β-葡萄糖苷酶水解對遼東楤木嫩芽皂苷理化性質的影響*

顏廷才，張旋，斯琴，孟憲軍

(沈陽農業大學 食品學院，遼寧沈陽，110161)

遼東楤木(Aralia elata(Miq)Seem)屬于五加科楤木屬植物，又名龍牙楤木、刺嫩芽、樹龍牙等，主要分布在我國東北部，俄羅斯、日本、朝鮮等地。遼東楤木嫩芽營養豐富、口感好，屬山野菜中之珍品，號稱“天下第一山珍”［1］。遼東楤木嫩芽還含有較高的皂苷、醛類物質、生物堿、揮發油、膽堿、香豆精、鞣質、豆甾醇及β-谷甾醇等藥用成分，有消炎、利尿、強心、免疫和防癌等醫療保健作用［2-3］。由于皂苷的藥效廣泛而且顯著，近年來皂苷成為有機化學、天然產物化學、生物醫學的研究熱點［4］。遼東楤木嫩芽總皂苷的含量大約是人參皂苷含量的3倍，含量雖然高，但活性比人參皂苷小，并且遼東楤木嫩芽皂苷種類繁多，具體是哪一組分活性更高，目前沒有研究，這限制了遼東楤木嫩芽皂苷的應用［5］。目前遼東楤木嫩芽皂苷研究方向主要集中在遼東楤木嫩芽新皂苷種類的發現上，而對于遼東楤木嫩芽皂苷活性改進方面未見到相關報道。相關研究表明:β-葡萄糖苷酶等水解人參皂苷得到高抗癌活性的皂苷單體［6］，酸催化水解法、乙酞解法、降解水解法、光解法、堿裂解法和酶水解法等［7］也可以提高皂苷活性，這為提高遼東楤木嫩芽皂苷生物活性提供了理論依據與方向。本研究旨在通過β-葡萄糖苷酶水解遼東楤木嫩芽皂苷原料，探索β-葡萄糖苷酶水解后皂苷基本理化性質的變化，并采用紅外與紫外檢測來證實皂苷分子變化，希望找到提高遼東楤木嫩芽皂苷生物活性的方法，為擴大遼東楤木嫩芽皂苷應用提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遼東楤木嫩芽皂苷粗品，由本實驗室自制;齊墩果酸對照品(批號:110709-200304，供定性分析和含量測定用)，中國藥品生物制品檢定所;層析用硅膠，國藥集團化學試劑有限公司;β-葡萄糖苷酶為分析純，Sigma公司;甲醇為分析醇、乙腈為色譜純，Sigma公司;娃哈哈飲用純凈水。

1.2 儀器

SBA—100數控計滴自動收集器，青浦滬西儀器廠;玻璃層析柱，華美試驗儀器廠;RE—52型旋轉蒸發儀，博通儀器廠;HL—2S恒流泵，青浦滬西儀器廠;DEF真空干燥箱，上海精宏試驗設備有限公司;KQ-100DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;FT-IR200型傅立葉變換紅外光譜儀，THERMO公司;TDL-5000B型離心機，安亭儀器廠;微量進樣器(25 μL)，安亭微量進樣器廠;UNICUV-4802H紫外可見分光光度計，上海分析儀器廠;FA2004電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硅膠柱分離遼東楤木嫩芽皂苷組分

樣品膠制備:稱取經過純化的β-葡萄糖苷酶酶解前后遼東楤木嫩芽皂苷樣品各500 mg和4 g過60～100目篩的硅膠，分別放入研缽中研磨，倒入5 mL甲醇攪拌，遼東楤木嫩芽皂苷被硅膠吸附。

濕法裝柱:使用前硅膠G于110℃活化1 h。先用一小塊脫脂棉堵住柱底，將30 g過200～300目篩的硅膠在甲醇溶劑中充分溶脹后除去氣泡，將硅膠的糊狀物慢慢陸續不斷地倒入層析住中至距柱頂約10 cm，放置過夜，使硅膠沉降，保持展開劑界面高于硅膠界面。沉降完畢把樣品膠緩慢的倒入柱上端［8］，保持交界面平整。

洗脫:硅膠柱裝好后用甲醇洗脫，按時間30 min收集一份分別收集，共收集6份樣品，分別經過旋轉蒸發、真空干燥得到不同組分的固體粉末，按照時間先后分別命名1～6，酶解后為E1～E6。

1.3.2 高效液相色譜檢測定樣品中齊墩果酸含量

儀器:美國 Waters1525 Binary HPLC Pump，Waters2487 Dual λ Absorbance Detector，Waters Breeze 色譜工作站;色譜柱:Eclipes XDB-C18(4.6mm×150mm，5 μm)。

