高選擇性的菜籽蛋白含量測定方法

沈娜娜 劉 曄 劉大川 鐘啟新

（武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023）

（武漢輕工大學化學與環境工程學院2，武漢 430023）

高選擇性的菜籽蛋白含量測定方法

沈娜娜1劉 曄2劉大川1鐘啟新1

（武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023）

（武漢輕工大學化學與環境工程學院2，武漢 430023）

為解決菜籽蛋白原料及制品中真蛋白含量難以測定的問題，建立了一種基于分級和定量2步完成的高選擇性菜籽蛋白含量測定方法。通過酸化丙酮溶液和沸水萃取實施分級處理，可將樣品中的非蛋白氮分離；結合應用可溶性蛋白的染色法測定和不溶性蛋白的凱氏定氮法測定，可獲得樣品的真蛋白含量。該方法變異系數不大于2.83%，回收率95%～96%，并可排除本源性非蛋白氮（包括芥子堿和硫甙）及外源性非蛋白氮（包括硝酸鹽、銨鹽、三聚氰胺和尿素）的干擾。該方法具備良好的抗干擾能力且不受蛋白質溶解性的影響，可推廣到更多的植物蛋白制品及原料的真蛋白含量測定中，并可為相關行業的摻雜辨識或品質評價提供可靠手段。

菜籽蛋白 真蛋白 非蛋白氮 抗干擾

我國是世界上最大的油菜籽生產國，已建成較為成熟的菜籽油加工產業，但對于菜籽蛋白的商業化開發和利用則十分欠缺［1-2］。為保障菜籽蛋白加工產業的健康發展，需建立可靠的真蛋白含量定量方法，以使相關企業獲得原料摻雜辨識及產品價值評價的手段。作為相關行業仲裁標準的凱氏定氮法只能檢測粗蛋白含量，無法剔除樣本中非蛋白氮的干擾［3］。菜籽餅粕及其蛋白制品中的非蛋白氮通常有兩個來源，其一是油菜籽中天然存在的非蛋白含氮化合物，代表性成分是硫甙和芥子堿［4］，屬本源性非蛋白氮；其二是在油菜籽種植、菜籽餅粕脫毒及深加工中引入的含氮物質，如尿素、銨鹽和硝酸鹽等［5］，屬外源性非蛋白氮。非蛋白氮的存在通常令樣本中的蛋白質含量被高估，可導致相關企業遭受經濟損失或技術風險。因此，發展高選擇性的菜籽蛋白測定方法以確定樣本中的真蛋白含量是十分必要的。

基于比色法，包括雙縮脲法、lowry法、Bradford法、BCA法等［6］，或者基于蛋白酶水解動態參數等均可快速確定可溶性蛋白質含量［7］，但無法測定不溶性菜籽蛋白；全氮測定方法不受蛋白質溶解性的影響，但無法區分非蛋白氮的存在［3，8］；近紅外法也可用于農產品中蛋白質的快速定量，但仍需可靠的化學分析方法作為建?；A［9］。針對現有方法的缺陷，提出先對菜籽蛋白樣品分級處理，再結合應用高選擇性的染色法和高通用性的全氮測定法，以實現對菜籽真蛋白的高選擇性測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽預榨-浸出粕（分別簡稱黃岡粕、宜城粕、武漢粕）：湖北維普生物科技股份有限公司、湖北宜城市天鑫油脂公司、益海嘉里（武漢）糧油工業有限公司；大豆分離蛋白：湖北云夢龍云植物蛋白有限公司；油菜籽：青海西寧塘古風商貿有限公司；白芥子：湖北中醫院；Bradford蛋白濃度試劑盒：江蘇海門碧云天生物研究所；3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（純度98%）：阿法埃莎（天津）化學有限公司；復合多糖水解酶 Viscozyme L（酶活100 FBG／g）：廣州諾維信（中國）生物技術有限公司；HP-20型大孔吸附樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；再生纖維素透析袋（截留相對分子質量8 000～14 000）：北京索萊寶科技有限公司，其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

FJ-200高速分散均質機：上海標本模型廠；DF-1集熱式磁力恒溫攪拌器：金壇市江南儀器廠；HYP-1008消化爐：上海纖檢儀器有限公司；Bench-Top Pro K4冷凍干燥機：美國VIRTIS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菜籽蛋白含量的兩步法測定

