黑曲霉菌絲球的形成及應用研究綜述*

黃勛娟，刁寧寧，張建國

(上海理工大學醫療器械與食品學院上海200093)

黑曲霉(Aspergillus niger)是一種常見的曲霉屬真菌，廣泛分布在谷物、空氣、土壤等各種物品上，在生物技術發展過程中發揮了很大的作用，很多產品來自于絲狀真菌的初級和次級代謝產物［1］。黑曲霉可用來生產檸檬酸和很多酶類，例如市場上常見淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡萄糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶［2］、柚苷酶、單寧酶、脂肪酶、植酸酶［3］、蛋白酶、果膠酶等。還可以根據培養基的不同而產生不同種酶的組合，如纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶。根據黑曲霉在產酸性蛋白時對氮源的需要量可分為兩大類:一類是需要低C/N，添加無機氮對產酶有利，這一類的有齋藤曲霉(Aspergillus saito)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)等;另一類要求較高的C/N，例如泡盛酒曲霉(Aspergillus awamori)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)，這一類酶活性較低。由于美國食品和藥物管理局(FDA)已經認定許多來自黑曲霉的產物是安全的［4］，所以黑曲霉被廣泛用于食品級產物的生產過程中。黑曲霉不僅被用于生產胞外酶和有機酸類物質，還被用來降解廢水中的有機物質，緩解里氏木霉培養過程中纖維二糖的積累而產生的產物反饋抑制。黑曲霉逐漸被改造成模式細胞來生產多種代謝物［5］。由于黑曲霉生產代謝產物與它的菌絲形態有關系，本文對黑曲霉菌絲球的形成機制、菌絲球與產物的關系，以及菌絲的應用等研究進展進行了綜述。黑曲霉在液態培養基中可以形成分散的菌絲，也可以形成菌絲球。菌絲球的形成機制是目前研究的熱點，而且菌絲球具有沉降速度快、易于固液分離、應用廣等優點，逐漸受到研究者的重視。

1 黑曲霉菌絲球的形成機理

絲狀真菌在液態培養中有2種完全不同的形態:一種是由菌絲緊密聚集而成菌絲球;另一種是菌絲均勻地分散在培養液中呈細絲狀［6］。高橋穰二通過顯微鏡觀察，將絲狀真菌的菌絲球形成機制分為2種類型:一類是多個孢子首先聚集、膨脹，再生長出菌絲，由菌絲聚集纏繞形成菌絲球，稱為凝聚型(coagulative);另一類由單個孢子首先萌發而生長出菌絲，然后聚集成菌絲球，稱為非凝聚型(non-coagulative)。非凝聚型孢子的接種量與菌絲球的個數接近。而凝聚型孢子的接種量與菌絲球的個數呈倍數關系［7］。比較典型的凝聚型絲狀真菌有構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和擔子菌白腐菌［8］。非凝聚型絲狀真菌有米根霉。LIN等［9］用種群動態描述軟件PARSIVAL(Particle size evalution)擬合黑曲霉孢子凝聚的2個階段后確定了2個步驟的時間節點。孢子在0～8 h內依靠相互碰撞聚集在一起形成孢子聚集體;孢子聚集體在8～16 h內萌發，萌發形成的菌絲利用更多的表面積吸附沒有萌發的孢子，導致溶液中孢子顆粒濃度急劇下降。孢子聚集體萌發形成菌絲球的決定性因素是菌絲比生長速率、菌絲表面與顆粒濃度之比。

從微觀角度分析，真菌孢子的表面電荷是影響孢子聚集和菌絲球形成的重要因素。孢子之間有3種作用力:范德華力、雙電層力和空間力。Krull等［10］通過原子力顯微鏡觀察，以及計算pH和鹽濃度對黑曲霉孢子間黏附力的影響表明，黑曲霉孢子的等電點為pH 2左右。pH提高，黑曲霉孢子的絕對電動電勢增加。這與高pH下孢子聚集的數量降低的實驗結果相一致［11］。Andreas Wargenau 等［12］先在酸性條件下研究了黑曲霉孢子表面電荷的來源。黑曲霉孢子在很寬的pH范圍內呈現陰性的遷移率說明黑曲霉孢子在很寬的pH值范圍內處于負Zeta電位，這是由于孢子壁上具有較多的弱酸基團(例如羧基)。采用堿液提取孢子壁的黑色素發現，孢子釋放的黑色素量與孢子聚集性能成反比。這可能是堿液破壞了孢子壁上的弱酸基團，也可能由于釋放黑色素后的孢子壁弱酸基團減少了。由于黑色素分子中含有羧基，所以很可能是由于堿液的作用減少了孢子壁上的黑色素而減少了孢子壁上的羧基［12］。而且黑曲霉孢子凝聚與培養基中的離子有關系［13］，這符合膠體科學中的雙電層模型。Wargenau等進一步利用膠體科學中的Poisson-Boltzmann模型分析，發現表面電勢與pH呈線性關系［12］。黑色素是黑曲霉孢子細胞壁成分之一，它是高分子質量疏水性色素，可以保護黑曲霉分生孢子［14］。

