高血壓大鼠穹窿下器神經元型一氧化氮合酶陽性神經元的表達及意義

郭建美

穹窿下器(subfornical organ，SFO)是感受性室周器官之一，缺乏血腦屏障，研究證實其與飲水、血壓等多方面的調節有關［1］。穹窿下器內含有一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，NOS)陽性神經元，而一氧化氮是血壓調節的重要信息分子之一，其在神經系統中含量豐富，且與高血壓的發生密切相關［2］。有研究顯示，NO缺乏可能是高血壓發生的原因之一［3］。本文用ABC免疫細胞化學方法，觀察高血壓大鼠SFO內神經元型NOS(nNOS)陽性神經元的變化，探討SFO內nNOS免疫陽性神經元在高血壓形成和發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 選擇雌性Wistar大鼠(清潔級，體重230～250 g，由河北醫科大學動物中心提供)40只，隨機分為2組，實驗組(n=30)和對照組(n=10)。實驗組予以左旋硝基精氨酸(L-NNA)15 mg·d-1·kg-1，分別于上午 8∶00、下午 8∶00 兩次腹腔注射，制備高血壓動物模型。實驗組根據動物血壓及腹腔注射時間分為3組:用藥2周組、用藥4周組和用藥8周組，每組10只。對照組不做任何處理。

1.2 動物血壓的測量［4］應用大鼠生理記錄儀采用尾部套囊的方法測量收縮期血壓。測定條件:環境安靜，溫度30℃，測量前將大鼠放入暖箱中使其身體暖和并適應其環境15～30 min，到時間后將大鼠取出放入鼠袋中留出全部鼠尾，并放入儀器中固定位置，在尾根部套入環式氣囊，進行血壓測定并讀取數據。必須在大鼠安靜狀態下測定3次，取其平均值。適應性喂養期間每隔1 d測血壓1次，主要目的是使大鼠適應實驗環境。分組后每周測血壓1次。

1.3 高血壓的評判標準 目前國際上還沒有大鼠動態血壓正常值及高血壓的統一標準，根據美國和歐洲最新公布的高血壓治療新指南［5］(JNC-T指南和ESH/ESC指南)及張維忠等［6］建議的動態血壓暫時參考標準，本研究規定大鼠動態血壓的收縮壓/舒張壓符合白晝 ＞150/100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，夜間 ＞140/90 mm Hg時為高血壓。

1.4 光鏡樣品制備 實驗動物給予10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重麻醉后，經左心室灌注37℃預熱的0.9%氯化鈉溶液200～250 ml，后灌注4℃ 4%多聚甲醛150 ml(先快后慢，25 min內灌注完畢)，取腦后立刻將腦組織放入4%多聚甲醛4℃后固定，8 h后將腦組織分別沿視交叉前方和垂體根部后方冠狀位切開，取SFO相應腦區3～4 cm厚度組織，放入4%多聚甲醛中繼續后固定12 h。后固定結束后選取包含有穹窿下器的腦塊，常規石蠟包埋，連續石蠟切片，片厚5μm，nNOS免疫組織化學顯色、封片。顯微鏡觀察、攝片。

1.5 免疫細胞化學染色方法 取上述HE染色的相鄰切片:(1)常規脫蠟，經各級乙醇至水。(2)0.01 mol/L pH=7.4 PBS浸泡5 min。(3)封閉內源性過氧化物酶:切片入10%H2O2/甲醇室溫下浸泡15 min。(4)抗原修復:將切片浸入枸櫞酸緩沖液，在免疫組化專用微波爐中進行微波修復20 min，室溫下自然冷卻。(5)封閉非特異抗原:10%山羊血清封閉，室溫下30 min。(6)加入一抗:4℃冰箱孵育過夜，以不加一抗而用PBS緩沖液代替的切片同時染色，做陰性對照。(7)加入二抗:生物素化羊抗兔IgG，37℃下孵育30 min。(8)加入三抗:，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復合物，即SABC，37℃下孵育20 min。(9)DAB室溫下顯色5～10 min，待顯色完全后自來水終止顯色。(10)常規乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。Olympus萬能照相機觀察照像。

