蛋白質組學在人乳及牛乳蛋白研究中的應用現狀*

楊梅，徐鑫，張居明，烏日娜，岳喜慶

(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

“蛋白質組”是由澳大利亞學者Wilkins等于1994年提出，指的是由基因組編碼的全部蛋白質［1］。根據乳蛋白質組學的研究內容，可以分為結構乳蛋白質組學和功能乳蛋白質組學。結構乳蛋白質組學主要是研究乳中蛋白質的表達模式;功能乳蛋白質組學主要是研究乳中蛋白質的功能及蛋白質間的相互作用［2］。乳蛋白質組學的研究方法主要有兩種:一種是“全蛋白質組學”，也就是檢測乳中基因組表達的所有蛋白質;另一種是“差異蛋白質組學”，主要是篩選和鑒定不同種類或不同狀態下各樣本乳之間蛋白質組的區別與變化［3］。

乳中的主要成分是由乳蛋白、乳糖和乳脂構成，其中乳蛋白質是乳中最重要的組成成分。乳蛋白質可以為新兒和哺乳動物提供氮、酶、激素及免疫物質等，對其健康成長有重要的作用。乳中含有豐富的蛋白質，其中酪蛋白(CN)、乳清蛋白(WP)和乳脂球膜蛋白(MFGM)是乳蛋白的重要組成部分［4-5］。乳中有種類多樣、含量豐富的蛋白質，由于遺傳變異和翻譯后修飾對乳蛋白的影響，使乳蛋白的組成變得復雜、龐大［6］。本文闡述了蛋白質組學在人乳與牛乳蛋白研究中的應用進展，以及乳酪蛋白質組學、乳清蛋白質組學、乳脂肪球膜蛋白質組學、乳鐵蛋白質組學的研究，為尋找疾病的臨床診斷和治療、乳品加工保存條件、開發新型嬰幼兒食品提供重要的理論依據。

1 乳蛋白

乳蛋白質是乳中最重要的組成成分之一，其含量和組成是決定乳質量的重要指標。乳中的蛋白質調控著嬰幼兒及哺乳動物幼崽的生命活動。通過蛋白質組學的方法對乳蛋白進行研究，能夠直觀、整體地分析蛋白質的組成以及在生命活動中的調控規律，可以更全面深入地闡明蛋白質的表達信息。利用蛋白質組學技術可以對乳中蛋白質的含量以及組分進行鑒定，也可對乳中蛋白的糖基化、磷酸化、乙?；确g后修飾進行特征性描述，蛋白質組學己成為乳蛋白表達和翻譯后修飾分析的重要工具［7］。因此，研究人乳與牛乳蛋白能夠為乳的功能性質、營養價值以及分泌機制提供有利的依據。

1.1 乳蛋白的遺傳多態性

乳蛋白是由乳腺上皮細胞合成并分泌的營養物質，乳蛋白的基因型受位于常染色體上的等顯性基因控制，屬于孟德爾式遺傳。1953年，Aschaffenburg等利用紙層析法對牛乳中的β-乳球蛋白進行首次分析，得到2種不同的遺傳變異體，由此展開了對乳蛋白多態性研究的序幕［8］。隨后，許多學者利用脲素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea-APGE)和等電聚焦電泳(IEF)等先進方法檢測不同蛋白變異體在乳中的分布情況，對乳蛋白多態性方面有了深入的了解。許多學者認為，乳蛋白遺傳變異是基因直接表達的產物，其多態性的類型受到顯性基因控制，是基因產物直接表達的形式，并研究了乳清蛋白中2個蛋白的位點，發現了11個復等位基因［9］。目前，還沒有對乳蛋白遺傳多態性進行深入、系統的研究。因此，利用蛋白質組學的方法研究乳蛋白遺傳多態性以及乳蛋白泌乳性能相關性，有助于對乳的遺傳多樣性、遺傳分化的了解。