進樣量:10 μL(樣品濃度1 mg/mL);流動相:乙腈∶水(體積比85∶15);流速:1.0 mL/min;檢測器波長:215 nm;溫度為30℃;數據處理:外標法峰面積定量［9］。

樣品預處理:樣品各10 mg用1 mL 1 mol/L的H2SO4水解后再用Na2CO3中和蒸干后，分別溶于10 mL甲醇中，進樣時用0.45 μm濾膜過濾。

1.3.3 對羥基自由基的清除作用

水楊酸法［10］:按照 Smirnof(1989)的方法，(1)羥自由基的產生:在10 mL刻度具塞試管中加入10 mmol/L水楊酸0.5mL，0.4 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液 3 mL，3.8 mmol/L Fe(Ⅱ)的 EDTA溶液 0.5 mL，加入4 mmol/L的H2O21 mL啟動反應，于25℃恒溫水浴中放置90 min。

(2)羥自由基的測定:加6 mol/L HCl結束反應，再加入0.5 g NaCl，滴加去離子水至6 mL刻度處，混勻。加入冷的乙醚4 mL，充分混勻，靜置后移取上層乙醚3 mL于10 mL刻度離心管中，將離心管置于40℃恒溫水浴中，將乙醚蒸發至干，加入0.15 mL 10%三氯乙酸，0.25 mL 10%鎢酸鈉，0.25 mL 0.5%NaNO2，放置5 min后，加入0.25 mL 1 mol/L KOH，滴加去離子水至4 mL，混勻，于510 nm處測定其吸光度A0，同時做空白試驗。

(3)OH·清除率的測定:在(1)的體系中加入清除劑，按(2)的方法測定吸光度AS，按下式計算:

1.3.4 對O2-·自由基的清除作用

鄰苯三酚法［11］:取 pH 8.2的 Tris-HCl-EDTA 緩沖液于4.5 mL比色管中，于25℃恒溫10 min，再加入25℃恒溫的45 mmol/L的鄰苯三酚溶液10 μL，混勻后迅速倒入1 cm石英比色杯，于325 nm下每隔30 s測1次光密度值，共測定4 min，求出鄰苯三酚自氧化速率ΔA0，同時用鹽酸作空白試驗。在上述體系中加入鄰苯三酚之前加一定體積的皂苷溶液，混勻于325 nm下測其光密度變化ΔAS，計算清除率。

1.3.5 遼東楤木嫩芽皂苷紫外光譜的測定

取經真空干燥的β-葡萄糖苷酶酶解前后遼東楤木嫩芽皂苷各10 mg用甲醇溶解，配制成濃度1 mg/mL的溶液，用UNICUV-4802H紫外可見分光光度計測定其紫外光譜吸收的特點［12］。

1.3.6 遼東楤木嫩芽皂苷紅外光譜測定

取經真空干燥的β-葡萄糖苷酶酶解前后遼東楤木嫩芽皂苷各2 mg與干燥KBr100 mg，磨碎混勻后30 MPa下壓片，用FT-IR200型傅立葉變換紅外光譜儀測定其紅外光譜吸收特點［13］。詳細圖譜檢索所用的圖譜庫為:奧爾德利希凝相樣品庫、奧爾德利希氣相樣品庫、喬治亞州罪犯實驗室樣品庫、無角聚合體樣品庫、拉曼有機樣品庫、Sigma生物樣品庫［14］。

2 結果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷感官指標影響

遼東楤木嫩芽皂苷經提純和干燥以后，形成了紅棕色的粉末，在陽光下有明顯的反光現象，說明有晶體存在。聞起來有香甜的焦糖味道，在空氣中容易吸濕，溶液為紅褐色，溶解度較小，易溶解于熱水和酸性溶液中，溶液黏稠而有甜味，攪拌容易產生泡沫。經過β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽皂苷，顏色明顯變淺，為淺黃色粉末，無明顯晶體，反光性能差，無明顯吸濕性，溶解速度較快且溶解度較大，溶液黏稠度下降，有清新的清涼味略帶甜味，攪拌產生豐富的泡沫。主要感官指標比較如表1。分析原因可能是由于遼東楤木嫩芽皂苷主要是由三萜酸類皂苷元與單糖連接形成皂苷，遼東楤木嫩芽皂苷含有豐富的單糖，在濃度或者溫度較高情況下，單糖會有部分聚合［15］，所以會有較深的焦糖顏色和風味，糖含量高，溶液黏稠，不容易溶解。經過β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽皂苷的葡萄糖被水解掉，分子明顯縮小，顏色變淺，黏性變小，溶解速度提高;由于分子變小，糖組分減少，揮發程度提高，所以刺激氣味變強烈，甜味降低。

