中，除特定的蛋白質外，大部分蛋白質與UO22+的結合都不是特異性的。蛋白質分子往往可以非選擇性地結合多個UO22+，形成配合物的穩定性各不相同;而且蛋白質通常具有復雜的四級結構，影響蛋白質與UO22+結合的因素較多，因此要分別確定其結合位點和相應的配合物結構具有相當的難度。一個簡化問題的方式就是研究蛋白質片段或模型多肽與UO22+的結合行為和機理，在此基礎上設計合成能特異性識別UO22+的多肽。

(1)蛋白質片段多肽

鈣調蛋白是真核生物細胞中的胞質溶膠蛋白，每個蛋白分子內有四個鈣離子結合位點，其主要功能為根據鈣離子濃度的變化來控制細胞內重要的生化反應。Le Clainche等［35］采用草履蟲鈣調蛋白中具有EF手圖像模體的第一鈣結合位點作為模版(CaM:EQAEFKEAFAALFDKDGDGTITTKELGTVMRSL)，設計合成了含33個氨基酸的模型多肽(CaM－M1c:EQAEFKEAFAALCDKDGDGTITTKELGTCMRSL)。再將該模型多肽的兩個天冬氨酸改造為蘇氨酸獲得對UO22+具有很強結合能力并且具有選擇性的新多肽分子(CaM－M3c: EQAEFKEAFAALCTKDGTGTITTKELGTC－MRSL)。時間分辨激光誘導熒光(TRLIF)滴定實驗結果顯示單體的(CaM－M3c)(UO2)絡合物解離常數KD值達到了18 μmol/L。圓二色譜的結果表明結合UO22+后該多肽分子從無規則構象到α－螺旋構象的改變，而鈣離子和其它鑭系金屬離子都不能使其構象改變，這說明CaM－M3c對UO22+具有特異性的結合。該多肽分子在被低濃度UO22+沾污的泉水中仍然表現出對鈾酰離子很強的結合能力和選擇性，使得該分子有望應用于專門測定低濃度鈾污染的生物探針和傳感器。磷酸化(phosphorylation)或磷酸化作用，是指在蛋白質或其他類型分子上，加入一個磷酸基團，也可定義成“將一個磷酸基團導入一個有機分子”，此作用在生物化學中占有重要地位。蛋白質磷酸化可發生在許多種類的氨基酸上，其中以絲氨酸為多，其次是蘇氨酸和酪氨酸。磷酸化多肽即指通過磷酸化作用后的側鏈基團含有磷酸基團的多肽(序列中包含絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)。通常，蛋白質中的羰基、羧基、酚羥基和磷?；峁┭踉优cUO22+配位［36］。對比UO22+配合物結構發現，酚羥基、磷?；醒踉优c鈾原子之間的鍵長最短，說明磷?；鶎O22+親和能力較強［37］。自然界中鈾酰與磷酸基團天然共存的鈣鈾云母礦石和具有三腳架結構雙磷酸鹽的Uranophiles錒系促排藥物［38］都印證了該觀點。Merroun等［39］則從鈾礦廢料堆中的球狀桿菌JG－A12中發現了磷酸化的蛋白質:卵黃高磷蛋白和S層蛋白。兩種蛋白都對UO22+表現出非常好的結合能力，而蛋白中磷酸基團直接參與UO22+的配位。因此可以預見，磷酸基團的引入將大大提高多肽結合UO22+的親合力。通過調節多肽序列，將多肽進行磷酸化修飾，能達到提高選擇性結合UO22+的目的。Pardoux等［40］選取鈣調蛋白中其中一個EF－手性結構的鈣離子結合位點，對其序列中的蘇氨酸進行磷酸化修飾，將其用于研究UO22+的生物毒性。研究結果表明，在pH=6的條件下磷酸化多肽(DKDGDGYITpAAE)與UO22+的結合能力是其對應原多肽(DKDGDGYITAAE)的5倍。在pH=7、即生理pH值條件下，UO22+與磷肽結合的解離常數達到亞納摩爾量級。通過傅立葉變換紅外光譜(FTIR)證實了在該條件下磷酸根基團與UO22+的直接相互作用。因此，在生理條件下，磷酸根基團直接決定了鈾酰與蛋白質結合能力。