1.2 乳蛋白的翻譯后修飾

人乳與牛乳中蛋白質的正常功能是由體內基因表達產物空間構象的正確形成決定的，在此過程中蛋白質的翻譯后修飾發揮著重要的調節作用。由于翻譯后修飾使乳蛋白質的結構變得更加復雜，調節更加精細，作用更加專一［10］。翻譯后修飾存在20種以上的修飾類型，比較常見的有糖基化、乙?；?、泛素化、磷酸化，目前對乳蛋白質翻譯后修飾的研究較多的為糖基化和磷酸化。研究乳蛋白質翻譯后修飾對了解乳蛋白的結構和功能具有重要的意義。Holland等［11］采用2-DE與β-消除結合的方法從牛乳中分離出了κ-酪蛋白，并利用質譜技術鑒定出5個潛在的O-糖基化位點存在于 κ-酪蛋白中。Froehlich等［12］利用蛋白組學的方法對人乳中糖蛋白的表達情況進行研究，結果表明，乳鐵蛋白的糖基化程度在泌乳期的前期呈動態變化，并且在一些乳清蛋白中也存在糖基化程度變化。Miclo等［13］利用2-DE技術分離了低分子質量β-酪蛋白，并結合LC-ESI-MS技術鑒定出β-酪蛋白是由于磷酸化修飾從而形成了存在17個磷酸基團的低分子質量的磷酸化β-酪蛋白。對乳蛋白質翻譯后修飾的深入研究，有利于預防和治療由其引起的疾病，以及為乳的功能性質以及營養價值提供有利的依據。

1.3 乳高豐度蛋白分析

乳中的高豐度蛋白主要是由酪蛋白以及乳清蛋白構成，利用蛋白質組學的方法對乳中高豐度蛋白的分析相對較為簡單。Aslam等［14］利用2-DE技術對奶牛哺乳期乳蛋白的表達模式進行了分析，發現隨著哺乳期的延長酪蛋白含量有所降低。Ferranti等［15］采用高效液相色譜(HPLC)的方法將CN進行分離，得到了4個主要的峰，經電噴霧質譜(ESI-MS)鑒定，每個峰只含有1個酪蛋白家族，它們分別是αs1-CN、αs2-CN、β-CN 和 κ-CN。Miranda等［16］利用反向高效液相色譜(RP-HPLC)和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術對脫脂乳蛋白中的CN進行分離，經由Edman微序列和質譜鑒定，發現了αs1-CN和β-CN存在多態性。對乳蛋白中的主要成分的鑒定，有利于更深入的了解物種間、品種間乳蛋白的差異，為乳產品提供更多的有利信息。

1.4 乳低豐度蛋白分析

乳蛋白中含有一部分含量很少卻可以作為調控蛋白、受體和酶等具有生物學特定功能的蛋白質，也就是低豐度蛋白。利用蛋白質組學的方法對乳低豐度蛋白進行分析時，需要移除高豐度蛋白，或者相對富集低豐度蛋白，是對乳低豐度蛋白研究的主要方法。Yamada等［17］通過免疫吸附的方法除去β-CN以及免疫球蛋白后，研究了奶牛初乳和常乳中低豐度差異蛋白質，發現奶牛初乳中含有特異的蛋白質。Holland等［18］利用半胱氨酸標簽法移除了αs1-CN和β-CN這2種酪蛋白后，對乳清中其他類型酪蛋白異構體進行了分析。Panchaud等［19］利用陰離子交換和分子過濾作用的方法富集了人乳中的低豐度蛋白，接著通過SCX/RP進行分離，利用質譜技術鑒定出乳清中43種蛋白質。在對人初乳的研究中，通過免疫吸附去除高豐度蛋白質后，鑒定出151個乳清蛋白質，其中有83種是從前沒有發現的［20］。因此，乳中低豐度蛋白的檢測對全面認識乳蛋白有重要意義。

1.5 乳蛋白質水解分析

乳蛋白質的水解主要為酶水解、化學水解和物理水解等。乳蛋白質經水解后獲得的多肽具有易于吸收利用，抗高血壓，促進鈣、磷吸收，抗血栓等特定功能。因此，乳蛋白水解后獲得的小分子肽具有比蛋白質更高的營養價值和生物活性。Kunji等［21］將蛋白質水解系統中存在編碼關鍵酶的幾個基因切除后，分析了L.lactis中β-酪蛋白的水解途徑，實驗結果表明細胞壁上存在具有底物特異性的蛋白酶，并且在β-酪蛋白的C-末端表現。Rival等［22-23］利用蛋白質組學技術發現利用胰蛋白酶將β-酪蛋白酶解后多肽的抗氧化活性最強，將酶解后的多肽進行分離純化，獲得了3個具有較強抗氧化活性的多肽段，并證實了β-酪蛋白酶解物具有抑制過氧化反應的功能。Deutsch 等［24］對 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbruecki subsp.lactis和 Streptococcus thermophilus幾種嗜熱乳酸菌提取物的水解作用進行了分析，其中L.helveticus對β-酪蛋白的水解能力最強，但水解產物中的磷酸肽幾乎是不能被降解的。因此，研究乳蛋白質水解多肽有利于提高乳蛋白的利用價值，并為開發新的功能性食品提供依據。

