不同分子量水牛乳酪蛋白酶解肽抗氧化活性的研究

李玲，曾慶坤，林波，唐艷，農皓如，黃麗，謝芳

(中國農業科學院廣西水牛研究所，南寧530001)

0 引言

制備高含量的活性肽產品，開發高營養、易吸收且具有生物學活性的乳肽產品，是乳品研究開發的重要方向[1-2]?；钚噪牡姆蛛x純化是一個較為復雜的過程，超濾膜分離是通過選擇一定截留分子量大小的超濾膜，對多肽的分子量進行初步分級，以得到一定分子量范圍的多肽。本文對實驗室自制的水牛乳酪蛋白酶解粗多肽進行透析脫鹽，并根據其分子量分布，超濾得到不同分子量范圍的肽組分，測定不同分子量范圍肽的抗氧化活性，以明確高活性肽的分子量范圍，為純肽段的分離純化及鑒定奠定基礎。

1 材料與設備

DPPH（Sigma-Aldrich），Tris（Solarbio），鐵氰化鉀，三氯化鐵，鹽酸，鄰二氮菲，無水乙醇，七水合硫酸化亞鐵，過氧化氫，EDTA，鄰苯三酚，磷酸二氫鈉，三氯乙酸均為分析純。水牛乳酪蛋白粗多肽1號，堿性蛋白酶酶解肽，實驗室自制。MWCO100D透析袋（美國光譜），MSC300超濾杯以及超濾膜，紫外分光光度計（美國Perkin Elmer）。

2 實驗方法

2.1 脫鹽及超濾分級流程

整體試驗設計流程如圖1所示。由圖1可以看出，對實驗室自制的水牛乳酪蛋白酶解粗多肽1號進行透析脫鹽，得到脫鹽后的多肽2號，測定多肽2號的分子量分布，選擇適宜的超濾膜，超濾后得到多肽3號以及多肽4號，測定不同分子量范圍肽組分的抗氧化活性。

圖1 脫鹽及超濾分級流程

2.2 脫鹽方法

將粗多肽1號配制成10%的溶液置于MWCO 100D透析袋中，浸泡在去離子水中于4℃下透析，每2 h換一次水，24 h后，將其進行冷凍干燥得到多肽2號樣品。

2.3 分子量分布測定方法

采用高效液相色譜法，參考陳園園等[3]。

2.4 超濾方法

將多肽2號配制成5%水溶液，在超濾杯中安裝超濾膜，控制壓力，超濾過程保持最大工作壓力0.22 MPa，得到不同分子量范圍的多肽。收集濾出液并濃縮、冷凍干燥，得到多肽3號與多肽4號。

2.5 抗氧化活性測定方法

（1）清除DPPH自由基的能力參考李玲等[4]方法。

（2）清除羥基自由基的能力參考陳學勤等[5]方法。

（3）清除超氧陰離子的能力參考汪建斌等[6]方法。

（4）還原能力參考Oyaizu等[7]的方法。

3 結果與分析

3.1 透析脫鹽

透析的目的是對得到的粗多肽進行簡單的純化，降低由于鹽的存在而對超濾分級和抗氧化活性實驗的影響。透析實驗后得多肽2號的鹽質量分數為3.62%，相比于粗肽1號鹽質量分數為20.91%，脫鹽率為82.96%，此時多肽2號的肽質量分數大于80%。

3.2 多肽2號分子量分布

測定水牛乳多肽2號的分子量范圍，為超濾分級中超濾膜的選擇提供數據參考。多肽2號的分子量分布如圖2與表1所示。由圖2和表1可以看出，99.9%的肽分子量小于3 ku，其中小于2 ku的達到99.14%，大于1 ku的達到89.04%，說明本實驗室自制的水牛乳酪蛋白酶解肽，水解充分，得到的肽分子量較低。根據多肽2號的分子量分布情況，選擇截留分子量為1 ku的超濾膜對不同分子量的多肽進行超濾分級，得到分子量小于1 ku和大于1 ku（1～3 ku）的兩個組分，命名為多肽3號和多肽4號。