1.3.1.1 樣品的預處理

對待測菜籽粕樣品實施分級處理，見圖1。

圖1 菜籽粕樣品的分級處理流程

精確稱取1 g粉碎并過60目篩的待測樣品置于50 mL離心管中，加入以三氯乙酸調至pH 3的70%（體積比）的丙酮水溶液15 mL，室溫下18 000 r／min均質90 s，所得懸液3 500 r／min離心10 min，分別收集上清液及殘渣。對殘渣重復上述萃取操作3次，合并上清液并在40℃真空（-0.1 MPa）旋轉蒸發脫除丙酮后以pH 7.4的0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液定容至25 mL，記為脫酚液。然后向殘渣中加入15 mL煮沸的去離子水，再于沸水浴中磁力攪拌30 min，待冷卻至室溫后3 500 r／min離心10 min，所得上清液定容至25 mL，記為脫硫苷液；所得殘渣為不溶物。

為考察多酚對脫酚液蛋白質測定的影響，采用上述相同條件萃取黃岡粕，合并上清液真空脫除丙酮后定容至10 mL。取其中5 mL在4℃下透析36 h，轉出并定容至10 mL，記為透析液；剩余5 mL稀釋并定容于10mL，記為對照液。分別測定透析液和對照液中的總酚濃度和蛋白質濃度。

1.3.1.2 蛋白質含量的計算

分別測定上述分級產物，即脫酚液、脫硫甙液和不溶物的蛋白質質量，并按照下式計算蛋白質含量：

蛋白質含量／%＝（不溶物蛋白質量+脫酚液蛋白質量+脫硫苷液蛋白質量）／樣本質量×100

1.3.2 菜籽蛋白標準液的制備

參考并修改文獻［10］的方法制備菜籽蛋白標準液。其中，采用樹脂吸附法脫酚和酶水解法脫多糖。即將蛋白粗提液按1.5 mg／mL的比例加入HP-20樹脂，在25℃的水浴中以150 r／min的轉速振蕩1.5 h。然后12 000 r／min離心 5 min，吸出上清液并用0.5 mol／L的磷酸調節至 pH 4.8，然后按0.2 g／L的比例加入Viscozyme L，在40℃水浴中以150 r／min振蕩水解48 h。將所得水解液以1 mol／L調節至pH 4.0后4℃靜置12 h，再以3 500 r／min離心10 min收集酸沉蛋白，將所得酸沉蛋白以1 mmol／L NaOH溶液重溶后再于4℃下透析36 h，最后經冷凍干燥得菜籽蛋白。所得菜籽蛋白中未檢出硫甙和酚，且在純化操作中未引入含氮物質，基于凱氏定氮法測得純度為91.24%（干基）。將該菜籽蛋白溶于0.1 mol／L的pH 7.4磷酸鹽緩沖液，制得菜籽蛋白標準液。

1.3.3 菜籽粗酚提取液的制備

根據文獻［11］的方法提取菜籽粗酚。

1.3.4 化學分析及數據處理

固體蛋白質含量采用GB／T 6432—1994測定；液體蛋白含量測定采用Bradford法測定；水分含量的測定采用GB／T 6435—2006測定；總酚及酚酸測定依據文獻［11-12］；硫代葡萄糖甙采用硫脲紫外法測定［13］。對所有樣本的蛋白質含量做6平行測定，對其他化學成分報道數值為3次平行測定的平均值，顯著性分析采用Microsoft Office Excel 2003做t-檢驗及F-檢驗。

2 結果與討論

2.1 分級處理對本源性非蛋白氮的影響

兩步法測定菜籽蛋白的方法包括分級和測定2個步驟。其中分級處理的目的在于將樣本中的非蛋白氮萃取出來，并使樣本分級為不溶物和可溶物（包括脫酚液和脫硫甙液兩部分）兩類餾分。從而可在測定步驟中利用全氮測定法（本研究使用凱氏定氮法）測定不溶性菜籽蛋白的含量；再利用高選擇性的染色法測定可溶性蛋白質，進而累加兩個部分蛋白質含量得到樣本的真蛋白含量。

菜籽餅粕及其制品中的本源性非蛋白氮主要是芥子堿和硫苷［4］。其中芥子堿是芥子酸和膽堿的酯化物，占油菜籽中各類酯化態酚酸的99%左右［5］。Xu等［12］建立了一種菜籽酚酸的快速測定方法，利用三氯乙酸酸化的70%丙酮經多輪提取可完全提取菜籽粕中的游離態和酯化態酚酸。據此，以黃岡粕樣本中的總酚酸為基準，考察了提取輪次對于樣本中酚酸去除率的影響，結果如圖2所示。

從圖2可見，利用酸化丙酮水溶液可高效提取粕中的酚酸，萃取3次即可實現98%以上的脫除率，增加萃取次數只能微弱增加脫除率，而殘留部分主要為難以脫除的結合態酚酸（不含膽堿）。因此，選擇提取3次。