2 乳蛋白質組學

2.1 乳酪蛋白質組學

乳酪蛋白是由乳腺上皮細胞合成的磷蛋白，含有大量的磷和鈣以及幾乎全部的必需氨基酸，是對新生兒及幼崽最具營養價值的蛋白質，可以對鈣和磷的吸收具有促進作用。CN通過新生兒或幼崽胃腸道蛋白酶作用后，釋放出的生物活性肽對新生兒或幼崽的消化、吸收和免疫具有調節作用。因此，利用蛋白質組學的方法研究乳酪蛋白對了解乳蛋白對新生兒及幼崽的生命活動有重要作用。Ciavardelli等［25］采用電感耦合等離子體質譜法的方法對牛乳中α-CN和β-CN磷酸化位點進行了鑒定，使CN的磷酸化蛋白質組學成為乳酪蛋白組學研究的重點。Poth等［26］采用2-DE結合MALDI-TOF-MS的方法分離并鑒定了人乳蛋白，對磷酸化程度進行了分析，得到了6個磷酸化β-CN點。Girardet［27］等采用RP-HPLC分離技術得到了β-CN，并結合ESI-MS/MS鑒定出β-CN具有不同的磷酸化形式。Brophy等［28］采用IPG技術分析了正常牛乳和轉基因牛乳中的β-酪蛋白和κ-酪蛋白，并進行了定量比較，結果表明轉基因牛乳中的酪蛋白比正常牛乳含量更高。Claverol［29］等采用了2-DE結合MS技術的方法對κ-酪蛋白的混合物進行研究，并揭示了將不同的磷酸化和糖基化模式分離成的異構體的方法。一些其他學者利用2-DE結合質譜的方法對乳中的αs1-酪蛋白異構體進行了研究［30］。以及利用2-DE的方法分析了酪蛋白亞型模式［31］。利用2-DE的方法對水牛乳酪蛋白和牛乳酪蛋白進行差異蛋白分析，通過電泳圖譜對比，發現了14個差異點，而在水牛乳酪蛋白與山羊乳酪蛋白的電泳圖譜中發現了10個差異蛋白點，利用質譜進行鑒定，得到了4個存在于水牛乳酪蛋白的主要組分，為在不同乳源蛋白中發現未知蛋白提供依據［32］。

2.2 乳清蛋白質組學

乳清蛋白是乳去除CN后，分離出來的乳清中所含有的蛋白質。乳清蛋白中存在較多對機體具有調控和免疫作用的免疫球蛋白。近年來，通過蛋白質組學研究發現，機體防御蛋白質作為含量最大的蛋白質種類存在于乳清蛋白中，機體防御蛋白質包括含量較高的免疫球蛋白以及含量較低的補體系統蛋白等［33］。隨著蛋白質組學技術的快速發展，乳清蛋白作為研究乳房炎的關鍵，通過對比患乳房炎及健康乳房分泌蛋白在種類及組成上的差異，找出能夠預測隱型乳房炎的生物標記物，因此乳清蛋白質組學已經成為預測乳房炎的關鍵。Boehmer等［34］通過蛋白質組學的方法對受大腸桿菌侵染的乳房與侵染不同時間分泌的乳清蛋白質的組成及含量進行了差異分析，實驗結果表明抗菌肽-1蛋白和肽聚糖識別蛋白受體蛋白的含量隨著侵染時間及體細胞數的增加而增加。將牛乳乳清蛋白通過熱處理變性后，利用蛋白質組學技術鑒定出β-乳球蛋白經過水解能夠產生2種多肽，因此β-乳球蛋白能夠作為定量分析乳及乳制品中未降解乳清蛋白含量的目標蛋白［35］。Murakami等［36］采用2-DE的方法對乳清中的蛋白質組分進行了分離，并且對蛋白質的斑點進行鑒定，實驗結果表明在51ku處的蛋白質斑點為凝聚素α-鏈。因此，利用蛋白質組學技術研究乳清蛋白有利于對疾病的預防與治療。

