毛脈酸模體外抗菌及抗病毒作用的實驗研究

劉 奐 ，馬微微，岳賽男，任秀明，郭 美，王振月

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱，150040)

毛脈酸模(Rumex gmelini Turcz.)蓼科酸模屬植物，分布于黑龍江省大、小興安嶺、張廣才嶺以及東部山區，民間以根入藥，對淋病、癬病、癌癥、瘡毒等具有治療作用，還能止血、調血脂.現代藥學研究表明酸模屬植物主要具有抗腫瘤作用，亦有抗菌、抗病毒、止血、免疫調節、抗氧化等方面的作用.現已從毛脈酸模根中已分離得到萘類、二苯乙烯類，蒽醌類、等化合物［1］.其中蒽醌類、萘類是主要的抗菌抗病毒活性成分［2－6］.廣大學者已對毛脈酸模的藥理作用進行了大量的實驗研究，藥理研究表明:其具有抗心肌缺血、抗腫瘤等生物活性，但毛脈酸模的抗菌抗病毒效果尚未見報道.本試驗對毛脈酸模不同部分的抗菌抗病毒活性進行了研究，以期為毛脈酸模的開發利用提供科學依據.

1 實驗材料

1.1 藥物

毛脈酸模根采自黑龍江省桃山林業局，大黃藥材購自哈爾濱三棵樹藥材市場，均經黑龍江中醫藥大學中藥資源與開發教研室主任王振月教授鑒定;雙黃連口服液購自哈爾濱醫藥股份有限公司中藥二廠;土霉素片購自哈爾濱市肉聯生化制藥一廠，批號940129.

1.2 菌株

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌、甲型鏈球菌、白葡萄球菌、白喉桿菌，以上菌株均由黑龍江中醫藥大學微生物教研室提供.

1.3 病毒株和宿主細胞

流感病毒和MDCK細胞購自中國預防科學科學院病毒所.

2 毛脈酸模體外抗菌實驗研究方法

2.1 受試藥物的制備

取毛脈酸模粗粉，水浸30 min，每次加4倍量的水，首次煎沸30min，二煎沸20 min，過濾，取濾液合并，濃縮至1 g/mL的浸膏，4℃冰箱保存備用;另取毛脈酸模細粉用70%乙醇浸沒放置24h，過濾，取藥渣，重復以上操作1次，合并濾液，濃縮至1 g/mL的浸膏，4℃冰箱保存備用.

2.2 陽性對照藥材的制備

取100 g生大黃細粉用70%乙醇浸沒放置24 h，過濾，取藥渣，重復以上操作1次，合并濾液，濃縮至1 g/mL的浸膏，4℃冰箱保存備用.土霉素片研成細粉，生理鹽水溶解，使每毫升水溶液相當于50萬單位的土霉素，過濾，備用.

2.3 實驗方法

在無菌操作臺上，取900只試管，每組10只，將配制好且已滅菌的供試藥液(1 g/mL)用肉湯培養基分別作二倍遞減濃度稀釋［7－8］，即取上述藥液各0.5 mL，肉湯培養基1.5 mL分別加入第一管中，將藥液依次按1∶2，1∶4，1∶8，...，1∶256 的比例進行稀釋，最終藥液的質量濃度依次為0.25，0.125，0.062 5，....，0.001 953 g/mL.每管分別加入0.05 mL菌液，其中第9號試管只加最低稀釋倍數的藥液，不加菌液，第10號管只加菌液和肉湯，不加藥液，分別作為標準陰陽性對照管，每組平行做3次，將各試驗管和對照管置37℃的恒溫培養箱中培養18 h，觀察各管澄清度，細菌不生長的最高藥物稀釋度為該藥的最低抑菌濃度(MIC).

用直徑4 mm的白金耳，取MIC管及藥物濃度大于MIC管的各管培養液無菌操作劃線接種于平皿上，37℃的恒溫培養箱中培養18 h，無細菌生長或只生長5個菌落(含5個)以下的藥物最低濃度即為該藥對該株菌的最小殺菌濃度.

3 毛脈酸模體外抗病毒實驗研究方法

3.1 受試藥物的制備

毛脈酸模根部75%乙醇回流提取，提取物水混懸后依次用乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，得到萃取物乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物，水提取物.另取毛脈酸模水煎液.75%乙醇提取液(制備方法同2.1)，均濃縮至1 g/mL的浸膏，4℃冰箱保存備用.