(2)模型多肽

鈾主要沉積在腎臟和骨骼中，放射顯影研究發現鈾酰離子在骨骼中沉積分布情況與鈣離子比較相似，而在一些病例中發現鈾在骨骼的生長區域具有很高的濃度。骨橋蛋白是一種磷酸化的、非有序結構的蛋白，其主要功能為調控骨骼的生長。最近研究表明，鈾在體內的慢性毒性機理與鈾和體內磷酸基團的相互作用有關。骨橋蛋白可能對鈾在骨骼中的沉積起到至關重要的輔助作用。Safi等［41］選取骨橋蛋白中金屬結合位點處的磷酸化多肽片段“pSDEpSDE(H8V)”作為研究對象，結合熱力學、光譜學技術以及理論計算方法在熱力學、結構性質方面對該模型磷酸化多肽進行了研究。通過量熱滴定及時間分辨熒光技術獲得了模型磷酸化多肽H8V與鈾酰離子配合物的化學計量比和結合能力以及種態分布。紅外光譜直接證實了H8V中磷酸基團參與鈾酰離子的配位。密度泛函理論(DFT)計算結合U的L3邊擴展X光吸收精細結構譜(extended X－ray absorption fine structure，EXAFS)數據擬合分析表明，磷酸基團的一個氧原子、羧酸基團的兩個氧原子以及兩分子水與UO22+配位。對比H8V與其原型骨橋蛋白的EXAFS實驗結果發現，該模型多肽H8V和骨橋蛋白在pH=5.5的條件下與鈾酰的配位環境非常相似。兩者如此相似的可能原因在于骨橋蛋白不存在一種明確定義的三級結構，蛋白序列具有很好的柔韌性，而H8V所在區域呈現出不折疊的完全展開的構型。結合上述實驗表明該模型多肽能夠很好地模擬全長序列的骨橋蛋白。研究人員也推測該蛋白的調節作用為鈾在人體中生物礦化的主要原因。因此，更多關于全長骨橋蛋白與UO22+相互作用、以及其對鈾在骨骼中沉積所起到的作用值得研究。在生理條件下，當UO22+的濃度在微摩爾量級時，其在血清中的主要存在種態由［UO2(CO3)2］2－+CO23－=［UO2(CO3)3］4－表示。其中結合三個碳酸根的UO22+占主導地位，結合兩個碳酸根的UO22+也部分存在于體內。在生理pH和碳酸根濃度下，與UO22+具有中等絡合能力的配體都需要與第三個碳酸根離子競爭才能與UO22+形成配合物。Huang等［42］發現多肽DAHK和GGH與UO22+能夠形成［UO2(CO3)2Ln］n－2類型的鈾酰－碳酸根－多肽的三元配合物。由于這兩種多肽上的羧基基團與UO22+結合是非特異性的，其配合物UO2(CO3)2(GGH)和UO2(CO3)2(DAHK)的穩定常數并不高，分別為lg K=2.2±0.4和lg K=3.1± 0.4。該研究結果表明羧酸基團與UO22+的非特異性結合可能是UO22+在血清中輸運的一種機制。但并不能排除在血清中有其他蛋白質能與UO22+特異性結合而且配合物還具有高穩定性。鑒于錒系陽離子趨向于與酸性氨基酸配位，Jeanson等［43］還研究了四價錒系陽離子Th(Ⅳ)、Pu(Ⅳ)和Np(Ⅳ)等與模型肽Ac－Asp－Asp－Pro－Asp－Asp－NH2的相互作用。研究發現，pH在生理條件下，以上四價錒系陽離子均可以直接與多肽絡合，而不至于產生水解。該模型多肽分子為設計在生理pH條件下能防止UO22+水解并具有較高結合常數的多肽序列提供了借鑒。

上述研究表明:多肽與UO22+的配位可通過多肽序列和磷酸基團的精細調節，提高對UO22+的選擇性。多肽本身為生物分子，具有一定的生理活性，將可提高其作用效率并降低其生理毒性。因此，多肽分子是未來理想的錒系促排藥物。

1.3 蛋白質

隨著人類在基因和蛋白質研究領域的巨大進步，越來越多的研究開始關注錒系陽離子與DNA和蛋白質的相互作用機理。蛋白質是生命體系中的重要分子，它們參與調節各種新陳代謝、信號轉導和細胞周期等許多極其重要的生命過程。鑒于蛋白質可能在UO22+在體內轉運、沉積、排泄中扮演重要角色，研究UO22+與蛋白質的相互作用機理無疑具有十分重要的意義。而UO22+與氨基酸和多肽相互作用研究則為研究UO22+與分子量更大、結構更復雜的蛋白質相互作用提供基礎。

