富勒烯乙二胺的抗輻射損傷性能

林濤，鐘志京，李群嶺，輝永慶

中國工程物理研究院核物理與化學研究所，四川綿陽621900

富勒烯乙二胺的抗輻射損傷性能

林濤，鐘志京，李群嶺，輝永慶

中國工程物理研究院核物理與化學研究所，四川綿陽621900

合成了一種水溶性富勒烯衍生物——富勒烯乙二胺，分別采用60Co源和中子加速器等輻照裝置，并結合紅外光譜(FTIR)、電子自旋共振技術(ESR)和電噴霧質譜(ESI－MS)等表征手段，比較考察了富勒烯乙二胺與香蘭素對受γ射線和中子等高能射線或粒子照射所產生自由基的清除性能。結果表明:對于經γ射線和中子輻照產生的自由基，所制得的富勒烯乙二胺均表現出了較好的抗輻射損傷特性;相同條件下對樣品輻照所產生的自由基的清除性能明顯優于市購的香蘭素。

富勒烯乙二胺;抗輻射損傷;自由基清除

隨著核電、輻射加工、工業探傷、射線安檢、輻射勘探及放射治療等核技術在國民經濟各領域越來越廣泛的應用，其在造福人類的同時，也給當今世界帶來了核輻射危害方面的重大風險。為了預防和減輕核輻射事故對人體健康的危害，積極研究輻射損傷防治手段、尋找有效輻射防護劑已成為一個需要迫切解決的問題。為此，中草藥因其藥源廣、毒性相對較輕而被人們用作輻射防護劑來研究，香蘭素是其中的典型代表物之一。研究發現［1－4］，香蘭素能防止食物變質，能抗鐮刀型貧血，且對動物基因具有保護作用，對細菌、哺乳動物細胞及動物全身實驗均表現出了對基因突變的抑制作用。文獻［5－6］研究發現，香蘭素及其衍生物具有較強的清除體內自由基的能力是其可用作輻射防護劑的關鍵。Sasaki［1］還發現其能抑制X射線照射所誘導的DNA單鏈斷裂、染色體斷裂核交聯;Tamai［7］、Liu［8］則均曾發現其具有促進DNA斷鏈復合從而降低染色體的畸變率，還能增強DNA修復和復制功能。盡管如此，但將香蘭素用于所需的作用濃度相對較高，而防護作用依然偏低。因此，研制并篩選其中具有更好防護效果的制劑，成為了國內外相關學者關注的熱點。近年來，人們大多嘗試從中草藥中尋找解決方案，雖已取得一定進展，但仍然存在技術難度高且防護效果有限等問題。研究表明，富勒烯及其衍生物具備很強的清除自由基的能力，是目前國內外相關研究的熱點之一。

富勒烯獨特的結構賦予它許多特殊的物理、化學性質。如富勒烯通過光誘導產生單重態氧高達100%，被喻為“單重態的發生器”;富勒烯極易與游離基反應，被喻為“吸收游離基的海綿［9］”;富勒烯的體積與HIV病毒活性中心的孔穴大小相匹配，又可能堵住洞口，切斷病毒的營養供給;富勒烯有30個雙鍵，可以發生多種化學反應，是藥物設計的理想基體，可以根據需要接上多種基團，人們把富勒烯喻為藥物設計中的“化學針插”。富勒烯的這些特性引起了生物化學家、藥物學家的濃厚興趣，并已在富勒烯及其衍生物的生物活性方面取得了一些令人振奮的結果。但是，富勒烯固有的疏水性和生物毒性，使它們在生物化學領域的研究和應用受到限制，因此，制備水溶性及低生物毒性的富勒烯衍生物具有重要的意義。

距今為止，國內外有關水溶性富勒烯衍生物輻射生物學效應的研究還十分有限，且僅限于對γ射線的輻射防護性能研究，對中子以及中子/ γ射線復合的輻射防護性能則未見有關報道。有研究表明，富勒醇可用于生物體系的自由基清除以減少有病血液中的自由基的濃度和抑制不正?；蛴胁〖毎L，當溶液中富勒醇的質量濃度為50 mg/L時，對O2－基的清除率可達到80%，顯示C60(OH)n對水溶液中的氧自由基有很強的清除作用［9］。Sameh［10］則合成含有三個丙二酸的富勒烯衍生物，該類物質具有類似于超氧化物歧化酶(SOD)的性質，能夠清除生物體中由于細胞代謝產生的副產物超氧自由基，其速率常數Kc3為2× 106/(mol·s)。