表1 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷主要感官指標影響Table 1 Effect of hydrolyzation of β-glucosidase on main sensory indexs of aralosides

2.2 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷組分分離的影響

遼東楤木嫩芽皂苷6個樣品組分，干燥后的樣品均為棕紅色粉末，有特殊的香氣味，有反光顯現，有晶體出現，遇到冷水變黏稠漿狀，溶解比較慢，能夠溶于水，水溶液為淡褐色，有刺激性的氣味并帶有香甜味。6組分的質量比例為:34.3%、21.1%、16.9%、15.1%、7.9%、4.7%。按色譜條件定量測定，6個樣品的齊墩果酸含量分別為45.6%、36.1%、31.4%、10.7%、26.6%、25.5%，遼東楤木嫩芽總皂苷里的齊墩果酸含量為33.5%，可見，遼東楤木嫩芽總皂苷與6個組分皂苷內齊墩果酸含量還都是很豐富的［16］。

同樣收集經β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽皂苷6個組分，按照時間先后分別命名E1～E6，干燥后的樣品也均為有色粉末，E1樣品顏色有點暗綠，樣品E2、E3顏色為淺黃，后面3個樣品為深棕褐色粉末，都有強烈的特殊的香氣味，前3個屬于清淡味道，后3個樣品有香甜味道;都有更大的晶體和大晶體反光顯現，比酶解前更容易溶于冷水，水溶液為黏稠漿狀，但比酶解前黏度下降，水溶液顏色是更淡的褐色，刺激性的氣味比酶解前更強烈并帶有微弱香甜味。β-葡萄糖苷酶酶解后E1～E6各組分的質量比例為:34.8%、24%、11.8%、11.3%、8.1%、10%，齊墩果酸含量分別為50.6%、40.1%、34.9%、11.9%、29.5%、28.3%，β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽總皂苷里的齊墩果酸含量為37.2%，含量提高。

2.3 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷OH·清除的影響

由圖1、2中可知，皂苷溶液在較低濃度時對OH·就有一定的清除作用，濃度為0.25 mg/mL時清除率達到50.65%，隨著溶液濃度的增大其清除自由基的能力逐漸增強，皂苷濃度達到1.00 mg/mL對OH·的清除率達到76.75%，而經β-葡萄糖苷酶酶解后皂苷對OH·的清除率明顯提高，濃度為1.00 mg/mL時清除率達到82.49%?？梢?，羥基自由基的清除效果與皂苷的濃度呈顯著正相關性，β-葡萄糖苷酶酶解可顯著提高皂苷羥基自由基的清除效果［17］。

圖1 刺嫩芽皂苷對羥基自由基的清除Fig.1 The·OH radical scavenging activity of aralosides

圖2 刺嫩芽皂苷對羥基自由基的清除Fig.2 The·OH radical scavenging activity of hydrolyzed aralosides

2.4 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷O2-·清除的影響

由圖3和圖4可知，皂苷溶液在較低濃度時對O2-·就有一定的清除作用，濃度為0.5 mg/mL時的清除率就達到46.35%，隨著溶液濃度的增大其清除自由基的能力逐漸增強，皂苷濃度達到1.00 mg/mL的清除率達到79.46%，而經β-葡萄糖苷酶酶解后皂苷對氧自由基的清除率明顯提高，濃度為1.00 mg/mL時清除率達到82.26%?？梢?，氧自由基的清除效果與皂苷的濃度呈顯著正相關性［18］，β-葡萄糖苷酶酶解可顯著提高皂苷氧自由基的清除效果。

圖3 刺嫩芽皂苷對O2-·的清除Fig.3 The O2-radical scavenging activity of aralosides

圖4 刺嫩芽皂苷對O2-·的清除Fig.4 The O2-radical scavenging activity of hydrolyzed aralosides

2.5 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷紫外吸收的影響

由圖5可以看到，遼東楤木嫩芽總皂苷的紫外吸收圖譜里有6個比較明顯的吸收峰，其中在299 nm處的吸收峰最大，吸光值達到0.95，說明遼東楤木嫩芽總皂苷里含有多個皂苷單體，分子比較大［19］。

由圖6可以看到，β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽總皂苷的紫外吸收明顯向低波長靠近，有5個比較明顯的吸收峰，其中在236 nm處的吸收峰最大，說明β-葡萄糖苷酶能夠酶解總皂苷，水解下葡萄糖分子，使皂苷單體分子明顯變小，單體數量減少。