疏水蛋白也被認為在菌絲球形成過程中發揮重要作用。它是由真菌分泌的分子質量小，含有8個半胱氨酸殘基的兩親表面活性蛋白［15］。疏水蛋白在接近親水-疏水界面時，自動組裝成一種兩親水脂膜［16］，在氣生菌絲的增長和真菌黏附到固體支撐物過程中有重要作用。Scholtmeijer［17］根據疏水蛋白的溶解性將其分為2類。第1類只能溶解在三氟乙酸和甲酸中;第2類能溶解在乙醇或十二烷基硫酸鈉。疏水蛋白在孢子的非特異性吸附中有重要作用［18］。黑曲霉可能產生這兩類疏水蛋白［19］，在孢子-表層和孢子-孢子吸引力中扮演了重要的角色，尤其在液態培養中孢子聚集和生物膜形成中有促進作用，但是目前具體機理還不清楚。疏水蛋白有助于孢子之間的凝聚［16］。

孢子聚集后形成菌絲球的階段受到養分運輸、菌絲細胞壁的抗張強度，以及細胞內信號傳導菌絲元素的影響［10］。通常情況下，絲狀真菌以恒定比生長速率增長，直到底物發生限制。真菌菌絲球的宏觀生長通常用顆粒半徑描述。通常一個菌絲體的主干菌絲平均長度為100～400 mm，菌絲球的半徑為250～2 500 mm。

2 黑曲霉菌絲球形成的影響因素

2.1 營養成分

黑曲霉可以利用多種碳源，在含有葡萄糖的培養基中48h會形成菌絲球［20］，利用甘露醇、葡萄糖和蔗糖時在28～72 h間菌絲球直徑增長迅速加快，直至192 h時菌絲球直徑開始下降。而黑曲霉在利用可溶性淀粉時生長較慢，菌絲球較小，說明甘露醇、葡萄糖和蔗糖容易被菌絲球利用，所以菌絲球的直徑基本呈現勻速增長的狀態，生長速度快。Enshay等［21］在攪拌式反應器中以葡萄糖和戊糖作為培養基培養黑曲霉，可以形成直徑不超過400 μm的菌絲球。以NH4NO3和NH4Cl做為氮源形成的菌絲球的直徑也較大，干濕比變化較穩定。Fe2+可致菌絲球數量較少且大小極不均勻。而Mg2+不僅能促進菌絲球數量增多，且生成的菌絲球大小均勻、表面光滑。Mg2+在孢子聚合過程中能夠起到促進作用。而Na+在菌絲球形成的過程中作用較小，這是因為Na+與黑色素的吸附力遠小于 Mg2+與黑色素的吸附力［22］。Haq等［23］對金屬離子與培養基成分的相互作用的研究表明，在低于2.0×10-5mol/L的Fe2+中添加MgSO4可以降低Fe2+對菌絲生長的促進作用。Mg2+可以使黑曲霉形成松散的菌絲球(直徑為0.6 mm)，且有利于檸檬酸的產生。而且添加Mg2+的時機也是一個重要因素。在培養12 h或者18 h后添加Mg2+可以形成較大的菌絲球。添加Cu2+也有類似的效果［23］。另外，增加培養基中磷的含量可以提高菌絲球的直徑［24］。

2.2 pH

黑曲霉菌絲球的形成機理表明，pH值是影響孢子凝聚的決定性因素，且認為與孢子具有pH依賴性的表面特性有關系。培養基pH也是影響黑曲霉生成各種蛋白的重要因素［8］。黑曲霉的形態隨pH值的改變而有明顯變化，在pH 2時比較難形成菌絲球，在pH 3～10之間都可形成菌絲球。pH 3～6之間形成的菌絲球生物量大，球徑較均勻，外表光滑、韌性好;pH 7～10的生物量少，菌絲球小，不均勻，韌性差;當培養基初始 pH為4～6時，菌絲球質量較好。不同pH值下，不僅黑曲霉產生的酶的種類不同，酶活力也不同。黑曲霉產生多種有機酸，如檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等的量也取決于pH。例如pH＜3.5時有利于TCA循環，從而積累更多的檸檬酸，而在pH 4.5～8時產生葡萄糖酸，pH為6左右可產生果膠酶。