3.2 實驗方法

3.2.1 病毒毒力測定

將病毒懸液用10倍遞減稀釋為10－1到10－8共8個稀釋度，加入MDCK細胞已長成單層的96孔培養板中，每個病毒稀釋度接種3孔［9－10］，每孔200 μL，37 ℃，5%CO2中孵育72 h，棄病毒液，用Hanks洗板2次，最后一次控干并加入100μL維持液，同時設正常細胞對照組，倒置顯微鏡下每天觀察細胞病變(令－為0%CPE，+為1% －25%CPE，++為25% －50%CPE，+++為50%－75%CPE，++++為75% －100%CPE)，且細胞對照正常時，MTT法進行細胞染色，酶標儀570 nm處測定染色后OD值，根據OD值判斷不同濃度的病毒對細胞的抑制作用，采用 Reedmuench法計算半數感染量TCID50.

3.2.2 藥物毒力測定

將已過濾除菌的各個供試藥液及陽性對照藥(雙黃連口服液)用維持液對倍稀釋后，加入已長成單層細胞的96孔培養板中［11］，同時設空白組，將各濃度藥液加入細胞培養板中，每個濃度3孔，每孔200μL.于37℃，5%CO2溫箱中培養4 h，置顯微鏡下觀察細胞形態.計算最大無毒濃度(TC0)和50%毒性濃度(TC50).(計算方法同病毒毒力測定方法)

3.2.3 藥物對流感病毒的抑制作用

用100TCID50的流感病毒每孔200μL接種到96孔培養板中已長成單層的MDCK細胞中，于37℃，5%，CO2中孵育72 h后，棄去病毒液，將最大無毒質量濃度的各供試藥物用細胞生長維持液連續對倍稀釋后，加入到病毒感染細胞中200μL/孔，同時設正常細胞對照組、病毒感染對照組，每組三個復孔.于37℃，5%CO2中孵育，逐日在倒置顯微鏡下觀察CPE情況，待病毒感染對照組CPE達到+++ ～++++時終止實驗.計算藥物對病毒的抑制濃度IC50值，并按藥物的治療指數(TI)公式:TI=TD50/IC50計算各藥物的TI值.

4 實驗結果

毛脈酸模水煎液和70%醇冷浸液均顯示有明顯的體外抑菌和殺菌活性.其中以毛脈酸模醇提液的體外抗菌活性最強，毛脈酸模70%醇冷浸液對白葡萄球菌、甲型鏈球菌、綠膿桿菌的抗菌效果均高于大黃，對乙型鏈球菌、傷寒桿菌的抗菌效果與大黃相同，對白葡萄球菌、綠膿桿菌的抗菌效果高于土霉素，對傷寒桿菌和大腸桿菌的作用效果相當于土霉素.毛脈酸模根部水煎液的最小抑菌濃度見表1，毛脈酸模根部75%乙醇提取液的最小抑菌濃度見表2.毛脈酸模根部70%乙醇冷浸液的最小殺菌濃度見表3.毛脈酸模水提液和醇提液對流感甲型病毒的抑制最強.正丁醇部位提取物、水部位提取物、水提取液、醇提物均對流感甲型病毒有抑制活性，活性高低為:75%乙醇提取物＞水提取物＞水部位提取物＞正丁醇部位提取物，乙酸乙酯部位提取物沒有抑制活性.毛脈酸模75%乙醇提取物抗流感病毒的活性與雙黃連口服液抗病毒的活性相當.毛脈酸模各有效部位對流感病毒的抑菌效果見表4.

表1 毛脈酸模水煎液對4種細菌的最小抑菌質量濃度

表2 毛脈酸模根部70%乙醇冷浸液對6種細菌的最小抑菌質量濃度

表3 毛脈酸模根部70%乙醇冷浸液對6種細菌的最小殺菌質量濃度

表4 毛脈酸模各有效部位對流感甲型病毒的抑菌效果

5 討論

王振月等已分離出大黃素，大黃酚，大黃素甲醚，大黃酚苷，酸模素，酸模素苷，白藜蘆醇等化合物［1］，相關資料報告均具有一定的抗菌活性［2－6］，與實驗結果一致.毛脈酸模水煎液和70%乙醇冷浸液的抗菌效果略有差異，說明不同提取液對毛脈酸模根部有效成分的溶出率是有差異的.對乙型鏈球菌而言，水煎液抗菌活性高于70%乙醇冷浸液.毛脈酸模70%乙醇冷浸液對白葡萄球菌、甲型鏈球菌、綠膿桿菌的抗菌效果高于大黃，對白葡萄球菌、綠膿桿菌的抗菌效果高于土霉素;毛脈酸模多個部位均具有抗病毒的活性，但是以75%乙醇提取物的活性最強，其抗流感甲型病毒的活性與雙黃連口服液抗病毒的活性相當，本實驗表明，毛脈酸模根部用乙醇提取的方法，較之水煎煮的方法有明顯的優越性，可最大限度的提取抗菌和抗病毒的有效成分，為科學合理地制備毛脈酸模摸出了一條有效途徑，為其臨床卓著的治療效果，提供了可靠的實驗依據.為今后進一步深入研究奠定了良好基礎.

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