低溫射頻等離子體降解乙腈中黃曲霉毒素B1的效果與途徑分析

張 巖 王安妮 肖軍霞 王世清 姜文利 李玉鵬

（青島市現代農業質量與安全工程重點實驗室青島農業大學食品科學與工程學院，青島 266109）

低溫射頻等離子體降解乙腈中黃曲霉毒素B1的效果與途徑分析

張 巖 王安妮 肖軍霞 王世清 姜文利 李玉鵬

（青島市現代農業質量與安全工程重點實驗室青島農業大學食品科學與工程學院，青島 266109）

采用低溫射頻等離子體處理溶解于乙腈中的黃曲霉毒素B1，考察了時間、等離子體發射功率、黃曲霉毒素B1初始濃度對黃曲霉毒素B1降解率的影響，通過HPLC-MS／MS分析降解產物及其可能的降解途徑。結果表明，隨著等離子體功率的增大、黃曲霉毒素B1初始濃度的降低，其降解率有增大的趨勢。200～500μg／L黃曲霉毒素B1經120 W等離子體處理150 s以上，黃曲霉毒素B1的降解率可達95%以上。經過對比等離子體處理不同時間后的黃曲霉毒素B1的一級質譜，推測準分子離子峰157、299、339為可能的降解產物峰。結合產物峰的二級質譜碎片信息和黃曲霉毒素B1分子結構中的活性位點，推斷出降解產物的結構和降解路徑。

低溫射頻等離子體 黃曲霉毒素B1降解率 降解產物

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一種極其穩定的真菌毒素，主要有黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2，是一類結構類似化合物的總稱［1］。1993年國際癌癥研究機構將黃曲霉毒素劃定為I類致癌物，毒性作用靶器官主要為肝臟，能引起肝炎、肝硬化、肝壞死等。其中以黃曲霉毒素B1（AflatoxinsB1，AFB1）的毒性和致癌性最強［2］。AFB1的基本結構為二呋喃環和香豆素，分子量312，易溶于乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、油，難溶于水，不溶于乙醚、石油醚、己烷［3-5］。

黃曲霉毒素毒性大、分布廣、難去除。目前降解黃曲霉毒素常用的方法主要有化學法、生物法、輻照法等，但化學法極易帶來新的有機溶劑殘留，生物法則由于工藝復雜難以推廣，因此，本試驗以射頻低溫等離子體作為降解手段，擬研究一種基于物理處理的高效、簡捷、安全降解黃曲霉毒素的新方法［6-11］。

射頻低溫等離子體是利用高頻高壓使電極周圍的空氣電離而產生的低溫等離子體。由于射頻低溫等離子的放電能量高、放電的范圍大，現在已經被應用于材料的表面處理和有毒廢物清除和裂解中［12-13］。射頻低溫等離子產生的具有高活性的電子、原子、分子和自由基能與各種有機、無機污染物分子進行碰撞和反應，使污染物分子鍵斷裂，形成低毒或無毒的小分子化合物［14-16］。張巖等［17］運用等離子體降解水中的黃曲霉毒素 B1，降解率為51.67%。由于黃曲霉毒素B1在乙腈中的溶解性良好，本研究以乙腈為AFB1溶解介質，采用射頻低溫等離子體處理AFB1，并通過HPLC法測定AFB1含量，同時用HPLC-MS／MS法分析降解產物，探究等離子體降解乙腈中AFB1的效果與產物。通過對簡單溶劑體系中毒素降解過程的深入研究，為在真實食品體系中研究等離子體降解黃曲霉毒素B1建立研究方法、提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1：美國Sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜純）：德國默克公司。

1.2 儀器與設備

等離子體試驗裝置由食品學院制作，由射頻電源、射頻電源匹配器、等離子體發生器、真空泵等部分組成，如圖1所示。超高壓液相色譜1290 Infinity噴射流離子聚焦串聯四極桿6460液質聯用儀：美國安捷倫公司；Elmasonic S450H智能超聲波清洗器：德國艾爾瑪公司。

圖1 低溫射頻等離子體發生器

1.3 試驗方法

1.3.1 等離子體處理方法

配制 200、400、500、600、800、1 000μg／L AFB1溶液，置于等離子體發生器兩電極之間進行處理。等離子體處理功率設定為 80、90、100、110、120 W，每個處理重復3次，同時設定未進行等離子體處理樣品為對照組。

