正交試驗優選雷公藤藥材生物堿的提取工藝*

★ 許可為 朱若凱 蔡佳 陳麗華 吳德智

(1.江西中醫藥大學附屬醫院 江西 南昌330006;2.江西省醫藥采購服務中心 江西南昌330029;3.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 江西南昌330004)

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)為衛茅科雷公藤屬植物，對治療風濕性關節炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡以及腫瘤等自身免疫性疾病療效顯著。雷公藤生物堿類成分是雷公藤主要有效成分之一，具有明顯的免疫抑制、抗腫瘤及抗生育等作用，且毒性遠低于二萜類成分，具有良好應用前景［1］。文獻報道［2］以雷公藤總生物堿提取率為評價指標優選了雷公藤藥材生物堿的提取工藝，但僅從總生物堿提取率來考察提取工藝尚存不足。雷公藤吉堿和雷公藤次堿是雷公藤根皮提取物中含量較高的2種生物堿，同時也是主要的活性成分。因此本實驗以雷公藤總生物堿、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率和浸膏得率為指標優選了雷公藤藥材生物堿的提取工藝，為雷公藤生物堿的進一步研究提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機、柱溫箱、VWD檢測器;UV2550型紫外分光光度計(日本島津公司);TG328A十萬分之一電子天平(德國Startorius公司)。

雷公藤藥材(福建漢堂生物制藥股份有限公司);雷公藤吉堿、雷公藤次堿(自制，純度大于98%，面積歸一法測得);乙腈、甲醇(色譜純，美國TEDIA天地試劑公司);磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司);水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 雷公藤總生物堿的測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取雷公藤吉堿對照品7.60mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，搖勻，得濃度為304μg/mL的對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取正交設計供試品溶液8號，參考文獻方法［2］提取液減壓濃縮，用0.5 mol/L HCl溶液30 mL提取3次，合并酸液，用30 mL氯仿分2次萃取酸水液，棄去氯仿層，酸水中加入濃氨水調節pH至7左右，靜置，用濾紙過濾，加濃氨水調節pH至9～11，再用90 mL氯仿分3次萃取至水中無生物堿為止，合并氯仿液，在旋轉蒸發儀中濃縮至干，加入5%HCI溶液并定容至25 mL，即得雷公藤總生物堿供試品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇 精密量取雷公藤吉堿對照液，置于吸收池中，以甲醇溶液為空白，在200～400nm波長范圍內掃描，268nm處有最大吸收，故選擇268nm為測定波長。

2.1.4 線性關系考察 精密量取雷公藤吉堿對照品溶液1，1.5，2，2.5，3，3.5mL，置于 10mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，搖勻，在268nm波長處分別測定吸光值，以質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線?；貧w方程和相關系數分別為:Y=0.0066X-0.00912，r=0.9993。說明雷公堿吉堿濃度在30.4～106.4μg/mL范圍內與吸光度A具有良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.1”項下的對照品溶液，在268nm波長處測定吸光度，連續重復測定6次，計算RSD為0.11%(n=6)。

2.1.6 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24h進行測定。測定268nm波長處吸光度，計算RSD為3.57%，結果顯示供試品溶液在24h內測定結果穩定。

2.1.7 加樣回收率試驗 在已測定總生物堿濃度的雷公藤藥材提取液中加入已知量約80%、100%、120%的雷公藤吉堿對照品，制備供試品溶液，進行測定，計算回收率。結果雷公藤總生物堿平均回收率為98.74%，RSD為1.54%。

2.1.8 總生物堿提取率的測定 于紫外分光光度計上測定各提取物溶液在268nm處的吸光度值，根據線性方程得到總生物堿含量，并按下列公式計算雷公藤藥材中總生物堿的提取率。

2.2 雷公藤吉堿和雷公藤次堿測定方法的建立

2.2.1 色譜條件［3，4］色譜柱:Diamon sil C18(4.6mm ×250mm，5μm);柱溫:25℃;流動相為乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀水溶液梯度洗脫:1～12min梯度從55∶45變化為50∶50，12 ～13min梯度從50∶50 變化為 55∶45，13 ～20min 為 55∶45;流速:1mL/min;檢測波長:268nm。進樣量:20μL。

2.2.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取雷公藤吉堿、雷公藤次堿對照品5.10，4.80mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，搖勻，分別得濃度為204，192μg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 標準曲線的繪制 分別精密吸取雷公藤吉堿和雷公藤次堿混合對照品儲備液 0.5，1，2，3，4，5mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進樣20μL，以進樣濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性擬合，混合對照品色譜圖見圖1(A)。雷公藤吉堿和雷公藤次堿的線性方程和相關系數分別為:Y=5.190X+3.196，r=0.9994;Y=5.638X+4.473，r=0.9993。結果表明雷公藤吉堿和雷公藤次堿分別在10.2～81.6μg/mL和9.6～96μg/mL呈良好線性關系。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20μL，重復進樣6次，測得峰面積積分值，計算得雷公藤吉堿和雷公藤次堿的RSD分別為0.97%和0.67%(n=6)。

