水酶法提取大豆油的擴大試驗研究

韓宗元 江連洲 李 楊 齊寶坤 王勝男 王 曉 陳 勇

（東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030）

（沈陽工學院生命工程學院2，撫順 113122）

水酶法提取大豆油的擴大試驗研究

韓宗元1，2江連洲1李 楊1齊寶坤1王勝男1王 曉1陳 勇1

（東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030）

（沈陽工學院生命工程學院2，撫順 113122）

水酶法提取大豆油的研究已經取得了很大的進步，因此在實驗室規?；A上，進行了水酶法提取大豆油的擴大試驗。在10 L反應釜中，每次試驗需要1.2 kg的擠壓膨化大豆片。通過單因素和響應面試驗對加酶量、pH、酶解溫度、酶解時間和料液比進行參數優化，得出最優結果：加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04，油脂提取率（69.02±0.55）%。并且，通過透射電鏡和光學顯微鏡觀察、研究，揭示出水酶法提取大豆油的釋放機理，以便于提高水酶法的油脂提取率和油的品質。最后，通過比較水酶法和溶劑浸提法，結果表明：水酶法提出的大豆油品質更好，過氧化值更低。

大豆油 水酶法 擴大試驗 油脂提取率

有機溶劑浸提中使用的正己烷是由多種同分異構體組成，易燃易爆，且利用不可再生資源生產的有機溶劑。由于正己烷能夠破壞環境，因此人們渴望找到可以替代有機溶劑提取的方法，逐漸對水代法產生了濃厚的興趣，因為水代法不僅沒有有機溶劑，還能同時獲得油脂和蛋白［1-3］。

雖然水代法可以替代溶劑萃取法，但是水代法有許多難題要解決，包括提取率低和產生大量乳狀液等。在實驗室規模試驗中，水代法提取率低，所以酶［5-6］和機械處理可以應用到水代法中提高提取率。機械處理包括壓片和擠壓膨化［4，7］。酶能夠起到破壞細胞壁和磷脂膜結構的作用，因此加入各種酶的水代法應用于大豆［8］，油菜籽［10］，椰子［11］，葵花籽［12］等油的浸提中。所以，水酶法可以很好地解決水代法的困難，而且達到較高地提取率和破乳率。水酶法提取大豆油可以通過破乳來提高油脂的提取率，破乳方法包括酶法破乳和化學法破乳等［4］。

在實驗室規?；A上，通過水酶法提取大豆油的擴大試驗，盡可能提高油脂提取率并且簡單易行、以期為工業化生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全脂大豆壓片：吉林豐正大豆食品有限公司；Protex6L堿性蛋白酶：諾維信公司；氫氧化鈉、鹽酸、乙醚、石油醚、氫氧化銨、95%乙醇、酚酞 分析純：天津迪博化工股份有限公司。

10 L真空反應釜、低速離心機、高速冷凍離心機：鄭州長城科工貿有限公司；pHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；大功率粉碎機：東北農業大學；振蕩過篩機：新鄉市大漢振動機械有限公司；擠壓膨化機：黑龍江省農業科學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 水酶法擴大試驗提取大豆油方法

擠壓膨化機將全脂大豆片擠壓膨化，再經過粉碎機粉碎，過60目篩后，取1.2 kg物料加入到真空反應釜中，加水調節使料液比達到1∶6。用2 mol／L氫氧化鈉調節混合液pH到9.5，然后加物料質量2.5%的Protex 6L，使溫度保持在55℃，反應進行3 h［4，9］。酶解后，混合液在超高速低溫離心機離心 20 min，轉速14 400 r／min。離心后，將最上層的游離油萃取出來，再將乳狀液收集，放入4℃冰箱內保存，然后再進行破乳，將破乳油和游離油收集到一起。

1.2.2 單因素試驗

通過研究酶解參數，即酶解時間、酶解溫度、料水比、pH、加酶量，確定4個因素不變，只改變1個因素，來確定各因素對油脂提取率的影響。各因素的范圍如下：pH 8～10，加酶量0.5%～3.0%，酶解時間2～4 h，酶解溫度45～65℃，料液比3～7。

1.2.3 響應面試驗

響應面試驗在單因素研究的基礎上，選取pH、加酶量、酶解時間、酶解溫度、液料比5個因素為自變量，以油脂提取率為響應值，根據中心組合設計原理，設計響應面分析試驗，其因素水平編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表

1.2.4 油脂提取率測定

物料的含油率通過AOAC 922.06方法測定，乳狀液含油率也通過AOAC 995.19法測定［13］。

1.2.5 透射電鏡和光學顯微鏡測定

通過透射電鏡和光學顯微鏡可以觀察到細胞內部結構，利用東北農業大學DX-201透射電鏡和Zeiss LSM710光學顯微鏡進行試驗，觀察乳狀液中蛋白和脂肪變化情況［14-15］。