綜上所述，目前國內外已有的輻射防護劑還不理想，主要問題是防護效果低、毒副作用較大。本工作擬采用在富勒烯碳籠上添加—C2H4(NH2)2等水溶性基團，制備富勒烯乙二胺富勒烯衍生物，以增加富勒烯的水溶性。且以水溶性富勒烯乙二胺為對象并采購香蘭素作為對比的自由基清除劑，考察其在γ射線、中子照射下的抗輻射損傷性能，研究結果將為水溶性富勒烯衍生物在輻射防護劑方面的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

富勒烯(C60)，河南濮陽永新科技有限公司，純度大于99%;C6H11NO(DMPO)，美國Sigma公司，純度大于97%;胸苷酸(C10H13N2Na2O8P· xH2O)，美國Sigma公司，純度大于99%;4－羥－2，2，6，6－四甲基哌啶(HTMP)，南通惠康國際有限公司，純度大于99%;其余試劑均為色譜純。

電子天平，感量0.1 mg，普利賽斯(上海)有限公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司;三重四極桿液相色譜串聯質譜儀，Thermo Scientific公司;E500電子順磁共振波譜儀(ESP300)，德國Bluker公司。

1.2 富勒烯乙二胺的制備

富勒烯和二胺化合物的加成反應已有一些報道，Wudl［11］首次制備出C60和二胺的衍生物，陳遠蔭等［12］用C60和甲苯、乙二胺反應，減壓分離、離心得到富勒烯乙二胺衍生物。本工作采用的制備方法反應機理如下:

稱取100 mg C60加入到125 mL錐形瓶，再加入一定體積乙二胺，在氮氣保護下室溫攪拌反應相當時間。此時錐形瓶底部無黑色C60，將反應后的溶液平均移入離心管，加入甲醇至近滿，離心，倒出上層溶液，加入3 mL超純水溶解粗產物，再加入甲醇至近滿，離心，重復3次。將產物放到通風櫥揮發有機物4 h后，放入干燥器。干燥后產物為亮褐色固體，稱量產物為110.6 mg。

1.3 傅立葉紅外光譜測試(FTIR)

取少量樣品與適量KBr混合，充分研磨后壓片。利用紅外光譜儀分析其化學基團峰。

1.4 電噴霧質譜測試(ESI-MS)

取少量樣品溶解于水中，制成樣品溶液，進樣測試。

1.5 輻照實驗

將自旋捕集劑DMPO用重蒸餾水溶解后制成40 mmol/L水溶液，然后將乙醇或者HTMP(自由基產生劑)與不同濃度的富勒烯乙二胺溶液充分混合，配置成不同的輻照樣品。樣品配置完成后通入氮氣，1 h后封管。

γ輻照實驗在中國工程物理研究院核物理與化學研究所1.81×1016Bq60Co源大型輻照場中進行。中子輻照實驗則在中國工程物理研究院核物理與化學研究所k－400加速器上進行，k－400加速器通過氚靶激發產生14 MeV的中子，中子注量約為2.57×1010/s。

輻照實驗的樣品分為空白對照樣品和自由基清除劑樣品?？瞻讓φ諛悠肥呛欢舛鹊淖杂苫a生劑和自旋捕集劑的混合溶液，是產生自由基量的基準;自由基清除劑樣品是把不同濃度的富勒烯乙二胺添加到含一定濃度自由基產生劑和自旋捕集劑溶液中，形成混合溶液。

以DMPO作為自旋捕集劑，采用電子自旋共振技術(ESR)研究自由基產生劑受中子/γ射線照射產生的自由基，自旋捕集ESR信號會有典型的特征性譜線，可以證實存在自由基。

以ESR波譜的第二個峰高表示自由基信號的強度，用式(1)計算清除效率:

ESR測試參數:調頻100 kHz，調幅0.3 T，中心場350 T，磁場頻率9.854 GHz，掃描寬度20 T，微波功率2 mW，接收器衰減20 dB，時間常數5.12 ms，掃描時間20.03 s。

2 結果與討論

2.1 傅立葉紅外光譜表征

圖1為富勒烯乙二胺的紅外光譜圖。圖中3276.64 cm－1歸屬于NH2的振動峰，2862.49 cm－1歸屬于—CH2的對稱振動峰，1 573.06 cm－1歸屬于—NH2的振動峰。1 322.04 cm－1和1 232.71 cm－1歸屬于C—N的振動峰，這應該是乙二胺連接在富勒烯上使C—N發生了偏移。這些都表明乙二胺已連接在富勒烯上。

圖1 紅外吸收光譜Fig.1FTIR spectrum

2.2 電噴霧質譜表征

從富勒烯乙二胺的ESI－MS掃描總離子流圖(圖2(a))中，選取豐度最高的一段得到相應的質荷比圖(圖2(b))。已發現富勒烯和胺在惰性氣氛下反應，得到多胺基加合物［11，13］，在空氣中反應，則在加合胺的同時也加合了氧，得到C60OnXm(X為胺)。富勒烯乙二胺衍生物可以表示為C60(NH2CH2CH2NH2)x，x取整數。