2.6 β-葡萄糖苷酶酶解對遼東楤木嫩芽皂苷紅外吸收的影響

由圖7可以看到，遼東楤木嫩芽總皂苷分別在波數為3 373、1 075與2 939、1 388處有明顯吸收，經過基礎圖譜分析可以判斷所對應的官能團分別為脂肪族伯醇、脂肪烴［20］;經詳細圖譜檢索，此圖譜與異麥芽糖的匹配度達到48.27，與β-D-半乳糖的匹配度達到47.10，說明總皂苷含有帶羥基的長碳鏈、異麥芽糖和β-D-半乳糖。

圖5 遼東楤木嫩芽總皂苷的紫外掃描圖Fig.5 The ultraviolet scan chart of the aralosides

圖6 酶解后遼東楤木嫩芽總皂苷的紫外掃描圖Fig.6 The ultraviolet scan chart of the hydrolyzed aralosides

由圖8可以看到，β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽總皂苷分別在波數為3 300、1 609、750與2 931、1 416及3 397、1 076處有明顯吸收，經過基礎圖譜分析可以判斷所對應的官能團分別為脂肪族伯胺、脂肪烴、脂肪族仲醇，脂肪族羧酸，不飽和脂肪酸［21］;經詳細圖譜檢索，此圖譜與異麥芽糖的匹配度達到53.27，與β-D-半乳糖的匹配度達到53.52，與β-D-苯基葡糖苷的匹配度達到44.89，說明總皂苷含有帶羥基或氨基的長碳鏈、異麥芽糖、β-D-苯基葡糖苷和β-D-半乳糖成分，這證明β-葡萄糖苷酶水解掉部分單糖，裸露出了羧基與長的碳鏈［22］。

3 結論

經過β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽皂苷分子中的葡萄糖被水解掉，分子明顯縮小，顏色變淺，溶解速度明顯提高，溶液黏稠度下降，糖組分減少，甜味降低，焦糖風味消失，由于分子變小，揮發程度提高，刺激氣味變強烈。

圖7 遼東楤木嫩芽總皂苷的紅外掃描圖Fig.7 The infrared scan chart of the aralosides

圖8 酶解后遼東楤木嫩芽總皂苷的紅外掃描圖Fig.8 The infrared scan chart of the overall hydrolyzed aralosides

經過硅膠柱分離后的遼東楤木嫩芽皂苷6個樣品干燥后的感官特征與總皂苷類似，6組分的質量比例為:34.3%、21.1%、16.9%、15.1%、7.9%、4.7%，齊墩果酸含量分別為 45.6%、36.1%、31.4%、10.7%、26.6%、25.5%，遼東楤木嫩芽總皂苷齊墩果酸含量為33.5%。經β-葡萄糖苷酶酶解后遼東楤木嫩芽皂苷6個樣品為有色粉末，E1樣品為暗綠色，樣品E2、E3為淺黃色，味道清淡，后面3個樣品為深棕褐色粉末，味道香甜，都有強烈的特殊香氣味;都有更大的晶體和大晶體反光顯現，比酶解前更容易溶于冷水，水溶液為黏稠漿狀，但黏度下降;質量比例為:34.8%、24%、11.8%、11.3%、8.1%、10%，齊墩果酸含量分別為 50.6%、40.1%、34.9%、11.9%、29.5%、28.3%，酶解后遼東楤木嫩芽總皂苷里的齊墩果酸含量為37.2%。

皂苷溶液在較低濃度時對OH·與O2-·就有一定的清除作用，隨著溶液濃度的增大其清除自由基的能力逐漸增強，羥基自由基與氧自由基的清除效果與皂苷的濃度呈顯著正相關性，β-葡萄糖苷酶酶解可顯著提高皂苷羥基自由基的清除效果。

紫外吸收圖譜表明:遼東楤木嫩芽總皂苷經β-葡萄糖苷酶酶解后最大吸收峰從299 nm處降低到236 nm處，紫外吸收明顯向低波長靠近，紫外吸收峰減少1個。證明β-葡萄糖苷酶水解掉部分單糖，使皂苷單體分子明顯變小，單體數量減少。

紅外光譜研究表明:遼東楤木嫩芽總皂苷經β-葡萄糖苷酶酶解后，在3個波數處有了明顯吸收，經過基礎圖譜分析可以判斷所對應的官能團分別為脂肪族伯胺、脂肪族羧酸，不飽和脂肪酸;經詳細圖譜檢索，結構多了β-D-半乳糖成分，證明了β-葡萄糖苷酶水解掉部分葡萄糖，裸露出了β-D-半乳糖、羧基與長的碳鏈。

試驗證明，β-葡萄糖苷酶水解掉遼東楤木嫩芽總皂苷分子中部分葡萄糖，改變其物理化學特性，提高其清除自由基能力，這為提高遼東楤木嫩芽總皂苷活性提供參考。

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