(1)血漿蛋白質

通常受污染的土壤和水源中的鈾通過吸入、食入以及皮下滲入等方式進入人體細胞外的環境組織液，組織液中的鈾通過體液交換進入血液循環。不管鈾以哪種方式進入人體，只有以UO22+形式存在的可溶性鈾才能夠進入人體的血液循環，其在血漿中的質量濃度約為1 ng/L。進入生物體內后，UO22+的化學種態對其分布、代謝和排泄起著決定性的作用，也使其在不同組織器官上的作用機理和影響效果具有顯著差異。UO22+能與很多生物小分子配體形成絡合物，從而使鈾的種態變得非常復雜，增加研究的困難。相關研究數據表明，在血漿當中UO22+主要與碳酸根(60%)和蛋白質(30%)形成絡合物，而剩下的大多被吸附在紅細胞上［44］。所以普遍認為UO22+與血漿中的一些蛋白質相結合、并通過血液循環進入到靶器官的細胞當中是一種鈾在人體中轉運比較合理的機制。因此在分子水平上UO22+與血漿中的蛋白質相互作用的研究具有重要的意義。在眾多血漿蛋白質中，具有金屬離子輸運能力的轉鐵蛋白和含量最豐富的白蛋白是研究最多的兩種蛋白。轉鐵蛋白(transferrin，Tf)，又稱運鐵蛋白，是血漿中主要的含鐵蛋白質。它是由670～700個氨基酸組成的單鏈糖基化蛋白，分子量為800 kDa左右。轉鐵蛋白最基本的生理功能為結合和運輸三價鐵離子，從而控制血液中鐵離子含量。晶體結構顯示轉鐵蛋白由兩個結構相似的臂組成，分別稱為N－臂(N－lobe)和C－臂(C－lobe)，兩臂之間由一條短肽鏈相連。每個臂都由兩個大小相近的結構域組成，兩個結構域相交處便是一個鐵結合位點。N－臂和C－臂都有一個鐵結合位點，兩個鐵結合位點的結構也非常相似。三價鐵與來自兩個酪氨酸的氧原子、一個天冬氨酸的氧原子、一個組氨酸的氮原子以及作為協同陰離子的碳酸根離子上的兩個氧原子通過配位鍵形成八面體的幾何構型［45］。每一個結構域移動位置便可使鐵結合位點處于開放狀態，鐵就會被釋放出來。轉鐵蛋白在構象上處于開放或閉合的過程也就是其吸收或釋放鐵離子的過程。結合兩個三價鐵離子的轉鐵蛋白能與轉鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)形成穩定的復合物，通過內吞化作用形成內吞小體，內吞小體中的酸性環境使得轉鐵蛋白釋放出鐵。轉鐵蛋白通過其受體介導的胞吞作用是鐵進入哺乳動物的主要途徑，如圖1所示。

圖1 TfR介導細胞內鐵的吸收［46］Fig.1TfR－mediated intracellular iron uptake［46］

除了鐵，其他的二價或三價金屬離子也能結合到轉鐵蛋白的金屬結合位點上。研究表明，錒系金屬離子钚、镎、釷和鋦都能與轉鐵蛋白相互作用，且具有較強的結合能力［46－47］。鑒于轉鐵蛋白可能在錒系陽離子進入人體組織細胞中扮演重要角色，在分子水平上研究UO22+與轉鐵蛋白之間的相互作用也非常重要。相關工作的早期研究主要關注UO22+與轉鐵蛋白配合物的穩定常數以及它們之間的化學計量數。Scapolan等［48］采用時間分辨熒光技術研究鈾酰離子與轉鐵蛋白的相互作用。熒光滴定結果表明兩者能夠形成化學計量比(U/Tf)為2∶1的絡合物，并且首次在低鈾濃度c(UO22+)=1×10－6mol/L及生理pH條件下，采用非線性回歸數學模型得到UO22+與轉鐵蛋白絡合常數為lg K=16。Ansoborlo等［49］綜合考慮金屬離子的水解常數和轉鐵蛋白中存在的兩個獨立的金屬結合位點，分別得到了C臂和N臂對UO22+的結合常數為lg K1=14.1和lg K2=12.6。Montavon等［50］則結合時間分辨熒光和紫外光譜發現在生理pH條件下轉鐵蛋白上兩個金屬結合位點對UO22+的結合能力并不相同，絡合常數分別為lg K1=12.4，lg K2=11.4。在有碳酸根存在的條件下，UO22+會與兩個或三個碳酸根形成絡合物，然后與轉鐵蛋白或其它蛋白形成鈾酰－轉鐵蛋白質－碳酸根多元絡合物。隨著研究技術的不斷發展，研究人員更加關注轉鐵蛋白的結合位點是怎樣調整構型以適應鈾酰離子的進入、結合了鈾酰離子后轉鐵蛋白結構上發生了哪些變化、蛋白質結構改變后還能不能被受體識別等問題。這些因素都將直接決定鈾酰離子能不能像三價鐵離子一樣被轉鐵蛋白運輸到人體細胞當中。Vidaud等［51］采用紫外可見光譜、紅外光譜以及微量滲析的方法發現轉鐵蛋白金屬結合位點中的兩個酪氨酸都參與了配位，與三價鐵離子不同的是組氨酸并沒有參與配位，結構模型示于圖2。通過圓二色譜和差示掃描量熱技術發現Tf－UO22+絡合物的整體結構穩定性弱于Tf－Fe3+。采用標記的方法則發現Tf－UO22+絡合物并不能被轉鐵蛋白受體所識別。其主要原因可能是Tf－UO22+絡合物并不像Tf－Fe3+絡合物一樣呈現閉合構象，而依然呈現開放式構象，從而無法進入細胞。Benavides－Garcia等［52］則采用密度泛函理論(DFT)計算的方法研究了UO22+與轉鐵蛋白的相互作用以及Tf－UO22