圖2 ESI－MS總離子流圖(a)和質譜圖(b)Fig.2ESI－MS total ion current(a)and mass spectrum(b)

由圖2(b)可以看出，富勒烯乙二胺衍生物的質譜圖較為復雜，這是由于質譜儀在運行過程中由于溶劑的組成和各種添加劑不同以及樣品的雜質等復雜原因，都可能導致電噴霧質譜的譜圖復雜化，常常共存多種加合物離子。常見的加合物離子有陽離子復合物［M+H］+、［M+Na］+、［M+K］+等，溶劑簇離子［M+H2O+H］+、［M+CH3OH+H］+、［M+CH3CN+H］+等［14］(M表示C60衍生物)。對合成的C60乙二胺衍生物結構式的分析列于表1。如表1所示，可以得出C60與乙二胺的加成產物主要有C60NH2CH2CH2NH2、C60(NH2CH2CH2NH2)2、C60(NH2CH2CH2NH2)3和C60(NH2CH2CH2NH2)4。

表1 C60與乙二胺加成產物的電噴霧質譜分析結果Table 1Results of ESI－MS

2.3 富勒烯乙二胺的輻射效應研究

(1)富勒烯乙二胺對γ射線輻照所產生的自由基清除性能研究

通過分析研究和探索性實驗發現，乙醇－水溶液體系對γ射線輻照敏感，易生成α－羥乙基自由基，因此配制了乙醇－水溶液以考察富勒烯乙二胺對γ射線輻照所產生的α－羥乙基自由基的清除性能，乙醇－水溶液的濃度為0.2 mol/L。

在劑量率為145 Gy/min，60Co源γ射線輻照時間為10 min，測得不同濃度的富勒烯乙醇胺中自旋捕獲劑DMPO捕獲α－羥乙基自由基的ESR測試譜圖及清除率變化曲線示于圖3。由圖3可以看出，隨著富勒烯乙二胺濃度的增加，自旋捕獲劑DMPO捕獲α－羥乙基自由基的強度呈現減小的趨勢，相對應的富勒烯乙二胺對α－羥乙基自由基的清除率呈現增大的趨勢。富勒烯乙二胺質量濃度為0.30 g/L時，α－羥乙基自由基的清除率達到最大，為77.3%。

(2)富勒烯乙二胺對中子輻照所產生的自由基清除性能研究

由于4－羥－2，2，6，6－四甲基哌啶(HTMP)水溶液經一定劑量中子輻照可有效量化生成4－羥－2，2，6，6－四甲基哌啶氮氧自由基(HTMPO)，因此在通過查閱大量文獻以及前期探索性試驗基礎上，優選了HTMP作為HTMPO的前驅體，以考察富勒烯乙二胺對中子輻照所產生的哌啶類氮氧自由基的清除性能。

在劑量率為12 Gy/h、14 MeV中子輻照時間為6 h，測得不同濃度的富勒烯乙二胺中自旋捕獲劑DMPO捕獲氮氧自由基的ESR譜圖及清除率變化曲線示于圖4。由圖4可以看出，隨著富勒烯乙二胺濃度的增加，自旋捕獲劑DMPO捕獲氮氧自由基的強度呈現增大的趨勢，相對應的富勒烯乙二胺對氮氧自由基的清除率呈現減小的趨勢。富勒烯乙二胺質量濃度為0.10 g/L時，氮氧自由基的清除率達到最大，為62.8%。這應與中子屬于高LET射線有關，可能是由于高LET特性的中子具有更強的初級輻射電離效應而破壞了輻射防護劑的分子結構，使其對自由基的清除率呈現降低的趨勢。

2.4 香蘭素的輻射效應研究

(1)香蘭素對γ射線輻照所產生的自由基清除性能研究

在劑量率為145 Gy/min、60Co源γ射線輻照時間為10 min，測得不同濃度的香蘭素中自旋捕獲劑DMPO捕獲α－羥乙基自由基的ESR測試譜圖及清除率變化曲線示于圖5。由圖5可以看出，隨著香蘭素濃度的增加，自旋捕獲劑DMPO捕獲α－羥乙基自由基的強度呈現減小的趨勢，相對應的香蘭素對α－羥乙基自由基的清除率呈現增大的趨勢。香蘭素質量濃度為4.0 g/L時，α－羥乙基自由基的清除率達到最大，為51.1%。