圖2 多肽2號分子量分布

3.3 各分子量范圍肽組分抗氧化活性

天然產物的抗氧化活性需采用多種實驗系統進行綜合評價，而使用自由基捕獲體系，通常選用2-3種不同的自由基體系來考察抗氧化劑的自由基捕獲能力，本研究采用了DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子清除能力，結合還原能力，測定對比2.5，5.0，10.0，20.0 mg/g不同質量分數下，多肽3號與多肽4號的抗氧化能力，并以強抗氧化劑維生素C以及酶解肽的乳源蛋白，即水牛乳酪蛋白為對照。

表1 多肽2號分子量定量分布

圖3 DPPH自由基清除能力的比較

圖4 羥基自由基清除能力的比較

圖5 超氧陰離子清除能力的比較

圖6 還原能力的比較

清除DPPH自由基能力的測定結果如圖3所示。由圖3可以看出，相同質量分數下，清除能力的大小依次為Vc＞多肽3號＞多肽4號＞酪蛋白。除羥自由基能力的測定結果如圖4所示。由圖4可以看出，相同質量分數下，清除能力的大小依次為多肽3號＞Vc＞多肽4號＞酪蛋白，當質量分數達到20 mg/g時，多肽3號的清除率達到94.78%，遠大于酪蛋白，甚至高于Vc。超氧離子清除率的測定結果如圖5所示。由圖5可以看出，清除率大小依次為：Vc＞多肽3號＞多肽4號＞酪蛋白，質量分數為20 mg/g時多肽3號的清除率達到50.33%，相比于抗壞血酸明顯偏低。還原能力測定結果如圖6所示。由圖6可以看出，相同質量分數的抗氧化劑中，還原能力大小依次為Vc＞多肽3號＞多肽4號＞酪蛋白，質量分數為20 mg/g時，小于1 ku多肽的A值達到1.0091，水牛乳多肽的還原能力介于Vc和酪蛋白之間，其還原能力明顯高于酪蛋白，且分子量范圍越小，還原能力越大。

抗氧化活性測定結果表明：水牛乳酪蛋白酶解肽對DPPH自由基以及羥基自由基的捕獲能力較強，對清除超氧離子的捕獲能力相對較弱，其中多肽3號抗氧化活性高于多肽4號，且通過方差分析質量分數為20 mg/g時各分子量肽組分與酪蛋白抗氧化活性的差異，表明二者各抗氧化指標均顯著（P＜0.05）高于底物酪蛋白。董江濤等人[8]研究表明，分子量分布在1 ku以下的大豆多肽抗氧化能力表現較高，原因可能是小分子的多肽活性位點或基團更多地暴露在外，能充分與自由基等結合，所以多肽分子量的大小與抗氧化性有密切的聯系。目前已經從乳蛋白酶解物中分離得到的純肽段的分子量也多在1 ku以內，如，Suetsuna K等[9]得到的 YFYPEL，FYPEL，YPEL，PEL，EL 肽段；Contreras等[10]得到的LQKW，LDTDYKK肽段，劉志東等[11]得到的HIR肽段。本研究對不同分子量范圍的水牛乳酪蛋白酶解肽的抗氧化活性研究也表明，分子量在1 ku以內的肽段，其DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力以及還原能力均明顯強于分子量在1 ku以上的肽段（1～3 ku）。

4 結論

制備的水牛乳酪蛋白酶解肽分子量均小于3 ku，通過超濾對多肽分子量分級后，分子量在1 ku以內的水牛乳酪蛋白酶解肽，其DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力以及還原能力均強于分子量在1 ku以上的肽段（1～3 ku），且顯著高于（P＜0.05）酶解前的底物酪蛋白。

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