透射電鏡：前固定→漂洗→后固定→漂洗→50%乙醇脫水→70%乙醇脫水→90%乙醇脫水→100%乙醇脫水→100%乙醇和100%丙酮（1∶1）脫水→100%丙酮脫水→純丙酮和包埋液浸透→包埋→聚合→修快→超薄切片機切片→染色→觀察、拍片。

光學顯微鏡：0.2%考馬斯亮藍（R250）和蘇丹III染液分別對蛋白和油脂切片進行染色，染色后，通過光學顯微鏡觀察。

1.2.6 油脂的品質分析

2 kg全脂大豆片用正己烷浸提8 h，再用旋轉蒸發儀去除正己烷，得到大豆油［18］。根據水分及揮發物、折光指數、色澤、酸值、游離脂肪酸含量、過氧化值、p-茴香值、不皂化物、磷含量等指標比較正己烷浸提法和水酶法提取的大豆油的品質［17-19］。

1.2.7 脂肪酸分布測定

通過哈爾濱工程大學的HITZB-638氣相色譜質譜聯用儀進行檢測［18］。

1.3 數據處理

所有試驗數據均為“平均值±標準差”，n＝3。采用SAS9.13統計分析軟件對試驗數據進行分析；差異顯著性采用SPSS19 Duncan檢驗法，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 擴大試驗的酶解條件對水酶法油脂提取率的影響

Rosenthal等［5］對酶解參數進行了研究，它能對油脂提取率起到巨大的影響。因為他們能影響細胞壁結構的破壞，并使酶達到最大的活性。研究指出擠壓膨化大豆片通過水酶法提取大豆油，油脂提取率達到 50%～70%［8］。

圖1a表示不同pH對油脂提取率的影響。隨著pH值增大，提取率先增大再減小，當pH達到9.5時，油脂提取率達到最大。圖1b表明加酶量對提取率的變化趨勢和pH相同，在加酶量為2.5%時，提取率達到最大。圖1c表示酶解時間對提取率的變化趨勢是先快速增加，再緩慢降低，在3 h附近達到最大值。圖1d表明酶解溫度對提取率的趨勢變化極大，提取率從30%到65%，在55℃時達到最大。圖1e表明料液比的變化趨勢不同于其他因素，因為它在1∶3和1∶4時快速增加，然后從 1∶4到 1∶5，提取率幾乎不變，最終在1∶6達到最大值。

圖1 酶解條件對油脂提取率的影響

2.2 響應面分析

根據單因素試驗，采用響應面法優化酶解參數。以加酶量 x1，pH x2，酶解時間 x3，酶解溫度 x4，液料比x5為自變量，油脂提取率y為響應值，響應面試驗方案及結果見表2。試驗號1～24為析因試驗，25～36為中心試驗，用以估計試驗誤差。

表2 響應面試驗方案和試驗結果

表2 （續）

通過SAS9.13得到響應面回歸方程式，如下：

Y＝-11．40+69．12x1+1．58x2+0．78x3+0．09x4+0．19x5-536．88x12-4．79x1x2+0．28x1x3+0．02x1x4-1．33x1x5-0．09x22-0．01x2x3+0．004x2x4-0．001x2x5-0．09x32-0．002x3x4+0．001x3x5-0．001x42+0．001-0．02

表3 回歸與方差分析結果

表3表明獨立和非獨立變量的線性關系是顯著的，此模型是顯著的（P＜0.000 1），失擬不顯著。而且，模型的決定系數（R2＝0.970 9＞0.800 0）說明試驗誤差低，模型正確。結果證明此模型能很好地匹配和分析數據來預測試驗結果。

按照顯著性檢驗，含有 x1，x2，x3，x4，x1x2，x2x4，的一次項和二次項對油脂提取率有顯著影響（P＜0.05），并且其他因素不顯著（P＞0.05），這說明各因素的影響是復合的，因為存在交互項。圖2和圖3表示交互作用的響應面和等高線。表3反應通過F檢驗得到因素貢獻率為：x1＞x2＞x4＞x3＞x5（加酶量＞pH＞酶解溫度＞酶解時間＞料液比）。

當固定3個因素的零水平，圖2和圖3表示另外2個顯著交互項的響應面和等高線。兩對顯著交互項可從表3獲得，分別為：加酶量和pH，pH和酶解溫度。圖2表明：當把x3，x4和x5調節到零水平，在低水平pH下，加酶量對油脂提取率影響較小，在高水平pH下，加酶量對油脂提取率影響很大，隨著加酶量增大，油脂提取率先增大后平緩趨勢。pH對油脂提取率的趨勢和加酶量的相同。圖3表示當把x1，x3和x5調節到零水平，pH和酶解溫度對油脂提取率的影響的變化趨勢都是先上升后下降。

