自然發酵甜面醬中耐高溫生香酵母的鑒定與揮發性香氣成分分析*

石嬌嬌，張建軍，鄧靜，鄧毛程，吳華昌

1(四川理工學院，四川自貢，643000) 2(廣東輕工業職業技術學院，廣東廣州，510300)

自然發酵甜面醬是面粉經過高鹽拌曲，日曬夜露而成的傳統調味品，其口感濃郁，細膩可口，以獨特的酯香和醬香味而深受消費者歡迎［1］。在甜面醬風味形成的過程中酵母菌起到了至關重要的作用，其發酵產生的乙醇和細菌發酵產生的有機酸在酯化酶的作用下反應生成酯類，形成風味成分的主體［2］。

生香酵母是一類能夠代謝產生香氣成分的酵母菌的總稱，發酵過程中除參與醛縮醇類、含硫化合物等香氣成份的生成外，還一定程度地參與氨基酸和有機酸類的生成，因此能顯著增加食品的香氣成份［3］。目前研究人員對生香酵母的應用已做了較多嘗試，Thin Thin Wah［4］等將 Pichia guilliermondii和 Zygosaccharomyces rouxii共培養添加到泰國豆醬中，發酵2個月的樣品中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯含量分別提高了1.8、4.2倍，豆醬特征性香氣成分 HEMF 也提高了2.5 倍;Jie feng［5］等發現 Candida etchellsii能夠大量產生酒石酸、蘋果酸等有機酸，也能夠大量合成豆醬中獨特的香味成分—愈創木酚(4-EG)。曾鵬［6］利用嗜殺型生香酵母成功將清酒中的總酯含量提高了50%。因此將生香酵母添加到發酵食品中對改善產品風味，提高產品質量，具有重大的實踐意義。然而關于甜面醬中生香酵母的研究則比較少，曾燦偉［7］確定了自然面醬中僅存在釀酒酵母且具有較強的產醇能力，重要的酯類物質是由前期霉菌產生的。孟鴛［8］等證明了隨著溫度的升高，酯類物質逐漸減少，而醛類物質逐漸增多。因此目前對于甜面醬中生香酵母的研究較為籠統，對特定菌株的相關揮發性香氣成分也未見報道。

在實際發酵過程中甜面醬醬醅的溫度可達到45～50℃［9］，這將嚴重抑制生香酵母的生長和代謝，所以應用于甜面醬生產中的生香酵母菌必須具有一定的耐高溫性。因此篩選耐高溫生香酵母并研究其高溫下代謝產生的香氣成分，對甜面醬的實際工業化生產具有重要的現實意義。

本實驗選擇已發酵7個月的甜面醬樣品篩選耐高溫生香酵母，進行了菌種分類鑒定以及高溫發酵產物中的揮發性香氣成分的初步分析，明確了不同生香酵母菌株的揮發性香氣成分和相對含量，為其在甜面醬工業生產中的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品和培養基

甜面醬:四川省自貢市某食品有限公司2012年8月樣品(發酵7個月)。

孟加拉紅培養基:蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂 2%，1/3000 孟加拉紅溶液10%，補足蒸餾水，分裝121℃滅菌20 min。氯霉素0.01%用少量乙醇溶解，加入已滅菌的45～50℃培養基中，制備平板。

YPD培養基:酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，自然pH。

豆芽汁培養基:稱取100 g黃豆芽，加水1 000 mL煮沸30 min，用紗布過濾，放入20 g葡萄糖加熱溶解后，分裝121℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 生香酵母的篩選

1.2.1.1 耐高溫酵母菌的篩選

準確稱取5 g甜面醬于45 mL無菌水中，置于搖床45℃，150 r/min培養30 min。用移液槍準確吸取1 mL上清液做十倍梯度稀釋，取不同濃度的稀釋液100 μL涂布到孟加拉紅平板培養基上，在恒溫培養箱中45℃培養2～3 d，挑取疑似酵母菌株的單菌落鏡檢、純化并保藏。

1.2.1.2 生香能力研究

挑取1環斜面耐高溫酵母接種至50 mLYPD培養基中，28℃恒溫培養20 h，制成種子液。按2%的接種量，接種到豆芽汁液體培養基中，于45℃恒溫靜置培養5 d，嗅聞法確定是否產香［10］。

1.2.1.3 生香酵母的鑒定

參照《真菌鑒定手冊》［11］及《酵母菌的特征與鑒定手冊》［12］對耐高溫生香酵母進行形態學和生理生化鑒定，相關生理生化實驗包括糖發酵、碳源/氮源同化、高糖發酵、脲酶和石蕊牛奶實驗。

