標本離心時間及放置時間對凝血篩選檢測的影響

白 璐 王建瓊 蔣宏君 付 輝 王 凡 朱 磊

云南省第一人民醫院檢驗科，云南昆明 650034

活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原(Fib)統稱為凝血四項，是目前臨床上用于診斷和觀察血栓形成、抗凝治療的常用檢測項目，可作為反映機體內外凝血機制功能異常的篩選實驗，在出血性/血栓性疾病診斷、手術前準備、抗凝治療監測等有重要作用，準確可靠的檢測結果對臨床診斷和治療非常重要，但影響實驗結果的因素較多，該研究從標本的離心時間和放置時間對凝血篩選檢測的影響進行分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑STA-R Evolution 全自動血凝分析儀及配套試劑（法國Stago）、109 mmol/L 枸櫞酸鈉真空抗凝管（武漢致遠）、TDZ4A-WS 低速臺式離心機（長沙湘儀）。

1.1.2 標本來自本院住院的無凝血功能異常史的普通患者50例。

1.2 方法

1.2.1 標本離心時間對實驗結果的影響 用一次性枸櫞酸鈉1∶9

真空抗凝管平行采集3 組各50 例血液標本，以定量3 mL 至指定刻度，立即顛倒混勻，于3 000 r/min 速度下經5 min、8 min、10 min 3 種不同時間離心后,在相同條件下測定APTT、PT、TT、Fib 結果。離心10 min 組為對照組。所有標本抗凝比例準確、無溶血、無采血不暢及凝固標本。

1.2.2 標本放置時間的影響 用一次性枸櫞酸鈉1∶9 真空抗凝管平行采集4 組各50 例血液標本，其中一組立即測定即為對照組，另外3 組分別于室溫條件下放置2 h、4 h 及6 h 后測定。

1.3 統計方法

采用SPSS17.0 統計軟件處理實驗結果,計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t 檢驗。

2 結果

2.1 離心時間對實驗結果的影響

標本在3 000 r/min 離心速度經5 min、8 min、10 min 不同時間離心后，檢測APTT、PT、TT、Fib。結果顯示，以標本離心10 min作為對照組相比，標本離心5 min 時APTT、PT 明顯縮短，與對照組相比差異有統計學意義（P<0.05），而TT、Fib 結果與對照組差異無統計學意義（P>0.05）；當離心時間為8 min 時，四項檢測結果均與對照組差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、表2。

表1 標本離心時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

表1 標本離心時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

注:*P<0.05。

項目離心時間10 min5 min t 值P 值APTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)36.5±2.9 14.1±1.2 17.5±1.3 4.17±0.5 31.9±2.7 10.8±0.9 16.9±1.5 4.13±0.6 35.500 22.483 1.555-1.108 0.001*0.002*0.260 0.416

表2 標本離心時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

表2 標本離心時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

項目離心時間10 min5 min t 值P 值APTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)36.5±2.9 14.1±1.2 17.5±1.3 4.17±0.5 36.1±3.2 13.8±1.1 17.3±1.7 4.15±0.8 2.774 1.250 0.693-2.029 0.109 0.338 0.560 0.180

2.2 標本放置時間對實驗結果的影響

檢測結果顯示，隨著標本放置時間的延長，對凝血四項的檢測結果有一定的影響。APTT 和PT 測定結果放置4 h、6 h 后與對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。見表3～5。

表3 標本放置時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

表3 標本放置時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

項目放置時間即刻2 h t 值P 值APTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)33.0±2.9 11.9±0.6 16.8±2.5 3.43±0.7 33.8±3.2 12.1±0.7 17.3±2.7 3.41±0.6 1.791-1.309 2.426-0.066 0.148 0.321 0.228 0.953

表4 標本放置時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

表4 標本放置時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

注:*P<0.05。

項目放置時間即刻2 h t 值P 值APTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)33.0±2.9 11.9±0.6 16.8±2.5 3.43±0.7 35.9±3.4 12.6±0.5 17.1±2.8 3.39±0.7-5.546-4.571-1.463 0.228 0.031*0.045*0.281 0.841

表5 標本放置時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

表5 標本放置時間對實驗結果的影響[n=50，（±s）]

注:*P<0.05。

項目放置時間即刻2 h t 值P 值APTT（s）PT（s）TT（s）Fib(g/L)33.0±2.9 11.9±0.6 16.8±2.5 3.43±0.7 36.5±3.2 12.8±0.6 17.5±2.3 4.45±0.5-7.913-5.237-0.450-3.493 0.016*0.035*0.679 0.073

3 討論

在凝血篩選檢測過程中，實驗結果受多種因素影響，如受血者狀態、標本采集量及采集過程是否順暢、抗凝比例、采集后放置時間與處理、儀器設備、檢測方法等多方面因素的影響[1]。因此有學者建議將凝血篩選檢測標準化，包括標本采集、保存及處理、試劑、報告方法的方面[2]。

APTT 是反應內源性凝血系統Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ因子水平比較敏感的指標及常用的篩選實驗，是檢測普通肝素的首選指標，對其實施準確的測定一方面能獲得最佳抗凝療效，且無嚴重的出血風險[3]。APTT 測定原理為在37 ℃的溫度條件下，以白陶土或鞣花酸激活Ⅻ和Ⅺ因子，以腦磷脂代替血小板第三因子（PF3），在Ca2+的參與下，觀察缺乏血小板的前提下血漿凝固所需要的時間。