1.6 圖像分析 選取10×40倍視野調整好顯微鏡的光源強度使之保持不變，對穹窿下器進行掃描。掃描過程中保持4個固定，即:(1)顯微鏡的光源強度固定;(2)曝光數固定;(3)白平衡值固定;(4)視場域大小固定。每只大鼠具有以上部位的切片各選5張，每張切片選以上部位結構清楚的5個陽性細胞進行畫分割，然后選取平均灰度值這個參數進行測量，計算機直接得到這項指標的平均值。平均灰度值反應組織、細胞的明暗，間接反應所含化學物質的多少，數值越大表明含量越少。

1.7 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以±s表示，應用SNK-q檢驗分析，進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 L-NNA的升壓效應 尾壓測量L-NNA給藥前對照組和模型組的收縮壓差異無統計學意義(P＞0.05)。L-NNA用藥2、4、8周，模型組的收縮壓均明顯高于對照組(P＜0.05)。L-NNA用藥2周后，模型組形成了高血壓(159.6 mm Hg＞150.0 mm Hg)。此后，血壓繼續升高，到用藥4周時，血壓升至(171±8)mm Hg，此后，血壓升高緩慢，穩定在此水平。見表1。

表1 給L-NNA后血壓隨時間的變化n=10，mm Hg，±s

表1 給L-NNA后血壓隨時間的變化n=10，mm Hg，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別 2周 4周 8周112±8 109±7 111±7模型組 160±8* 171±8* 173±8對照組*

2.2 鏡下觀察結果 對照組:在冠狀切片上可見nNOS免疫陽性細胞排列密集，單個細胞形態較清晰，均勻分布于整個SFO內，陽性細胞呈棕黃色，位于胞質，胞核不著色，細胞胞體中等大小，呈圓形或橢圓形，突起較短或不明顯，灰度值測定為(179.24±9.62)。模型組:用藥2周組陽性細胞在SFO背側部及兩背側邊緣帶的大血管周圍分布較密集，細胞呈棕褐色，胞體中等大小，形態多樣，呈圓形、梭型或三角形，有些可見由胞體發出的短突起灰度值測定為(159.32±7.22)。用藥4周組陽性細胞著色變淺，呈棕黃色。胞體呈圓形或橢圓形，未見明顯突起灰度值測定為(192.48±6.02)。用藥8周組陽性細胞呈淡黃色。胞體呈球形，未見明顯突起灰度值測定為(191.78±5.84)。見圖1～4，表2。

圖1 對照組(HE×400)

圖2 用藥2周組(HE×400)

圖3 用藥4周組(HE×400)

圖4 用藥8周組(HE×400)

表2 不同組別nNOS陰性細胞的變化±s

表2 不同組別nNOS陰性細胞的變化±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與用藥2周比較，#P＜0.05

組別 2周 4周 8周179±10 179±10 179±10模型組 159±7* 192±6*# 192±6*#對照組

3 討論

高血壓是常見病和多發病，可引起心、腦、腎等靶器官的損害。高血壓的發生和體內NO的減少有關。本實驗參考近年來有關方法［7］用一氧化氮合酶抑制劑—L-NNA腹腔注射大鼠來復制NO缺乏型高血壓大鼠模型。腹腔注射L-NNA后3 d，大鼠出現反應遲鈍、順從、反抗能力減低、攝食、飲水較正常組為多等臨床癥狀。L-NNA給藥2周后血壓升至159.6 mm Hg，符合高血壓的診斷標準。提示此種方法造模成功。在造的45只動物模型中，有3只不明原因死亡，其余42只全部達到高血壓標準，造模成功率達90%以上。