2.2.5 穩定性試驗 取正交設計供試品溶液8號，分別于0，2，4，8，12，24h 進樣測定。計算雷公藤吉堿和雷公藤次堿質量濃度，得到RSD分別為1.34%和2.59%，結果顯示供試品溶液在24h內測定結果穩定。

2.2.6 加樣回收率試驗 在已測定雷公藤吉堿和雷公藤次堿質量濃度的雷公藤生物堿提取液樣品中加入已知量約為80%、100%、120%的混合對照品，制備供試品溶液進行測定，計算回收率。結果雷公藤吉堿和雷公藤次堿的平均回收率分別為96.03%、103.89%，RSD分別為0.96%、1.63%。

2.3 提取工藝考察 根據預試驗考察結果，提取前浸泡1h，提取次數確定為2次。將提取液pH值、提取溶媒(乙醇)濃度、提取溶媒用量以及回流提取時間定為實驗因素，每個因素備選3個水平。按照L9(34)正交試驗表進行試驗設計，各因素水平見表1。

表1 因素水平表

圖1 混合對照品(A)、雷公藤藥材提取液(B)的HPLC圖譜

2.4 正交試驗設計及結果 稱取雷公藤藥材20g，按表2安排的試驗進行提取，合并2次提取液，按2.3項下方法制備生物堿樣品，分別測定樣品中雷公藤總生物堿、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率和干浸膏得率，雷公藤提取物的色譜圖見圖1(B)。試驗結果采用綜合評分進行評判［5］，選取雷公藤總生物堿提取率(y1)、雷公藤吉堿提取率(y2)、雷公藤次堿的提取率(y3)和干浸膏得率(y4)為考察指標，綜合評分時指定雷公藤總生物堿提取率、雷公藤吉堿提取率、雷公藤次堿提取率、浸膏得率指標權重系數分別為0.4、0.25、0.25、0.1。規定雷公藤總生物堿提取率最高的為40分，最低的為0分，每升高1%則加5.47分［40/(19.61-12.30)］，同理雷公藤吉堿提取率每升高1%則加0.66分，雷公藤次堿提取率每升高1%則加0.97分，規定浸膏得率最低的為10分，最高的為0分，每升高1%則減去8.70分。試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

以綜合評價值為考察指標，直觀分析顯示因素作用主次為A＞C＞B＞D，方差分析結果表明因素A、C對綜合評分值具有顯著影響，根據K值，因素應選A3B3C3D1。綜合上述分析，確定最佳工藝為，即選擇pH為4，分別用12、10倍量的80%乙醇回流提取2次，每次1h，第1次提取前浸泡1h。

2.5 驗證試驗 根據試驗結果，按最佳優化條件進行3次試驗，分別測得雷公藤總生物堿、雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率和干浸膏得率。表4結果表明該提取工藝穩定可行。

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析

表4 驗證試驗結果

3 討論

考察中藥的提取工藝時，應選擇能代表中藥整體的多個與功效有關的活性成分作為指標。本實驗選擇雷公藤總生物堿提取率以及主要活性成分雷公藤吉堿、雷公藤次堿的提取率三項指標綜合表征雷公藤生物堿的提取效率，同時兼顧浸膏得率，采用加權評分法綜合表征雷公藤生物堿的整體特性，最終通過正交試驗確定雷公藤生物堿提取的相關工藝參數，為雷公藤生物堿的提取提供依據。

在雷公藤總生物堿提取率的考察中，采用不同對照對總生物堿含量進行比較，最終選擇含量較高的雷公藤吉堿作為對照品，測得的結果較為穩定，含量較高。同時建立了HPLC法同時測定雷公藤吉堿、雷公藤次堿的含量，在梯度洗脫條件的摸索中，考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鈉等系統的多種洗脫程序，結果以乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鈉可以得到良好的分離效果，2種成分的峰形對稱，結果穩定，可用于2種成分的定量分析。

［1］舒孝順，高中洪，楊祥良，等.雷公藤生物堿的化學和藥理活性研究進展［J］.廣東藥學院學報，2003，19(2):150-152.

［2］周琳，馮俊濤，馬志卿，等.雷公藤提取農藥用總生物堿工藝的優化［J］.農業工程學報，2008，24(12):287-290.

［3］陳列忠，王開金，陳建明，等.RP-HPLC法同時測定不同產地雷公藤根皮中3種生物堿的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(2):191-193.

［4］張聰聰，黃建明，俞媚華，等.HPLC法測定雷公藤提取物中雷公藤甲素及兩種生物堿的含量［J］.復旦大學學報(醫學版)，2009，36(3):333-336.

［5］王光發，廖正根，梁新麗，等.正交試驗優選四臣止咳顆粒處方藥材的提取工藝［J］.中草藥，2009，40(2):1 901-1 904.