圖3 不同濃度富勒烯乙二胺對γ輻照產生的α－羥乙基自由基的ESR譜圖(a)和清除率變化曲線(b)Fig.3ESR spectrum(a)and free radical elimination rate(b) by γ－irradiation for different concentrations of fullerene ethylenediamine

圖4 不同濃度富勒烯乙二胺對中子輻照產生的氮氧自由基的ESR譜圖(a)和清除率變化曲線(b)Fig.4ESR spectrum(a)and free radical elimination rate(b) by neutron irradiation for different concentrations of fullerene ethylenediamine

圖5 不同濃度香蘭素對γ輻照產生的α－羥乙基自由基的ESR譜圖(a)及清除率變化曲線(b)Fig.5ESR spectrum(a)and free radical elimination rate(b)by γ－irradiation for different concentrations of vanilin

(2)香蘭素對中子輻照所產生的自由基清除性能研究

在劑量率為12 Gy/h、14 MeV中子輻照時間為6 h，測得不同濃度的香蘭素中自旋捕獲劑DMPO捕獲氮氧自由基的ESR譜圖及清除率變化曲線示于圖6。由圖6可看出，隨著香蘭素濃度的增加，自旋捕獲劑DMPO捕獲氮氧自由基的強度呈現增大趨勢，相對應的香蘭素對氮氧自由基的清除率呈現減小趨勢。香蘭素質量濃度為0.2 g/L時，氮氧自由基的清除率達到最大，為16.7%。

2.5 富勒烯乙二胺與香蘭素對自由基清除性能的比較

通過2.3與2.4節可以看出，以乙醇－水溶液體系制得的樣品，在劑量率為145 Gy/min、60Co源γ射線輻照時間為10 min，所得的富勒烯乙二胺對α－羥乙基自由基的最高清除率為77.3%，明顯高于香蘭素對α－羥乙基自由基的最高清除率51.1%，表明本工作自制的富勒烯乙二胺具有優良的清除γ輻照產生的α－羥乙基自由基特性，可作為輻射防護劑，其性能明顯優于市售的香蘭素，這應該與富勒烯對自由基良好的吸收性能有關，值得進一步深入研究。

圖6 不同濃度香蘭素對中子輻照產生的氮氧自由基的ESR譜圖(a)及清除率變化曲線(b)Fig.6ESR spectrum(a)and free radical elimination rate(b) by neutron irradiation for different concentrations of vanilin

以HTMP的水溶液體系制得的樣品，在劑量率為12 Gy/h、14 MeV中子加速器輻照6 h，所得的富勒烯乙二胺對氮氧自由基的最高清除率為62.8%，明顯高于香蘭素對氮氧自由基的最高清除率16.7%。表明本工作自制的富勒烯乙二胺水溶性富勒烯衍生物在中子輻照下對氮氧自由基的清除效果比市購的香蘭素要好，可作為輻射防護劑，其性能明顯優于市售的香蘭素，這應該與富勒烯對自由基良好的吸收性能有關，值得進一步深入研究。

3 結論

以富勒烯(C60)為原料，通過優化實驗條件，合成了一種水溶性富勒烯衍生物——富勒烯乙二胺，并分別用FTIR和ESI－MS對其結構組成進行了表征。紅外吸收光譜結果表明乙二胺已連接在C60上，電噴霧質譜結果表明C60與乙二胺的加成產物主要有C60NH2CH2CH2NH2、C60(NH2CH2CH2NH2)2、C60(NH2CH2CH2NH2)3和C60(NH2CH2CH2NH2)4。對于經γ射線和中子輻照產生的自由基，所制得的富勒烯乙二胺均表現出了較好的抗輻射損傷特性，相同條件下對樣品輻照所產生的自由基的清除性能明顯優于市購的香蘭素。

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Anti-Radiation Damage Performance of Fullerene Ethylenediamine

LIN Tao，ZHONG Zhi－jing，LI Qun－ling，HUI Yong－qing
Institute of Nuclear Physics and Chemistry，Chinese Academy of Engineering Physics，Mianyang 621900，China

In this paper，a water－soluble fullerene derivatives has been synthesized.The products have been characterized by the FTIR，ESR and ESI－MS.The free radical elimination capabilities of the fullerene derivatives and vanilin have been investigated through γ and neutron irradiation.The results show the fullerene derivatives indicate better anti－radiation damage performance under the same conditions，and the free radical elimination capability of the fullerene derivatives is better than vanilin.

fullerene ethylenediamine;anti－radiation damage;free radical elimination

X591

A

0253－9950(2014)03－0169－06

10.7538/hhx.2014.36.03.0169

2013－06－19;

2013－10－21

林濤(1982—)，男，四川三臺人，碩士，助理研究員，主要從事環境科學方面的研究