1.3.1.1 不同等離子體發射功率對黃曲霉毒素B1降解效果的影響

初始濃度為500μg／L的AFB1溶液，置于等離子體發生器中進行處理，射頻電源功率設定為80、90、100、110、120 W，處理時間 100 s。

1.3.1.2 不同等離子體處理時間對黃曲霉毒素B1降解效果的影響

初始濃度為500μg／L的AFB1溶液，置于等離子體發生器中，功率設定為120 W，分別處理50、100、150、200、250 s。

1.3.1.3 不同AFB1初始濃度對黃曲霉毒素B1降解效果的影響

取200、400、600、800、1 000μg／L的毒素溶液，分別于等離子體發射功率為120 W下進行處理，處理時間為100 s。

試樣經等離子體處理后，經HPLC測定黃曲霉毒素B1含量并計算降解率。

1.3.2 HPLC測定AFB1降解率

1.3.2.1 HPLC色譜條件

Agilent液相系統，色譜柱：Waters Symmetry-C18，4.6 mm×25 0 mm，粒度5μm，柱溫：30℃，流動相∶乙腈∶水 ＝（30∶70，V／V），流速：1 mL／min，進樣量：20μL，熒光檢測器：激發波長：360 nm；發射波長：440 nm。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

準確吸取衍生后 0.0、0.75、1.5、7.5、37.5、75、150、225、300μg／L AFB1標準溶液 200μL，采用HPLC分析，每個濃度重復3次。以圖譜中AFB1的峰面積對標準溶液的濃度進行線性回歸，即得標準曲線：y＝1.753 3x-1.252 6，R2＝0.999 9。

1.3.2.3 AFB1濃度計算

參照GB／T 5009.23—2006《食品中黃曲霉毒素B1的測定》［18］，按式（1）計算樣品中 AFB1的含量。

式中：C為試樣中 AFB1質量濃度／μg／L；A為試樣按外標法在標準曲線中對應的質量濃度／μg／L；f為試樣液衍生后較衍生前的濃縮倍數。

按式（2）計算等離子體處理 AFB1的降解率［19］。式中：a為AFB1降解率／%；C為試樣等離子體處理后中 AFB1質量濃度／μg／L；C0為試樣中 AFB1質量初始濃度／μg／L。

1.3.3 HPLC-MS／MS法分析AFB1降解產物

色譜條件：色譜柱：Agilent SB-C18，2.1 mm×50 mm，粒度1.8μm；柱溫：30℃；流動相∶V甲醇∶V水＝60∶40，其中水含 5 mmol／L乙酸銨和 0.2%甲酸；流速：20μL／min；進樣量：2μL。

質譜條件：離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；載氣溫度300℃；流量6 L／min；鞘氣溫度：300℃；流量12 L／min；掃描范圍：50～400；光電倍增器電壓：400 V；噴霧電壓：45 psi；檢測方式：MRM模式；毛細管電壓：4 000 V。

1.3.4 數據分析

每個試驗重復3次，結果以ˉx±s表示，采用SPSS17.0對數據進行顯著性及相關性分析，當P＜0.05時視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 等離子體發射功率對AFB1降解率的影響

由圖2可知，隨著等離子體發射功率的增大，AFB1降解率有不斷增大的趨勢。這是由于等離子體發生器射頻電源的功率增大，所產生等離子體中活性粒子的密度增大，其與溶液中的毒素分子接觸的幾率也隨之增大［20］，毒素降解率越高。

圖2 等離子體發射功率對AFB1降解率的影響

2.2 等離子體處理時間對AFB1降解率的影響

由圖3可知，500μg／L AFB1經120 W等離子體處理150 s以上，AFB1降解率可達95.0%以上。處理250 s時AFB1的降解率最高達到99.8%?？梢?，等離子體處理可極有效的降解黃曲霉毒素B1，因此是一種非常有潛力的黃曲霉毒素脫毒方法。

圖3 等離子體處理時間對AFB1降解率的影響

2.3 AFB1初始濃度對其降解率的影響

由圖4可知，AFB1的初始濃度越低，毒素的降解率越高。200μg／L AFB1經120 W等離子體處理100 s，降解率已達 95.39%，而 1 000μg／L AFB1在相同條件下處理100 s，降解率為80.13%。這可能是當等離子功率一定時，等離子體中產生的活性離子數目基本上是相同的，溶液的初始濃度越低，則溶質分子與活性離子反應的幾率越高，反之溶液的初始濃度越高，則溶質分子與活性離子反應的幾率就越低［21］。

圖4 初始濃度對AFB1降解率的影響

2.4 HPLC-MS／MS法分析AFB1降解產物

2.4.1 等離子體降解AFB1的產物一級質譜圖

本研究將500μg／LAFB1進行不同時間的處理，等離子體發射功率設為120 W，對降解后的AFB1進行HPLC-MS／MS分析，圖5為等離子處理不同時間的AFB1的質譜圖。通過對比不同時間下AFB1的質譜圖，分析不同條件下降解產物的異同。

圖5 不同降解時間下AFB1的一級質譜圖

劉睿杰等［22］運用AFB1降解產物的LC-MS圖中物質峰的響應值體現降解產物的含量，從而得出AFB1在乙腈溶液中降解產物的動態形成過程。由圖5和圖6可知，隨著處理時間的增長，物質B、C、D的響應值具有一定的規律性。100 s內物質峰A（AFB1）響應值逐漸降低，B、C的響應值逐漸增加，100 s時B、C響應值開始降低，出現物質峰D，100～150 s內B、C響應值逐漸降低，而D響應值逐漸增加。這表明B、C、D可能是A（AFB1）的降解產物，B、C可能是中間產物。