圖2 顯著交互項加酶量和pH的響應面分析

圖3 顯著交互項pH和酶解溫度的響應面分析

2.3 最佳酶解條件的確定及驗證

響應面分析法得到的最佳條件如下：加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04，油脂提取率預測值（69.02±0.55）%。

在最佳條件下進行3次平行試驗，酶解條件為：加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04。3次試驗結果分別為：68.67%，68.79%，68.51%。3次平行試驗的平均值為68.66%，這說明響應值符合回歸預測值，并且模型能預測產業化的實際條件。

2.4 水酶法的油脂釋放機理的顯微鏡分析

在水酶法提取過程中，隨著酶解進行，開始形成水包油型乳狀液。雖然乳狀液中含有超過50%的油，但是許多蛋白質包圍乳狀液中的油，阻止油脂釋放［16］。因此，使油脂釋放需要破壞蛋白質。蛋白體的變化范圍為直徑10到50μm。一般來說，直徑大的蛋白體比小的更容易破壞其結構［16］。在圖4a中，當酶解1 h，大量的蛋白體聚集在一起并且包圍著油體。少量油體從蛋白體中分離出來，但是大量的油體與蛋白體結合，被稱作油質體［16］。在圖4b和圖4c中，當酶解分別進行2 h和3 h，蛋白體的覆蓋逐漸變少，油體開始聚集形成小油滴。最后，當包圍油滴蛋白體完全被破壞，小油滴聚集形成大油滴。在pH 4.5條件下破乳后，蛋白體分離出來，然后變小分散如圖4d。最后，越來越多的油體聚集形成油滴。

圖4 乳狀液的透射圖像

通過光學顯微鏡觀察，可知在水酶法過程中油脂釋放情況，并了解其釋放機理。首先，在水溶液中，乳狀液開始形成，大量蛋白體包圍油體并且油體非常小如圖5a。然后，油體開始聚集結合形成小油滴如圖5b和5c。最后，破乳后，在圖5d中大量油滴聚集釋放。

圖5 乳狀液的光學顯微鏡圖片

2.5 水酶法和溶劑浸提法的大豆油品質分析

在表4中，通過比較水酶法和溶劑浸提法的大豆油的品質得到結果：水酶法提取的大豆油品質更好，并且其水分及揮發物、過氧化值、p-茴香值和磷的含量與溶劑浸提法的值有顯著的不同（P＜0.01）和Jung等［17］研究的結果相近。過氧化值和p-茴香值分別是檢測初級氧化產物和次級氧化產物的指標。很顯然，無論哪種提取方法，較低的過氧化值是令人期望的。表4表示2種提取方法的大豆油指標和脂肪酸組成分布。

表4 正己烷提取法和水酶法提取大豆油的特征值

3 結論

在水酶法提取大豆油的擴大試驗中，以36組響應面試驗優化酶解條件將油脂提取率從30%增加到69%。響應面優化的最佳條件為加酶量1.92%，pH 9.15，酶解時間3.09 h，酶解溫度56.15℃，料液比1∶5.04，油脂提取率達到（69.02±0.55）%。通過透射電鏡和光學顯微鏡觀察，得到水酶法的油脂釋放機理，并且進一步提高提取工藝和油的品質。

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Scale-Up of Soybean Oil from Enzyme-Assisted Aqueous Extraction Processing

Han Zongyuan1，2Jiang Lianzhou1Li Yang1Qi Baokun1Wang Shengnan1Wang Xiao1Chen Yong1
（College of Food Science and Engineering，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）
（College of Life Engineering，Shenyang Institute of Technology2，Fushun 113122）

Enzyme-assisted aqueous extraction processing（EAEP）has made great progress in extracting soy-

bean oil.On the basis of laboratory-scale，scale-up of the extraction of soybean oil has been carried out.There was a need of 1.2 kg extruded soybean flakes for every experiment in a 10 L jacketed reactor.The hydrolysis conditions which contains the amount of enzyme，pH，hydrolysis temperature，hydrolysis time and solids-to-liquid ratio were discussed to get the optimal parameters in single factor and response surface experiments.The results were as follows：the amount of enzyme 1.92%，pH 9.15，hydrolysis time 3.09 h，hydrolysis temperature 56.15℃，solids-to-liquid ratio 1∶5.04 and oil extraction efficiency（69.02±0.55）%.In conclusion，the mechanism of oil release from EAEP was revealed by transmission electron microscopy and light microscopy for further improvement of extraction efficiency and oil quality.Comparing with solvent extraction，oil quality from EAEPwas better and the peroxide value was lower.

soybean oil，enzyme-assisted aqueous extraction processing，scale-up，oil extraction efficiency

TS22

A

1003-0174（2015）02-0037-07

863計劃（2013AA102104）

2013-10-23

韓宗元，男，1988年出生，碩士，糧食、油脂與植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，糧食、油脂與植物蛋白工程