1.2.2 頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法檢測生香酵母的揮發性香氣成分

1.2.2.1 頂空固相微萃取方法條件

準確量取6 mL發酵液于15 mL頂空瓶中恒溫(60 ℃)水浴，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中平衡5 min后吸附30 min(在固相微萃取裝置上實現)，后將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min，進行GC-MS分析(攪拌速度600 r/min)，測定生香酵母發酵液中的揮發性香氣成分。

1.2.2.2 定性與定量分析

實驗數據處理由GC-MS數據分析軟件系統完成，未知化合物經計算機檢索同時與NSIT譜庫和RTLPEST譜庫相匹配，僅當匹配度大于800(最大值為1 000)的鑒定結果才予以報道。采用峰面積歸一化法定量計算出各揮發性成分的含量。

1.2.2.3 GC-MS 條件

色譜條件:毛細管色譜柱Agilent HP-INNOWax(60 m ×250 μm，0.25 μm);手動無分流進樣，進樣口溫度250℃;程序升溫:初始溫度45℃，保留3 min，以10℃/min的速率升至200℃，保留5 min;檢測器溫度250℃;載氣He，流速1 mL/min。

質譜條件:EI電離源，電子能量70 eV，掃描范圍10～450 u，離子源溫度230℃;接口溫度250℃。

1.2.3 篩選不同菌株主體香氣成分

根據風味貢獻率理論，即香氣物質的濃度或相對含量與香氣閾值的比值確定特征香氣的方法，從生香酵母高溫發酵產生的揮發性香氣成分中篩選出主體香氣。

2 試驗結果

2.1 耐高溫生香酵母的篩選

根據酵母菌具有出芽生殖這一典型特征，按照1.2.1.1的方法從自然發酵甜面醬中篩選出15株在45℃高溫下生長良好的的酵母菌株(菌株生長相關數據另行發表)，進一步做產香能力研究，結果如表1所示。耐高溫菌株Y1、Y4、Y5、Y7、Y9和 Y11在豆芽汁培養基中45℃高溫發酵5 d后能夠產生濃郁的香氣，Y2、Y8、Y10、Y12、Y14 和 Y15 產生的香氣較濃，Y6和Y13產生較淡的香氣，而Y3發酵產生的香氣最弱。

表1 耐高溫菌株產香能力研究Table 1 The aroma-producing capacity study of yeast strains resistant to high temperature

2.2 生香酵母的鑒定

2.2.1 菌落形態及個體形態

劃線培養已純化的耐高溫生香酵母，于28℃恒溫培養24 h，肉眼觀察酵母菌株的菌落形態，顯微鏡下觀察酵母的細胞形態及生成孢子的情況，結果如表2所示。

表2 生香酵母的菌落及個體形態Table 2 The colonies and individual shapes of aroma-producing yeast strains

2.2.2 生理生化鑒定

對照《真菌鑒定手冊》及《酵母菌的特征與鑒定手冊》對6株耐高溫生香酵母進行生理生化鑒定試驗，鑒定結果如表3所示。

表3 生香酵母的生理生化鑒定Table 3 The physiological and biochemical identification of aroma-producing yeast strains

依據《真菌鑒定手冊》及《酵母菌的特征與鑒定手冊》和各分離菌株的形態特征、生理生化特征，初步將分離菌種Y1、Y4、Y5歸類為漢遜酵母(Hansenula)，Y7、Y9 為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Y11為紅酵母(Rhodotorula)。