圖2 轉鐵蛋白N－臂結合三價鐵(A和A')和鈾酰后(B和B')的結構模型［51］Fig.2Structural model of metal binding in Tf，Fe3+N－lobe of transferrin(A and A')and proposed model of uranyl－N－lobe(B and B')［51］

+絡合物在結構上的特征。通過優化Tf－UO22+絡合物的幾何構型以及計算的紅外圖譜發現UO22+主要與轉鐵蛋白中結合位點處的兩個酪氨酸(Tyr 95和Tyr 188)、一個天冬氨酸還有一個碳酸根離子配位，而組氨酸并未參與配位，這與文獻［51］的實驗結果相符。另外還發現天冬氨酸和一個酪氨酸之間形成非常強的氫鍵，該氫鍵在Tf－UO22+絡合物的形成及維持絡合物穩定上起到了非常重要的作用。計算得到的拉普拉斯電荷圖譜則表明UO22+－轉鐵蛋白絡合物可以同時充當親核試劑和親電試劑，可以與不同的受體進一步作用，這可能是鈾順利進入人體不同器官的原因。Mulliken電荷密度圖以及3－D密度圖則表明Tf－UO22+絡合物的形成機制為供體－受體機制。

血清白蛋白是人體血液中含量最為豐富的蛋白質，其質量濃度約為30～50 g/L，約占整個血液中蛋白質的一半，其主要功能為運輸脂肪酸。最早關于UO22+與血清白蛋白相互作用的研究始于1948年，Barron等［53］發現UO22+與血清白蛋白之間的相互作用是可逆的，同時會受到碳酸根及檸檬酸根等競爭性配體的影響。Chevari等［54］則采用Shubert－type方法算出在pH=6條件下UO22+與血清白蛋白絡合物的穩定常數為lg K=10。采用微量熱的方法得到了在pH=5.5條件下白蛋白中高親和力位點和低親和力位點分別與UO22+結合的穩定常數達到了K=1.6×107L/mol和K=2.8× 105L/mol［55］。Montavon等［50］同樣證實在血漿中UO22+與白蛋白和轉鐵蛋白都會形成鈾酰－蛋白質－碳酸根的多元絡合物，同時Ca2+會和UO22+與白蛋白競爭性配位。根據建立的模型計算發現，盡管兩種蛋白與UO22+結合能力相似，但與UO22+結合的血漿蛋白中80%是白蛋白，20%是轉鐵蛋白，其主要原因在于血漿中白蛋白的含量要比轉鐵蛋白高一個數量級。Yang等［56］則取與人血清白蛋白相似的牛血清白蛋白作為研究對象，采用熒光和全反射傅里葉紅外光譜(ATR－FTIR)的方法不僅得到了牛血清白蛋白與UO22+的結合常數，而且發現結合UO22+后蛋白質構象也發生了顯著變化。實驗結果表明在溶液體系中隨著UO22+濃度的增加，蛋白質二級結構中的α－螺旋(α－helix)結構成分不斷減少，而β折疊(β－sheets)、翻轉及無序纏繞等成分增多，因此可推測結構上的變化可能直接導致白蛋白在生理功能上的變化。

