大鼠血管壁中膜平滑肌細胞的原代培養及鑒定

敖 鋒 ，張自力 ，宋 健

·基礎醫學論著/研究·

大鼠血管壁中膜平滑肌細胞的原代培養及鑒定

敖 鋒1，2，張自力1，宋 健2

目的 探討一種方便、快捷、大量原代培養大鼠血管壁中膜平滑肌細胞的方法，為心血管疾病的體外研究提供可靠的實驗材料。方法 利用改良的組織貼塊法進行血管壁中膜平滑肌細胞原代培養，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，并用免疫熒光染色鑒定分離培養的細胞。結果 改良的組織貼塊法成功培養出大鼠血管壁中膜平滑肌細胞，3 d～5 d可見細胞爬出，7 d～9 d即可傳代。鏡下見細胞以長梭形為主，呈典型“峰-谷”樣生長，免疫熒光染色鑒定陽性細胞率在95%以上。結論 本研究介紹的改良組織貼塊法技術成熟，具有操作簡單、方便等優點，使用該法不僅可以獲得純度高、活性好的血管中膜平滑肌細胞，而且縮短了培養周期。

血管壁；中膜；平滑肌細胞；原代培養

血管壁中膜平滑肌細胞(smooth muscle cell，SMC)是構成血管壁組織結構和維持血管張力的重要成分之一，而SMC發生表型轉換、遷移、異常增殖并分泌大量細胞外基質所引起的內膜增厚是高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等心血管疾病的核心病理過程[1-2]。因此，研究中膜SMC增殖、遷移的信號轉導機制及尋找動脈粥樣硬化等疾病的分子治療靶點是當前心血管界的熱點和難點[3]，而SMC的原代培養為進行心血管疾病的分子生物學機制體外研究、相關藥理研究提供了有利的實驗材料。筆者在對國內外同行研究深入分析的基礎上對傳統SMC培養方法組織貼塊法進行改進，通過反復實踐摸索建立出穩定、快捷、方便、高效的大鼠中膜SMC體外培養模型，并采用免疫細胞化學染色對其鑒定，純度在95%以上?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康SD雌性大鼠，(2～3)月齡，體重150 g～200 g，由武漢大學醫學部實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 DMEM/F-12液體培養基(Gibco公司)、青霉素(Amresco公司)、鏈霉素(Amresco公司)、Ⅱ型膠原酶(Worthington Biochemical公司)、β-巰基乙醇(Sigma公司)、谷氨酰胺(Thermo公司)、炭吸附特級胎牛血清(Biological Industries公司)、兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體(Abcam公司)、Hoechst(Sigma公司)、FITC標記的山羊抗兔IgG抗體(Beyotime公司)等均通過商品化途徑購置。

1.3 SMC的原代培養 按0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥鈉，待大鼠麻醉后，無菌條件下迅速分離大鼠主動脈，置于盛有無菌D-Hank’s液(4 ℃預冷)的培養皿中清洗3次，清洗過程中同時剔除血管表面的脂肪組織、結締組織以及血凝塊。將主動脈轉移至另一潔凈盛有無菌D-Hank’s液(4℃預冷)的培養皿中，眼科剪剪開血管，無菌棉簽沿血管縱軸來回擦拭主動脈內膜3次，以去除血管內皮細胞。從D-Hank’s液中取出主動脈，放入含有1 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶的EP管中，置于37℃水平搖床中消化12 min。顯微鑷小心撕下血管中膜，置入盛有完全培養基的培養皿中，用顯微剪將中膜剪成1 mm×1 mm大小碎片，均勻擺置鋪平于T25細胞培養瓶瓶底并在瓶內側壁加入3 mL含10%胎牛血清的完全培養基。將培養瓶側放豎立(見圖1a)于37℃恒溫、飽和濕度、5%CO2培養箱內放置1 h，然后翻轉T25培養瓶使瓶底朝上(見圖1b)再靜置1 h～1.5 h。待觀察到組織塊稍變干與培養瓶底黏附后，緩慢將培養瓶翻轉平放(見圖1c)，絕對靜置培養箱內3 d～5 d，期間禁止震蕩或移動培養皿，以防貼壁的組織碎片脫落。5 d后每日用相差倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

圖1 T25細胞培養瓶擺放示意圖

1.4 SMC的傳代培養及純化 當細胞生長達到亞融合狀態(約80%融合)時即可進行傳代培養。棄去舊培養基，37℃預熱的無菌D-Hank’s液清洗細胞表面3次，清洗過程中晃動培養瓶以除去組織塊和殘余的血清。吸盡D-Hank’s液后，在細胞表面均勻地加入0.125%胰酶和0.02%EDTA的混合液600 μL，37℃條件下消化3 min。待顯微鏡下觀察到大部分細胞收縮變圓從皿底脫落后，立即加入1.5 mL完全培養基中止消化反應，離心后按照1∶3的比例分瓶培養。