2.3 高溫發酵代謝產物中揮發性成分的分析

在豆芽汁培養基中高溫發酵篩選出來的6株耐高溫生香酵母，利用頂空固相微萃取-氣質聯用技術檢測發酵液中的揮發性香氣成分，結果如表4所示。

由表4可知，不同生香酵母高溫發酵產生的揮發性香氣成分的種類和含量存在極大差異。產生揮發性香氣成分種類和相對含量最大的均為Y7，共檢測出7種化合物，香氣成分占總揮發性成分總量的94.05%，其中乙醇的相對含量最高，但閾值也最高(14 000 mg/L)，因此香氣值遠遠小于其他香氣成分;辛酸乙酯(閾值1 mg/L)和己酸乙酯(閾值1.3 mg/L)的含量相對較高，且閾值較低，因此香氣值相對較大;醛類物質的閾值相對較高且含量較小，因此菌株Y7高溫發酵的主體香氣成分是辛酸乙酯，其次為己酸乙酯。香氣成分占總揮發性成分比例稍稍低于Y7菌株的是Y1(89.08%)，其中己酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯(閾值1.5 mg/L)和辛酸乙酯的相對含量占據絕對優勢，香氣值最大;癸酸乙酯的閾值雖然也較低(1.5 mg/L)，但其相對含量僅為0.14%，香氣值最低;2-戊基呋喃屬于雜環類物質，閾值一般高于酯類物質且相對含量較低，香氣值也較低，因此菌株Y1最主要的香氣成分是己酸乙酯，其次為乙酸-3-甲基丁酯。菌株Y5和Y11高溫發酵產生的香氣成分所占比例相當，其中Y5產生的辛酸乙酯和3-羥基丁酮所占比例相對較大，但比較相對含量和閾值可知，菌株Y5和Y11最主要的香氣成分均為辛酸乙酯。菌株Y9高溫發酵除了產生香氣值最大的辛酸乙酯外，還能夠產生苯乙醇、苯甲醛和癸酸乙酯，但三者的閾值較高，且含量遠遠低于辛酸乙酯，因此菌株Y9的最主要的香氣成分也是辛酸乙酯。Y4高溫發酵只檢測得到2種香氣成分，占總揮發性成分的24.31%，其中己酸乙酯是最主要的香氣成分。

隨著發酵過程的進行，不同菌株發酵終產物組成趨于穩定，酯類物質成為主要的香氣成分，為甜面醬增酯添香。不同菌株能夠特異性產生相關香氣成分，其中乙酸-3-甲基丁酯僅在Y1發酵過程中產生。2-甲基丙醇和庚烯僅在Y5發酵過程中產生，前者為傳統發酵食品中重要的芳香雜醇，常通過類似魯氏接合酵母中的Ehrlich途徑產生，后者是一種極不穩定的果香烯烴類，可通過氧化或還原形成較為穩定的大分子香氣化合物。壬醛僅在菌株Y7發酵過程中產生，是一種重要的食品添加劑和常用香料，性質也較為穩定。在自然發酵甜面醬中，不同生香酵母的代謝途徑相互交錯，產生更為復雜的代謝產物，對甜面醬的風味形成至關重要。

表4 耐高溫生香酵母發酵代謝產物中揮發性香氣成分的檢測Table 4 Detection of metabolism of aroma-producing yeast strains resistant to high temperature

3 討論

本實驗從自然發酵甜面醬中篩選得到了6株能夠耐受45℃且正常生長的生香酵母，通過形態學和相關生理生化鑒定，初步鑒定3株為漢遜酵母，2株為釀酒酵母，1株為膠紅酵母。利用頂空固相微萃取-氣質聯用技術檢測了生香酵母高溫發酵代謝產物的差異，確定了不同菌株高溫下的主體香氣情況，其中Y1和Y4最主要的香氣成分為己酸乙酯，而其余菌株最主要的香氣成分均為辛酸乙酯，從而為菌株在甜面醬中的工業化應用奠定基礎。然而除了已知的生香作用外，生香酵母在不同發酵食品中還有很多其他的功能。

漢遜酵母除了能夠促進豆醬特征香氣成分(如4-愈創木酚、乙酸乙酯、HEMF)的形成，其自身也能夠合成異丙醇、異戊醇等高級醇，糠醛、苯甲醛等醛類，從而影響豆醬中的香氣平衡，目前在韓國大醬［13］、醬醪［14］、中國黃豆醬［15］中都已分離得到。漢遜酵母常和乳酸菌共培養作為發酵劑在干酪［16］、香腸［17］等發酵過程中已有應用，可以顯著提高發酵食品的風味，同時縮短生產周期。在酒類釀造和工業酒精生產中，釀酒酵母發揮了舉足輕重的作用。近年來對釀酒酵母生產油脂、為醬類食品增酯增香能力的研究也大大提高了其應用價值。高玉榮［18］等在豆醬快速釀造工藝后發酵期添加釀酒酵母，縮短了后發酵時間并促進乙醇等風味物質的形成，使成品在較短的時間內形成醬品所特有的醇香及酯香。紅酵母能產生丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸［19］，這些氨基酸構成發酵食品的主要鮮味成分;能發酵產胡蘿卜素［20］，使發酵食品具有安全誘人的色澤。但有關紅酵母應用到食品中產香的研究還未見報道。本實驗中紅酵母高溫發酵產生辛酸乙酯等閾值極低的揮發性香氣成分，己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮和2-戊基呋喃等常見的香氣成分，在甜面醬高溫醬醅發酵中具有極大的應用前景。

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