除了轉鐵蛋白和血清白蛋白外，血漿中是否還有其他蛋白質會與UO22+結合，而這些相互作用會不會更好解釋鈾在生物體內動力學及毒理學?為了更好地回答這些問題，Vidaud等［57］設計了一種結合時間分辨熒光和蛋白質組學分析的二維色層分析方法來篩選血漿中除了轉鐵蛋白和血清白蛋白外能與UO22+相互作用的蛋白質，并采用等離子質譜進行確認。結果表明血漿銅藍蛋白、血色素結合蛋白和另外兩種補體蛋白與UO22+結合的化學計量比大于1。然而這四種蛋白質都不是金屬蛋白，說明UO22+能通過各種各樣的結合位點及配位模式與很多蛋白質發生相互作用。Basset等［58］測得了13種血漿蛋白質與UO22+結合的解離常數，從中發現參與骨骼新陳代謝的胎球蛋白A (fetuin A)表現出對UO22+最強的結合能力。盡管其在血漿中含量較低，但結合了80%的UO22+?？紤]到相對濃度，作者認為白蛋白和轉鐵蛋白都并非血漿中主要的UO22+輸運者，而是胎球蛋白A。熒光分析表明胎球蛋白A具有三個UO22+結合位點，其中較強的結合位點的解離常數達到了10 μmol/L。圓二色譜結果顯示胎球蛋白A結合UO22+后，其蛋白質二級結構并未發生變化，相應的生理功能也沒有發生變化。該研究結果不僅改變了以往認為白蛋白和轉鐵蛋白是血漿中UO22+的主要輸運者的認識，同時也提出了鈾從血液到骨骼轉運以及在骨骼中沉積的一種可能的新機制。

(2)其他蛋白質

除了血漿蛋白外，其它金屬蛋白和磷酸化蛋白也是研究熱點。UO22+與金屬蛋白的結合與其他金屬離子處于競爭關系，蛋白質與何種金屬離子結合取決于形成配合物的穩定常數。Michon等［59］對比四種金屬蛋白發現，與UO22+結合能力由強到弱依次為轉鐵蛋白、人血清白蛋白、金屬硫蛋白和鐵蛋白。Li等［60］采用紅外光譜(ATRFTIR)的方法對高度磷酸化蛋白(卵黃高磷蛋白)結合UO22+的行為進行了研究，發現該蛋白對UO22+表現出非常強的結合能力。蛋白質中的磷酸基團對UO22+具有較高的親和性。Brown等［61］亦發現UO22+可以選擇性識別α－酪蛋白、卵白蛋白和β－酪蛋白的磷酸化位點，并且利用UO22+的光學特性對以上蛋白進行了光致切割。最值得關注的是: Wegner等［62］采用基因突變技術，針對UO22+赤道面的配位特性，對鎳離子結合蛋白NikR進行了特殊改造。NikR是nikABCDE鎳離子吸收系統的轉錄因子，如圖3(a)所示。在該結合位點的基礎上，將76位的組氨酸和96位的半胱氨酸突變為既能作為單齒配體又能作為雙齒配體的天冬氨酸以滿足UO22+赤道平面配位數的要求。同時將72位的纈氨酸變為絲氨酸，這樣絲氨酸上的羥基有可能與UO22+上一個氧原子形成氫鍵，從而增強蛋白質與UO22+的結合能力(圖3(b)所示)。突變后的蛋白質在和二甘醇酸與UO22+的競爭性絡合實驗表明，突變后的NikR’與UO22+的結合能力是二甘醇酸的50多倍，其解離常數為10－7.27±0.20mol/L。EXAFS結果表明兩個組氨酸和兩個天冬氨酸的殘基都參與配位。實驗結果也表明只有結合了UO22+的NikR’蛋白才能與DNA形成蛋白質－DNA的絡合物，而其它二價金屬Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Gd2+、Mn2+和Fe2+與該蛋白結合后都不能被DNA識別。該現象表明突變后的NikR蛋白表現出對UO22+的特異性結合?；趯︹欟ｋx子配位特性的了解，可以通過改變蛋白質骨架來選擇性結合UO22+，為設計具有高效選擇性結合錒系陽離子的蛋白質提供了重要的借鑒意義?；谠摾砟?，Zhou等［63］發展了能在蛋白質數據庫(protein data bank(PDB))中篩選出具有潛在UO22+結合位點蛋白質的程序(URANTEIN)，并利用該程序發現了甲烷桿菌體內一個功能未知的蛋白質具有較強UO22+結合能力，并針對UO22+的配位特性對該蛋白進行改造從而得到了具備良好的熱穩定性和超強UO22+結合能力的超級鈾酰結合蛋白(super uranyl－binding protein(SUP))。SUP－UO22+配合物晶體結構如圖4所示，研究發現，SUP對UO22+有優越的選擇性，能提取模擬海水中30%～60%的UO22+并能反復使用。該研究對理解UO22+與蛋白的作用機制以及利用生物技術進行海水提鈾均具有重要意義，為今后錒系元素結合蛋白的設計合成指明了方向。