圖2 萃取次數對菜籽酚酸去除率的影響

硫甙是油菜籽中另一類不可忽視的天然含氮化合物，其含量受油菜品種和加工工藝的影響，而呈現巨大差異［5］。水在高溫下對菜籽粕中的硫甙具有高溶出能力［15］，故在本研究中采用沸水脫除樣品中的硫甙。從試驗結果看，雖然原粕中的惡唑烷硫酮（OZT）和異硫氰酸酯（ITC）分別達到（18.81±0.01）mg／g粕和（4.24±0.02）mg／g粕，但經沸水浸提后粕中的這2類物質含量都未檢出，意味著這一操作可較為徹底的去除原粕中的硫甙成分。

2.2 菜籽多酚對液相蛋白測定的影響

分級操作可較為徹底地脫除菜籽粕樣品中的內源性非蛋白氮，也產生了2種液體分級餾分，即脫酚液和脫硫甙液。其中均可能含有一定量的可溶性菜籽蛋白，需加以測定以計入總真蛋白量。由于考馬斯亮藍G250染色法對于非蛋白氮具有優異的抗干擾能力且能快速靈敏的測定可溶性蛋白質，因此被用于本研究。然而，植物多酚的存在往往導致染料或蛋白質的沉淀而造成該方法的失效［16］。此外，所測蛋白質的氨基酸組成不同也會導致染色法的測定出現較大偏差［6］。因此，在本研究中采用自制的高純菜籽蛋白為標準物測繪標準曲線，并考察了不同濃度的菜籽多酚對該標準曲線的影響，結果如圖3所示。

圖3 總酚濃度對菜籽蛋白標準曲線的影響

從圖3可見，菜籽蛋白標準曲線線性關系良好。而當標準液中添加菜籽多酚后，吸光度值開始出現偏離，且這一趨勢隨多酚濃度的增加而趨于明顯，表明酚對蛋白質的沉淀作用開始顯現［14］。然而，當蛋白質質量濃度低于0.4 mg／mL時，菜籽多酚的存在并未對測定值產生顯著影響。為進一步證實該判斷的可靠性，采用染色法測定對照液（未作脫酚處理）和透析液（采用透析法脫酚質量）的蛋白質濃度。結果表明，透析前總酚和蛋白質質量濃度值分別為（0.793±0.011）mg／mL和（0.266±0.015）mg／mL；透析后總酚和蛋白質濃度值分別為（0.015±0.001）mg／mL和（0.250±0.022）mg／mL，二者的蛋白質測定值無顯著性差異（P＞0.05）。在本研究中，所有脫酚液蛋白質濃度不大于0.26mg／mL且總酚含量不大于0.80 mg／mL，而所有脫硫甙液酚含量不大于0.2 mg／mL，因此均可采用G250染色法及上述標準曲線進行蛋白質定量。

2.3 兩步法測定的有效性

在含菜籽蛋白的樣本中，菜籽預榨-浸出粕是物理-化學結構最為復雜且受非蛋白氮影響最大的樣本類型［5］，故選為典型樣本用以考察兩步法測定的精密度。此外，由于目前尚無商品化的菜籽分離蛋白，故選擇大豆分離蛋白作為不含非蛋白氮的樣本，用以考察所測數據的有效性。凱氏定氮法作為一種標準方法，也用于樣本蛋白含量測定以提供參照數據，結果見表1。

從表1可見，對于菜籽粕樣本而言，兩步法所測蛋白含量均顯著低于凱氏定氮法所得數據；而對于大豆分離蛋白而言，2種測定卻并無顯著差異，顯示樣本中本源性非蛋白氮對全氮測定方法的干擾不可忽視，而兩步法測定則可實現對真蛋白的選擇性測定。在對上述樣本中加入自制菜籽蛋白標準物以評價方法的可靠性時，兩步法測定的回收率在95%～96%之間。據此可知，兩步法測定能夠客觀地反映樣本中的真蛋白含量，具有更高的可靠性。

從精密度分析看，兩步法與凱氏定氮法相比其變異系數在總體上并無顯著差異且不大于2.83%，故可認為具有較好的精度。而從3種分級餾分中蛋白含量對兩步法測定總蛋白含量數據的貢獻上看，脫酚液中蛋白質含量微乎其微，這是因為三氯乙酸酸化的丙酮溶液對蛋白質的溶解度極低。因此，可考慮忽略這個部分的可溶性蛋白質測定以簡化操作。在脫硫甙液中，菜籽蛋白含量也非常低，但大豆蛋白的含量則高得多，顯示了二者在沸水中溶解度的巨大差異。雖然在測定水溶性蛋白含量時，仍然使用了菜籽蛋白做標準物，但是對于大豆蛋白的測定并未出現較大偏差。