PT 是反應外源性凝血系統凝血因子是否異常的較為敏感及常用的篩選實驗，是反應血漿中凝血酶原及因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平的首選指標，亦為口服抗凝劑檢測的首選指標。PT 測定原理為：在受檢血漿中加入過量的組織凝血活酶及Ca2+，使凝血酶原轉變為凝血酶，凝血酶能使Fib 轉變為纖維蛋白，此時血漿凝固。所檢測到的血漿凝固所需時間即為PT,可用于外源凝血系統檢測。該實驗需制備乏血小板血漿，因采用富含血小板的血漿進行實驗將導致PT 假性縮短，影響檢測結果[4]。TT 主要是對血中循環抗凝物質如肝素進行篩查，TT 的檢測原理是加入“標準化”凝血酶后血漿纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，至凝塊形成所需的時間。Fib常用于纖溶的篩查[5]。

《全國臨床檢驗操作規程》[6]對凝血四項標本前處理的要求為3 000 r/min 離心10 min 后分離血漿標本。因此本實驗以標本離心10 min 作為對照組。枸櫞酸鈉是鈣離子的快速螯合劑，對凝血因子Ⅴ、Ⅷ有保護作用，因此使用109 mmol/L 的枸櫞酸鈉作為抗凝劑，但是抗凝劑過多或過少都會影響檢測結果，因此必須保證血液標本與109 mmol/L 枸櫞酸鈉的比例為9∶1 抗凝。

血小板在機體凝血過程中發揮重要作用?；罨难“逄峁┑腜F3 是機體凝血過程的重要組成部分，提供了凝血的催化表面。體外檢測APTT 即是用腦磷脂代替血小板提供催化表面。用富含血小板的血漿檢測時，其凝血的磷脂催化表面增加，血小板表面吸附多種凝血因子，包括纖維蛋白原、凝血酶原、FⅦ、FⅨ、FⅩ。此外，血小板還有內源性凝血因子。如FⅤ、FⅧ/VWF、FⅪ、FⅫ。這些凝血因子在某些情況下被釋放，故血漿中相應凝血因子濃度升高，進而出現APTT、PT 檢測時間縮短，尤其是APTT的縮短比PT 更為明顯。APTT 的檢測是反應內源性凝血途徑的功能，而PT 是檢測外源性凝血途徑的功能，血小板提供的PF3參與內源性凝血途徑，形成復合FⅨ-FⅧa-Ca-PF3，并且具有對FⅩ活化、使凝血酶原轉變成凝血酶?；罨蜃英谘“迥ど辖Y合能夠使凝血反應加速，其催化凝血酶原轉變成凝血酶的能力比未結合活化因子Ⅹ快300 000 倍。此外血小板還對FⅧ具有濃縮作用，能夠促進FⅨ的活化。

采集后的標本必須經過離心處理主要目的就是為了獲得乏血小板血漿。因此離心速度和時間的不同將會導致凝血結果改變。如果離心時間較短，就不可能使標本達到乏血小板血漿的水平，影響檢測結果。因此如果能在保障檢測質量的同時縮短離心時間，工作速度將得到很大的提高。檢測結果顯示：以3 000 r/min 速度離心10 min 作為對照，標本離心5 min 時APTT、PT 縮短，與對照組差異有統計學意義（P<0.05），而TT、Fib 結果與對照組差異無統計學意義（P>0.05）；當離心時間為8 min 時，四項檢測結果均與對照組差異無統計學意義（P>0.05）。因此可建議將凝血檢測標準中標本前處理要求改為3 000 r/min 離心8 min 以提高檢測效率。

血液離體后即開始發生變化，并隨著存放時間和方式的不同，凝血因子會逐漸消耗而使檢驗結果改變。從表2 中可以看出，2 h 標本測定結果與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）；而APTT、PT 測定結果在4 h、6 h 與對照組相比差別有統計學意義；TT 和Fib 測定結果均無差異。所以，經離心分離后的凝血標本在室溫條件下保存時，APTT、PT 測定應在2 h 內完成，否則會因凝血因子失活而造成測定結果延長。由于Ⅱ、Ⅹ因子活性在室溫下幾乎無變化，故TT 在標本放置后變化很小[7]。

凝血篩選檢測的影響因素很多，人員素質、儀器設備都不可忽視。盡可能選用配套試劑，作好標本前處理，所有標本都須要在室內質控在控的前提下進行[8]。有學者發現溶血時PT、APTT均會顯著降低，TT 會顯著升高，而Fib 卻無明顯變化。出現這一現象的可能原因是：紅細胞表面磷脂具有凝血活酶的活性，從而改變了血漿的凝血時間[9]。

因此，凝血四項標本的規范操作和正確采集是凝血檢測結果準確的保證。樣本的正確采集是分析前質量保障的關鍵環節。為避免檢測結果與臨床診斷不符的情況出現，造成不必要的抽血復查，增加患者的負擔及醫療資源的浪費，建議在進行標本采集時，采集者需加強責任心，以嚴謹的態度采集、處理標本，最大限度減少誤差。操作人員的水平決定檢測系統能否輸出準確結果，故加強檢驗人員的專業素養，不斷提高其理論水平及專業操作技能是必不可少的。

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