由于培養的細胞中可能含有成纖維細胞混雜生長，因此可采用差異貼壁法純化中膜SMC[4]。即在傳代時將細胞懸液靜置(15～25)min，使成纖維細胞貼壁，轉移培養液至另一個培養瓶中，再次靜置貼壁，重復上述步驟(2～3)次即可獲得純化的平滑肌細胞。

1.5 SMC的鑒定 將傳代時制備好的細胞爬片置于24孔板內，0.1 mol/L PBS浸洗細胞爬片5 min×3次；然后4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS浸洗5 min×3次。0.1%Triton X-100室溫孵育10 min，PBS浸洗細胞爬片5 min×3次。5%BSA室溫封閉30 min后吸盡封閉液，按照1∶50比例稀釋一抗(兔抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體)，每張爬片滴加50 μL一抗，4℃濕盒內孵育過夜。次日，PBS浸洗細胞爬片5 min×3次，按照1∶200比例稀釋帶熒光的二抗(FITC標記的山羊抗兔IgG抗體)，濕盒內避光條件下室溫孵育2 h。每張爬片滴加20 μL Hoechst染核2 min，PBS浸洗后甘油封片，熒光顯微鏡下采集圖像。陽性染色以胞質出現綠色為標準，選擇著色均勻的區域，在熒光顯微鏡40倍視野下計數綠色細胞占該視野細胞總數的百分比。每張切片選擇6個視野，每組取6張切片，計算平均值。

2 結 果

2.1 SMC體外培養生長狀況 改良的組織貼塊法成功培養出大鼠血管壁中膜SMC，3 d～5 d見細胞從組織塊邊緣遷移萌出，細胞體積小，形態不一，大部分呈長梭形，少量呈三角形或不規則形，折光性強，胞質豐富。約7 d～9 d細胞生長致密成層，融合成片，呈典型“峰-谷”樣生長狀態時即可傳代(見圖2)。

a：原代培養第4天見組織塊旁 b：原代培養第4天見爬出的細胞大部分呈 c：原代培養第7天見細胞呈典型 少許細胞爬出(×10) 長梭形，折光性強，胞質豐富(×20) “峰-谷”樣生長(×40)

2.2 SMC的鑒定 培養的第3代SMC經平滑肌特異性蛋白-平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain，SM MHC)免疫化學染色后，正置顯微鏡下見SM MHC沿細胞縱軸呈肌絲狀整齊排列于細胞質內，胞質呈綠色，細胞核呈卵圓形居中，陽性細胞率在95%以上(見圖3)，這表明本方法分離培養的SMC純度高。

a：綠色熒光表示SM MHC呈肌絲狀 b：藍色熒光表示Hoechst染核 c：a和b的融合圖整齊排列于細胞質內(FITC標記)

3 討 論

血管壁中膜SMC原代培養的方法主要有酶消化法和組織貼塊法，酶消化法由于受中膜組織需求量大、得率低、消化步驟多、酶作用時間難以掌控、污染概率高等因素的影響[5]，限制了其廣泛應用。目前，國內廣泛應用的是組織貼塊法，組織貼塊法具有經濟實用、操作簡單、細胞活性好、得率高等優點，不足之處是培養周期長。本研究在傳統組織貼塊法基礎上通過反復實踐，并借鑒前人的經驗，經過改良不僅縮短了培養周期，而且獲得純度較高的SMC?，F就關鍵環節做以討論。

3.1 動物及麻醉方式的選擇 眾所周知，年幼大鼠的組織塊具有更強的增殖潛能，原代培養成活率更高，但體重太小的大鼠取材困難且細胞得量少[6]。經過反復摸索，本課題組認為選取(2～3)月齡、體重(150～200)g大鼠最為適宜，這樣既方便操作，又保證細胞未過于老化。傳統方法采用頸椎脫臼處死大鼠，這可能導致大鼠處死過久尚未完成取材。本研究采用麻醉動物的方法不僅減少了動物的痛苦，而且保證了組織的活性，減少組織變性，從而確保細胞活力。

3.2 取材要迅速并嚴格執行無菌操作 加強取材訓練，盡量在30 min內完成從取材到貼壁的全過程，減少細胞活性的降低。麻醉后的大鼠用70%酒精消毒皮膚，剪開皮膚后更換一套消毒的器械，打開胸腔后再更換一套；獲取大鼠主動脈時，采用消毒后紗布保護肺，避免損傷肺引起污染。