2.3 孢子濃度

孢子碰撞形成晶核的機率受到孢子濃度的影響。菌絲球的直徑與孢子濃度呈負相關［24］。黑曲霉形成菌絲球的孢子濃度應小于108/L。當接種量為103/L時，孢子碰撞的機率小，所以有些菌絲球可能未飽和晶核形成。當接種量增大為104/L時形成晶核的機會也相應增大。當接種量高于105/L，每個晶核所含有的孢子數目都達到飽和，所以孢子數量的增加導致晶核數目增加，于是形成菌絲球的數目也增加。接種量過低會使菌種生長緩慢，發酵周期延長，降低發酵效率，而過高的接種量會使菌種生長迅速，不利于產酶。

2.4 攪拌和溶氧

在培養過程中，提高攪拌速率可增加溶氧，但剪切力則會打散黑曲霉菌絲球［8］，一般情況下，將轉速控制在100 ～300 r/min。Hesham 等［25］研究表明，不同的攪拌速率下黑曲霉的生長速率不受影響，但是菌絲形態有很大的不同。在低攪拌速率(200 r/min)下形成的黑曲霉菌絲球平均直徑為1 500 mm，在攪拌速率為500 r/min時菌絲球直徑為400 mm，在800 r/min時菌絲球直徑為24 mm。在攪拌速率為200和500 r/min時，菌絲球的顆粒個數分別是(45±5)和(250±40)個/ml。這種菌絲球球徑隨轉速的提高而減小的結論與朱虹的研究結果相一致。但是攪拌速率降低為120 r/min時，菌絲球的形狀不規則，由松散的小菌球黏連在一起。這是由于在低轉數下菌絲受到的剪切力較小，生成的菌絲球結構松散、外表不光滑，菌絲球之間很容易粘連形成不規則的大顆粒。當攪拌速率升高為160 r/min時，形成的菌絲球各方面性能較好。為了避免攪拌的不足，通過調整通氣量來增加體積輸入功率之比也可以控制菌絲球的直徑和數量［26］，同時能生產大量的淀粉酶。Moreira 等［20］采用一個脈沖流化床生物反應器通過控制反應器的脈沖形成最適剪切力，提高流化質量來控制絲狀真菌形成菌絲球，最后形成均勻的菌絲球，并且提高檸檬酸產量。黑曲霉在0.35 S-1的脈沖生物反應器中培養22天后菌絲球直徑保持在(3.3±0.1)mm，而在無脈沖生物反應器中培養11 d，菌絲球直徑變為(6.7±0.3)mm。

2.5 溫度

黑曲霉可以形成菌絲球的溫度范圍比較廣。大多數文獻報道的培養溫度為27℃或者30℃［27］。培養溫度升高(25℃升為30℃)會導致菌絲球的直徑變大。當培養溫度提高到35℃時，不能形成菌絲球，呈現為無序的菌絲體［28］。

2.6 外源添加物

在培養基中添加表面活性劑可以影響菌絲球的生長。吐溫-80使黑曲霉生長的菌絲球松散，直徑變大［29］。添加氧載體可提高黑曲霉的生長和代謝，降低菌絲球的直徑，提高菌絲球的傳質。例如正十二烷在濃度分別為0、2.5%、5%(w/v)時，菌絲球的直徑分別為0.75～1.7 μm、0.65 ～1.30 μm 和 0.55 ～2.05 μm［30］。添加硅酸鹽、Al2O3等小顆?？梢哉{節菌絲球直徑的大?。?1］。

3 黑曲霉菌絲球的應用

3.1 檸檬酸

檸檬酸是世界上產量最大的發酵產品之一。目前市場上99%以上的檸檬酸都是通過黑曲霉發酵法生產的，黑曲霉的形態與產生檸檬酸量有關系。當Mn2+低于14 μg/L時黑曲霉形成菌絲球且產生大量的檸檬酸。當Mn2+高于14 μg/L時黑曲霉成絲狀分散在溶液中，產生很少的檸檬酸。雖然通過抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization)證明有22個基因對Mn2+的作用有響應，但是對于Mn2+對黑曲霉菌絲形態和檸檬酸產量的影響還沒有找到明確的分子機制。Gurpreet Singh Dhillon等［32］對蘋果渣超濾污泥(APS)液態培養絲狀真菌進行了流變剖面的研究，利用黑曲霉NRRL-567在7.5L發酵罐培養發酵產生檸檬酸。發酵液的流變學特性包括菌絲球、控制條件等，證明大量菌絲體使培養液變為非牛頓假塑性流體。但是添加誘導物甲醇后，在非牛頓液態培養基中黑曲霉形成菌絲球。