圖3 鎳(Ⅱ)－響應轉錄因子(NikR)［62］Fig.3Nickel(Ⅱ)－responsive transcriptional regulator(NikR)［62］

圖4 超級鈾酰結合蛋白SUP的晶體結構［63］Fig.4Uranyl－SUP crystal structure［63］

2 結論與展望

核能的快速發展及公眾對于核安全的日益重視，使得作為重要核材料的鈾對于人體健康的影響倍受關注。在分子水平上對鈾與生物分子的相互作用研究是鈾在人體內的轉運、沉積機制及毒理和解毒機制研究的基礎，對錒系元素生物毒理學、錒系元素配位化學、錒系元素促排藥物的研發以及核環境安全均具有重要的現實意義。

本文綜述了在分子水平上定量分析UO22+與氨基酸、多肽和蛋白質相互作用的研究進展。主要結論如下:(1)由于氨基酸分子結構較為簡單，其與UO22+相互作用的研究已較為系統，為研究多肽及蛋白質等大分子奠定了基礎;(2)適當選取蛋白質金屬結合位點處多肽片段能夠較好地模擬蛋白質與UO22+的相互作用;合理地設計氨基酸序列和恰當引入磷酸基團能使模型多肽達到特異性結合UO22+的效果;(3)在眾多血漿蛋白質中，轉鐵蛋白、白蛋白和胎球蛋白A均表現出對UO22+較強的結合能力，都是血液中可能的UO22+輸運者;運用基因技術改造蛋白質金屬結合位點同樣能使其達到特異性結合UO22+的效果而不改變蛋白質生理功能?？偟膩碚f，在分子水平上定量研究鈾與特定生物分子相互作用研究仍處于起步階段，還有大量科學問題有待解決，而設計合成專門針對UO22+的多肽和蛋白質類的生物探針、促排藥物及細胞內或體內UO22+與生物分子相互作用研究將是未來分子水平上生物分子與UO22+確稱取一定量相互作用研究的發展方向。

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Recent Research Progress of Interactions Between Uranyl Ions and Peptides/Proteins

LIU Yang1，2，XIAO Cheng－liang2，MEI Lei2，QU Guo－pu1，*，SHI Wei－qun2，*
1.School of Nuclear Science and Technology，University of South China，Hengyang 421001，China; 2.Key Lab of Nuclear Radiation and Nuclear Technology，Institute of High Energy Physics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China

With the rapid development of nuclear energy industry，the bio－toxicities of actinides have drawn more and more attention with respect to their potential harmful effects on ecological environment and bio－organisms.Studying the interaction mechanisms of actinide cations with biomolecules，especially peptides or proteins，can provide useful information in molecular level for understanding the transportation，absorption and deposition pathways of actinides in vivo.Uranium，as a central actinide in nuclear fuel cycle，deserves more research endeavors.In this work，recent progresses about the interaction mechanisms between uranyl(UO22+)and amino acids，peptides and proteins are reviewed.The coordination modes，molecular structures and thermodynamic data of UO22+－peptide complexes are selectively highlighted.The possible roles of the plasma proteins playin UO22+transportation，absorption and deposition are discussed.In addition，the basic principles for designing UO22+specific binding peptides and proteins are presented.

uranyl;amino acid;peptide;protein;interactions;molecular level

Q506

A

0253－9950(2014)03－0129－11

10.7538/hhx.2014.36.03.0129

2013－12－06;

2014－04－01

國家自然科學基金資助項目(11275219)

劉洋(1989—)，男，四川成都人，碩士研究生，輻射防護及環境保護專業

*通信聯系人:屈國普(1964—)，男，湖南衡陽人，教授，從事核輻射探測方法研究，E－mail:quguopu@usc.edu.cn石偉群(1976—)，男，湖北黃梅人，博士，副研究員，從事核能放射化學研究，E－mail:shiwq@ihep.ac.cn