表1 凱氏定氮法和兩步法測定蛋白含量的比較／%

表2 凱氏定氮法和兩步法對外源性非蛋白氮污染樣本的測定比較

2.4 方法的抗干擾能力

菜籽蛋白制品及其原料中往往因各種原因而被引入某些含非蛋白氮的物質，對于客觀評價樣品價值造成嚴重困擾，甚至有可能成為相關行業的信用風險。為此，在菜籽粕中添加多種非蛋白氮以模擬被外源性非蛋白氮污染的情況，并分別采用凱氏定氮法和兩步法測定其蛋白質含量，以對比二者的抗干擾能力，試驗結果及數據分析如表2所示。

由表2可見，采用凱氏定氮法測定菜籽蛋白含量時，會受到尿素、三聚氰胺以及銨鹽的嚴重影響，即使添加量不到3%（質量百分比），即可導致粗蛋白含量出現顯著的增大；硝酸鹽則因不能被轉化為氨氣而不對總氮測定產生影響。而在采用兩步法測定時，上述任何添加物都不會對樣本的真蛋白含量產生顯著影響，意味著該方法對外源性非蛋白氮不敏感，顯示出對于真蛋白的高選擇性。應該指出，在兩步法中采用了酸化丙酮溶液和沸水兩類萃取劑，故無論對于水溶性的銨鹽還是非水溶性的三聚氰胺均能較為徹底的分離，從而使該方法具有較為全面的抗干擾能力。綜上所述，將兩步法和凱氏定氮法在應用于菜籽蛋白含量測定時的主要差異列于表3。

出于對營養價值及供需矛盾的考慮，人們越來越重視利用植物蛋白替代或補充動物蛋白的消費［17］。而植物蛋白的標準含量測定方法仍然基于全氮測定，導致對于非蛋白氮的殘留或摻雜幾乎沒有辨別能力。本研究雖然只對兩步法測定菜籽蛋白和大豆分離蛋白的有效性進行了考證，但其技術原理可兼顧不溶性及可溶性蛋白的定量，故有望推廣至各類植物蛋白制品及其原料的測定中，進而發展為一種植物蛋白樣本的通用真蛋白含量測定方法。

表3 凱氏定氮法和兩步法的比較

3 結論

建立了一種菜籽蛋白樣品中真蛋白含量的兩步測定方法。通過酸化丙酮溶液萃取和沸水萃取實施分級處理，可將樣品中的非蛋白氮分離；結合應用可溶性蛋白的染色法測定和不溶性蛋白的凱氏定氮法測定，可獲得樣品的真蛋白含量。該方法變異系數不大于2.83%，回收率95%～96%，并可排除本源性非蛋白氮（包括芥子堿和硫苷）及外源性非蛋白氮（包括硝酸鹽、銨鹽、三聚氰胺和尿素）的干擾，相對于無抗干擾能力的全氮測定法，這是一種高選擇性的菜籽蛋白測定方法。該方法不受蛋白質溶解性的影響且具備廣譜抗干擾能力，有望推廣到多種植物蛋白制品及原料的真蛋白定量中，從而為相關行業的摻雜辨識或品質評價提供可靠手段。

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Highly Selective Method for Rapeseed Protein Content Determination

Shen Nana1Liu Ye2Liu Dachuan1Zhong Qixin1
（College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）
（College of Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University2，Wuhan 430023）

To achieve reliable assessment on the true protein content in rapeseed protein materials or products，a highly selective determination method involving steps of sample fraction and protein quantification was established.Samples were extracted with acidified aqua acetone and subsequently with boiling water to remove the non-protein nitrogen（NPN），and then the soluble protein in liquid fractions was determined by Bradford method while the insol-

uble protein in solid fraction was determined by Kjeldahl method，thus the combination of protein in both fractions represents the true protein in sample.The method has shown desirable capability of anti-interference on both endogenous NPN（including glucosinolates and sinapine）and exogenous NPN（including nitrate，ammonium salt，melamine and urea）.In addition，the coefficient of variation was less than 2.83%and the recovery rate was within the range of 95%～96%.Due to the anti-interference capability on various NPN and compatibility on protein solubility，this method could be applied widely in determining various types of plant true protein and as reliable tool for adulteration identification or quality evaluation.

rapeseed protein，true protein，non-protein nitrogen，anti-interference

TS229

A

1003-0174（2015）02-0107-06

國家科技支撐（2010BAD01B07），湖北省教育廳科學研究（Q20081808）

2013-11-11

沈娜娜，女，1987年出生，碩士，油脂與植物蛋白工程

劉曄，男，1974年出生，副教授，農產生物質資源的開發和利用