3.2 污水處理

黑曲霉形成的菌絲球具有厭氧顆粒污泥和好氧顆粒污泥所不具備的很多優點。第1，菌絲球具有較寬泛的成球和生長條件，具有一定的機械強度，能夠抵抗較大的水流剪切力，克服顆粒污泥因形成條件難以控制、維護過程復雜而造成的出水水質不穩定現象。第2，菌絲球沉降性能較好，避免了傳統活性泥水分離不徹底、系統不夠穩定的缺點。第3，菌絲球營養需求簡單，生長速度快，沒有二次污染，可以實現污泥的資源化，降低污泥處理成本。第4，菌絲球由菌絲纏繞而成，表面有許多空隙，利于傳質，其吸附COD、重金屬離子及染料的能力遠遠大于普通活性污泥和顆粒污泥。黑曲霉菌絲球在處理含糖類廢水中表現出顆粒透氧性好的特點。雖然顆粒內部處在厭氧條件下，使得部分葡萄糖積累，但絕大部分的菌絲球還是暴露在較高的溶氧中，可以維持較好降解能力。菌絲球的底物滲透率優于聚乙烯醇硼酸［33］。黑曲霉菌絲球應用于含鉻廢水中還原Cr(VI)可以將99.6%Cr(VI)還原［34］，可以處理豆制品廢水56.4%COD［35］和食品工業廢水中 90%的淀粉［36］。

3.3 蛋白質生產

黑曲霉可以生產許多種酶，是美國FDA準許使用的食品工業酶的主要生產菌。菌絲球可以降低培養液的黏度，提高吸收底物的速率，所以研究形成菌絲球的方法也是提高黑曲霉產酶性能的一種途徑。例如添加聚硅氧烷來促使黑曲霉形成菌絲球提高纖維素水解的酶類［37］。菌絲球產生蛋白質的活性菌絲球是位于菌絲球表層200 μm的部分。目前報道的黑曲霉菌絲球產生的酶有葡萄糖氧化酶、聚半乳糖醛酸苷酶、植酸酶和淀粉酶。

3.4 單細胞的收獲

由于黑曲霉菌絲球易于分離的特性，所以被用來收獲單細胞微生物。有些微藻是用于生物能源制造熱門單細胞微生物。但是微藻類的直徑在1～30 μm，由于微藻類細胞小而且分散生長，在技術上難以利用機械過濾等方法收獲，收獲過程的成本為總成本的20% ～30%。ZHANG等［38］利用絲狀真菌和微藻類共同培養，絲狀真菌可以使微海藻細胞包裹在菌絲球上，形成有效的將微藻類與溶液分離的菌絲球的，大幅度降低了生產成本，將這種技術用于城市廢水處理中，形成的曲霉-微藻類菌絲球直徑為 2～5 mm［39］。

3.5 全細胞催化過程

菌絲球還作為一種固定化的全細胞催化劑用于生物轉化過程中。例如外消旋的環氧氯丙烷可以被黑曲霉菌絲球轉化為S-環氧氯丙烷。而且黑曲霉菌絲可以承受環己烷為溶劑。在這個轉化過程中，連續流加環氧氯丙烷也沒有表現出對全細胞催化劑抑制現象。最終，得到18.5%的S-環氧氯丙烷［40］。黑曲霉菌絲球作為生物催化劑用于催化沒食子酸生成沒食子酸丙酯的研究中。在以苯為溶劑中反應18 h后沒食子酸丙酯得率達到36.4%［41］。由于黑曲霉可以完成多種特異性的催化反應，所以黑曲霉菌絲球作為催化劑具有廣泛的應用前景。例如催化的香葉醇苯氨基甲酸酯孤立雙鍵的不對稱雙羥基化反應［42］。

4 結語

由于黑曲霉的安全性好，所以被應用于很多領域。黑曲霉在外孢壁上的黑色素和自身分泌的疏水蛋白作用下發生聚集現象，生成菌絲球。黑曲霉菌絲球的形成在很多應用方面起到推動作用，雖然其形成機理尚未完全清楚，但是其形成條件及應用已經很廣泛，例如用于有機酸的生產、水處理、單細胞的收獲、全細胞催化過程等諸多方面。

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