3.3 徹底去除血管內、外膜 用棉簽擦拭內膜避免內皮細胞的污染，分離中膜，去掉外膜，避免了外膜成纖維細胞的污染。同時在傳代時采用差異貼壁法進一步純化了中膜SMC，保證細胞的高純度。

3.4 組織碎片的選取及翻瓶方法 組織碎片一定要“剪”而不能“撕”，剪切時要輕柔，大小以1 mm×1 mm為最佳。組織碎片過小，操作頻繁且損傷細胞較多，不利于其生長；組織碎片過大，SMC因營養攝取不足而遷出困難。組織碎片移入T25培養瓶后，文獻多報道將有組織碎片的培養瓶底面朝上靜置(2～3)h后再翻轉培養瓶，使組織碎片與培養基接觸。本課題組在實驗中發現采用這種方法(2～3)h后組織碎片周圍仍然很潮濕，組織碎片不能很好貼于瓶底，翻瓶后有多數組織碎片飄起。于是，改進為將培養瓶側放豎立于培養箱內1 h，利用液體重力作用使瓶底和組織碎片周圍的液體流至瓶底，然后翻轉T25培養瓶使瓶底朝上再靜置(1～1.5)h后，緩慢將培養瓶翻轉平放。這樣不僅減少翻瓶的等待時間(時間太長組織會干涸)，而且飄起的組織碎片極少。因此，組織碎片能夠盡早接觸培養基，有利于細胞更早遷出[7]。

本研究對傳統的中膜SMC原代培養進行了改良，獲得了較為理想的結果，該方法能為動脈粥樣硬化等心血管疾病的病因、病理生理機制及防治研究提供理想的實驗材料。

[1] Duran-Prado M，Morell M，Delgado-Maroto V，et al.Cortistatin inhibits migration and proliferation of human vascular smooth muscle cells and decreases neointimal formation on carotid artery ligation[J].Circ Res，2013，112(11)： 1444-1455.

[2] Choe N，Kwon JS，Kim JR，et al.The microRNA miR-132 targets Lrrfip1 to block vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia[J].Atherosclerosis，2013，229(2)： 348-355.

[3] Rivard A，Andres V.Vascular smooth muscle cell proliferation in the pathogenesis of atherosclerotic cardiovascular diseases[J].Histol Histopathol，2000，15(2)： 557-571.

[4] Jiang XY，Zhang L，Yu C，et al.Research for a better method of neonatal rat cardiac myocytes，primary culture and purification[J].Journal of Sichuan Unversity，2015，46(2)： 301-304.

[5] 倪偉，劉濤，王浩宇，等.酶聯合消化法培養小鼠主動脈平滑肌原代細胞[J].西部醫學，2013，25(7)： 968-970；973.

[6] 張浩，王志維，吳紅兵，等.大鼠血管平滑肌細胞的培養和鑒定[J].武漢大學學報(醫學版)，2014，(3)： 378-380.

[7] Metz RP，Patterson JL，Wilson E.Vascular smooth muscle cells： isolation，culture，and characterization[J].Methods Mol Biol，2012，843： 169-176.

(本文編輯 王雅潔)

Primary Culture and Identification of the Smooth Muscle Cells from the Medial of Vascular wall in Rats

Ao Feng，Zhang Zili，Song Jian Renmin Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China；Wuhan University School of Medicine，Wuhan 430071，Hubei，China

Corresponding Author：Song Jian(Wuhan University School of Medicine，Wuhan 430071，Hubei，China)

Objective To investigate the primary culture and identification of the smooth muscle cells (SMC) from the medial of vascular wall in rats.Methods SMC from the medial of vascular wall were cultured by modified tissue culture.The cellular morphology was observed under inverted phase contrast microscope.SMC were isolated and identified with immunofluorescence.Results SMC were isolated successfully and cultured.The cells had a typical peak-valley like growth，and showed fusiform.The positive rate of cells identified with immunofluorescence were more than 95%. Conclusion The modified tissue culture can isolate and cultivate SMC with high purity and good activity under in vitro conditions with simple，reliable method.

vascular wall； medial； smooth muscle cells； primary culture

國家自然科學基金面上項目資助(No.81170134)

1.湖北醫藥學院附屬人民醫院( 湖北十堰 442000)，E-mail：aofeng19841112@163.com；2.武漢大學醫學院人體解剖學與組織胚胎學系

宋健，E-mail：songwhu@yahoo.com.cn

R54 R285

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.007

1672-1349(2015)17-1937-03

2015-07-01)