SFO位于第三腦室前背側壁、海馬連合腹側穹窿腳分歧處，恰在兩個側腦室與第三腦室頂之間，在垂直軸上或矢狀切面上，恰好平對室間孔平面，屬于感受性室周器官(sensory circumventricular organs，SCVOs)［1］。多年來人們對其形態結構己有了較深的認識，有研究認為，感受性室周器官即可能作為腦的開窗來感受外周血攜信息的變化［1］。SFO缺乏血腦屏障，與其他部位相比可能會更早的接觸血攜信息，而提前發生改變。Gaillard等［8］研究證實，腹腔注射內毒素(LPS)主要經室周器官等缺乏血腦屏障的位點、血腦屏障位點及某些傳入性神經纖維(如迷走神經)入腦。朱望東等［9］研究發現，在應用不同劑量的LPS后，SFO部位較早出現一氧化氮合酶(nitri coxide synthas，NOS)蛋白表達;Quan等［10］曾觀察了在外周給予內毒素后，IL-10 mRNA表達的時程變化，發現SFO處為最早表達的部位之一，并從SFO處起始逐漸向腦內表達到高峰。

nNOS免疫組化結果顯示，在用藥2周組，穹窿下器內nNOS免疫陽性細胞灰度值較正常組降低，此種現象未見相關報道。在用藥4周組，穹窿下器內nNOS免疫陽性細胞灰度值較正常組增加，這與李紅等［11］的報道一致。在用藥8周組，nNOS免疫陽性細胞灰度值和用藥4周組相似?；叶戎捣磻M織、細胞的明暗，間接反應所含化學物質的多少，數值越大表明含量越少。在本研究中隨著用藥時間的延長，在SFO的nNOS免疫陽性細胞染色呈現先增加后減低的規律。這提示在用藥初期，NO水平降低，被SFO感知后產生相關反應，分泌對nNOS敏感的相關物質，從而表現為高表達。而隨著時間的延長，大鼠體內的NO水平最終下降并達到另一個新的水平，SFO不再能感知到NO的水平波動，故而nNOS相關物質的分泌減少，故轉為低表達。通過本研究發現SFO在體內NO水平波動時在形態學方面發生了明顯的變化，其具體機制還有待進一步的研究。

1 Johnson AK，Gross PM.Sensory circumventricular organs and brain homeostatic pathways.J-FASEB，1993，7:678-686.

2 周初松，靳安民，馬大烈.大鼠脊髓組織一氧化氮合酶顯微及超微結構特征.第一軍醫大學學報，2000，20:485-487.

3 郭志剛，沈建剛，翁昌鴻，等.冠心病、高血壓病人血漿氧自由基、一氧化氮及纖溶性的變化.第一軍醫大學學報，1999，19:124-126.

4 鄧江，吳芹，黃燮南.經大鼠尾動脈無創性血壓測量的方法.遵義醫學院學報，2008，31:184-186.

5 張維忠.美國和歐洲高血壓治療新指南評析.中華心血管病雜志，2003，31:650-652.

6 張維忠，施海明，王瑞冬等.動態血壓參數正常參照值協作研究.中華心血管病雜志，1995，10:325-328.

7 Charpie JR，Charpie PM，Goud C，et al.Quinapri Preventshypertension andenhanced vascular veactivity innitroarginine treaterats.Blood Pressure，1997，6:117-124.

8 Gaillard RC.Interaction between the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and the immunolo gicalsystem.Neurosci，2001，24:320-324.

9 朱望東，馬常升，曹翠麗，等.不同免疫狀態下穹窿下器的一氧化氮合酶細胞的變化.解剖學雜志，2001，24:132-135.

10 Quan N，Whiteside M，Herkenham M.Time course and localization patterns of interleukin-1 messengeger RNA expression in brain and pituitary after peripheral administrationof lipopolysaccharide.Neuroscience，1998 Mar，83:281-293.

11 李紅，徐健，徐鵬宵.自發性高血壓大鼠室周灰質中NOS陽性神經元的形態學觀察.武警醫學院學報，2007，16:114-116.