圖6 等離子處理時間對AFB1降解產物響應值的影響

2.4.2 等離子體降解AFB1的質譜信息

為進一步了解降解產物的結構以及降解途徑，選取 A（m／z312.9）、B（m／z157.0），C（m／z 299.0），D（m／z339.1）作為母核［23］，碰撞電壓為 30 V做二級質譜鑒定。

AFB1結構中的3個主要毒性活性位點見圖7，其中呋喃環8、9位雙鍵部位是黃曲霉毒素形成AFB1-DNA、AFB1-pro的作用位點，是導致基因突變致癌致畸的主要功能基團，這點同時解釋了黃曲霉毒素家族中AFB1毒性最強的原因；另一活性位點是香豆素內酯環部份，這個位點容易發生水解，因而成為降解活性位點。同時，在AFB1環戊烯酮環上一些取代基團的存在與否也對黃曲霉毒素的毒性有一定的影響。將母離子A（AFB1）與二級質譜碎片信息匹配，找出AFB1中容易斷裂的“點”，并與其主要毒性活性位點相結合，為3種降解產物的結構推導提供依據。

圖7 AFB1毒性位點

AFB1與3種降解產物的二級質譜信息見表1。根據二級質譜信息，推斷的 A（m／z 312.9）、B（m／z 157.0），C（m／z299.0），D（m／z339.1）的可能裂解途徑分別見圖8～圖11。

表1 乙腈中AFB1的主要質譜碎片信息

圖8 m／z312.9的二級質譜及碎片信息

圖9 m／z157.0的二級質譜及碎片信息

圖10 m／z299.0的二級質譜及碎片信息

圖11 m／z338.9的二級質譜及碎片信息

根據產物分子量和二級質譜鑒定結果，推斷出一種可能的AFB1降解途徑，見圖12。由圖12可知，等離子體降解過程中AFB1部分發生分解斷環反應生成產物B、部分在香豆素內酯環部位發生光消去形成產物C。但B、C僅僅是中間產物，兩者性質不穩定，隨即發生聚合生成較穩定的物質D。產物D結構中，原AFB1呋喃環雙鍵部位的氫原子被醛基取代，原有毒性功能基團被破壞，環戊烯酮環2、3位發生消去反應形成雙鍵，推測產物D的毒性可能發生改變。

圖12 AFB1的降解途徑

3 結論

等離子體降解 AFB1效果顯著，200～500μg／L黃曲霉毒素B1經120 W等離子體處理150 s以上，黃曲霉毒素B1的降解率可達95%以上；隨著等離子體功率的增大，AFB1降解率有不斷增大的趨勢；AFB1溶液初始濃度越低，AFB1降解率越高；通過 HPLCMS／MS分析等離子體處理后的AFB1溶液，結合一級、二級質譜，推斷出相對分子質量為156、298、338的3種主要降解產物的結構及等離子體降解黃曲霉毒素B1的可能的降解路徑。

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Effect and Pathway Analysis of AflatoxinsB1in Degradation of Acetonitrile-Dissolved by Low Temperature Radio Frequency Plasma

Zhang Yan Wang Anni Xiao Junxia Wang Shiqing Jiang Wenli Li Yupeng
（Qingdao Key Lab of Modern Agricultural Quality and Safety Engineering，Food Science and Engineering College Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

The effects of radiation duration，plasma transmit power，aflatoxins B1initial concentration on the degradation rate of aflatoxins B1dissolved in acetonitrile by low temperature radio frequency plasma were studied in this paper.Meanwhile，the possible degradation pathway and degradation products were analyzed by HPLC-MS／MS.The results indicated that the aflatoxins B1degradation rate was increased with elevated transmit power and reduced initial aflatoxins B1concentration.When 200～500μg／L aflatoxins B1was exposed to 120 W plasma for more than 150 s，the degradation rate of aflatoxins B1reached more than 95%.HPLC-MS／MSanalysis of the degradation mixture revealed three major quasi-molecular peaks of 157，299，and 339 respectively after comparing first mass information of aflatoxins B1through different plasma treatment time.The three peaks were proposed corresponding to the degradation products of aflatoxins B1.The degradation products and the pathway were identified using secondary mass fragments information and active site in the structure of aflatoxins B1.

low temperature radio frequency plasma，aflatoxins B1，degradation rate，degradation product

X592

A

1003-0174（2015）02-0080-07

國家自然科學基金（31271963）

2013-11-14

張巖，男，1969年出生，副教授，食品安全保藏

王世清，男，1961年出生，教授，食品安全保藏