2.3 乳脂肪球膜蛋白組學

近年來，乳脂球膜(MFGM)蛋白作為乳蛋白的一個特異性亞類受到許多學者的關注。乳脂肪球膜蛋白質包含來自于內質網、細胞膜及細胞質中的蛋白質，可以部分代表泌乳細胞中的蛋白質［37-38］。Charlwood等［39］采用2-DE分離技術結合 MALDI-TOF鑒定的方法，研究了人乳脂球膜蛋白中凝聚素、乳轉鐵蛋白、多聚免疫球蛋白受體和lactadherin 4個主要蛋白質，發現這4種蛋白的糖基序范圍差異較大。Goldfarb等［40］采用2-DE的方法對人乳脂球膜蛋白進行了分離與鑒定，發現阿樸脂蛋白E存在4種分子質量的異構體。Quaranta等［41］提出了一個新的人乳脂肪球膜蛋白的提取方案，然后運用2-DE進行分離，并獲得了23個蛋白質斑點，經過序列分析，發現1種新蛋白質的存在。乳脂球膜中的蛋白質具有重要的生物學活性，這些蛋白質大部分是未知的。因此，對乳脂球膜蛋白質進行蛋白質組學的研究有極其重要的意義。

2.4 乳鐵蛋白質組學

乳鐵蛋白(lactoferrin，簡稱LF)又稱乳轉鐵蛋白，在哺乳動物的乳汁中含量非常豐富。近些年來，隨著蛋白質組學技術的不斷發展，許多國家開始意識到乳鐵蛋白的使用價值，因此利用蛋白質組學的技術研究乳鐵蛋白有助于其在食品、醫藥等領域的應用。Silvia Catinella等人［42］利用 MALDI-TOF/MS 技術研究了脫脂后的人初乳、人常乳蛋白質的質譜圖，發現隨著泌乳期的延長，乳鐵蛋白的重鏈呈遞減趨勢。石磊等［43］利用FT-ICR/MS技術對經過脫脂的人乳乳脂、乳清和乳粒中的蛋白成分進行了分析和鑒定，并在乳清和乳粒中獲得了乳鐵蛋白。王靜等人［44］利用蛋白質組學技術對母乳進行了分析，通過SDS-PAGE檢驗免疫前后母乳中高豐度蛋白的質量分數，得到了乳鐵蛋白的清晰條帶。David J Palmer等人［45］在研究脫脂人初乳中的低豐度蛋白時，利用SDS-PAGE檢測脫除高豐度蛋白的效果，通過初乳電泳圖譜分析，觀察到了乳鐵蛋白。Boesman-Finkelstein等人［46］利用SDS-PAGE分離技術對脫脂脫酪蛋白的人乳乳清液進行了分析，獲得了乳鐵蛋白條帶。Manso.等［47］利用毛細管區帶電泳 (CZE)的方法對人乳與牛乳進行了差異蛋白的比較研究，并分析了不同泌乳階段下脫脂人乳中主要蛋白的電泳圖譜，同時以UHT(超高溫瞬時滅菌)牛乳做為對照，結果在3周時的人乳中出現了乳鐵蛋白的峰形，而這個峰形牛乳則沒有。

3 展望

蛋白質組學作為乳蛋白質研究的主要策略之一，雖然剛剛起步，卻能夠在蛋白質水平上揭示生命現象的本質及活性規律。隨著蛋白質分離和鑒定技術的不斷發展，以及乳蛋白質組圖譜和數據庫的不斷完善，應用蛋白質組學技術對人乳、牛乳蛋白質組進行全面、深入的研究，為尋找疾病的臨床診斷和治療、乳品加工保存條件、開發新型嬰幼兒食品提供重要的理論依據。但是，由于蛋白質組學技術以及乳蛋白的復雜性，乳蛋白質組的研究還存在一些問題，對乳中的低豐度蛋白的全方位的鑒定、比較還不是很成熟。乳蛋白的合成與降解、翻譯后修飾的表達分析是乳蛋白質組學的核心問題，還具有一定的發展和研究空間。

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