大豆查爾酮還原酶3基因(chr3)的克隆及體外催化活性分析

張 超,王丕武,張 卓

(吉林農業大學 a 農學院，b 生命科學學院， 吉林 長春130118)

大豆查爾酮還原酶3基因(chr3)的克隆及體外催化活性分析

張 超a,王丕武a,張 卓b

(吉林農業大學 a 農學院，b 生命科學學院， 吉林 長春130118)

【目的】 克隆大豆查爾酮還原酶3基因(chr3)，并分析其編碼蛋白體外催化活性，為研究大豆苷元的合成與調控研究提供參考?！痉椒ā?以大豆品種“吉農17”為材料，采用RACE技術擴增大豆chr3基因，對其編碼蛋白的結構和功能位點進行分析。將目的基因chr3連接到大腸桿菌載體pET28a上，然后轉化到大腸桿菌BL21中，構建重組大腸桿菌原核表達載體BL21-pET28a-chr3，并通過高效液相色譜技術(HPLC)驗證重組蛋白的催化性質及效率?！窘Y果】 成功克隆chr3基因，其全長序列長1 416 bp (GenBank 登錄號:KF927169)，成功構建了大腸桿菌原核表達載體BL21-pET28a-chr3。HPLC檢測結果表明，重組蛋白CHR3催化合成了異甘草素，使大豆異甘草素含量提高到了33.673 μmol/g?！窘Y論】 分離鑒定了大豆chr3，其編碼蛋白CHR3催化活性明顯提高。

大豆；大豆苷元；查爾酮還原酶3基因；基因克??；大腸桿菌

大豆苷元能夠調節多項植物生理功能并增強植物對生態環境的適應能力，且在許多基礎的植物生理過程中發揮重要作用。同時大豆苷元對于人體有著直接且重要的保健作用，如能夠降低膽固醇含量和預防一些癌癥[1-3]。

Welle等[4]首次在大豆中鑒定了查爾酮還原酶(Chalcone Reductase，CHR)及其催化功能。在紫花苜蓿等其他豆科植物中陸續分離鑒定了chr基因及其蛋白產物，并發現CHR特異性地存在于豆科植物中[5]。大豆苷元的生物合成過程是大豆異黃酮合成途徑的一個分支。以香豆醛輔酶A和丙二?；o酶A為底物，經CHR與查爾酮合成酶(Chalcone Synthase,CHS)聯合反應，得到產物4，2′，4′-三羥基查爾酮(異甘草素)，異甘草素能夠為查爾酮異構酶(Chalcone Isomerase,CHI)作用生成甘草素，構成異黃酮類化合物的15個碳原子的基本骨架，再在異黃酮合成酶(Isoflavone Synthase,IFS)作用下催化合成大豆苷元[6]。所以，CHR催化生成的化合物是大豆苷元合成所必需的前體物質[7]。同時，在缺乏CHR的情況下，前述幾種酶蛋白的反應路徑則會進入染料木素的合成途徑中。Terrence等[8]研究證明，當通過RNAi技術干擾已知的大豆chr1基因的表達，僅導致大豆苷元含量明顯減少，而染料木素等其他種類的異黃酮化合物含量則保持恒定或者升高。這一結果證明，大豆苷元與染料木素在生物體中的合成存在競爭關系。因此，探索大豆異黃酮合成代謝途徑，克隆并鑒定chr基因功能對研究大豆苷元的合成與調控都具有重要的意義[9]。本研究采用RACE技術，克隆大豆查爾酮還原酶3基因(chr3)，探討新基因chr3在大豆苷元合成中的作用機理，以期為探索大豆苷元的合成機制和實際應用提供必要的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

大豆品種“吉農17”、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21、克隆載體pMD18-T、原核表達載體pET28a均由吉林農業大學生物技術中心實驗室保存。

1.2 主要試劑

3′ RACE試劑盒、5′ RACE試劑盒、PCR相關試劑、dNTP、T4 RNA連接酶、T4 DNA連接酶以及各種限制性內切酶，均購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，均購自北京鼎國生物工程有限公司；Ni-NTA購自Pharmacia 公司；其他試劑和藥品均為國產分析純。

1.3 chr3基因cDNA全長片段的克隆[10-12]

1.3.1 核心片段 使用 RNAiso試劑盒(TaKaRa公司)提取大豆新鮮葉部組織的總RNA。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (FERMENTAS公司)操作說明合成cDNA，-20 ℃保存備用。PCR反應體系：Total RNA 3 μL,oligo(dT)181 μL，5×Reation Buffer 4 μL，RiboLock M-MuLV 逆轉錄酶1 μL，ddH2O 11 μL。42 ℃條件下孵育1 h，72 ℃條件下5 min終止反應。

掃描NCBI網站中大豆EST文庫，獲得chr基因的核心片段(GenBank登錄號：TC365874)，設計特異性引物Chr1-GSP1和Chr1-GSP2，Chr1-GSP1序列為5′-ATGTCGATCCCTATACCTT-3′，Chr1-GSP2序列為5′-TTAAGGAGACTTGTACCAC-3′。以逆轉錄的 cDNA 為模板，利用引物 Chr1-GSP1 和 Chr1-GSP2 通過 PCR 反應擴增目的基因核心片段。PCR 反應體系如下：10×TaqBuffer 2.5 μL,MgCl22.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，Chr1-GSP1 1 μL，Chr1-GSP2 1 μL，cDNA 1 μL，TaqDNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 28.75 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸 8 min。

1.3.2 3′端cDNA片段 以大豆新鮮葉部組織的RNA為模板，按照3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa公司)說明書進行3′ RACE。使用引物Chr1-GSP1和3′ RACE試劑盒中Outer Primer進行Outer PCR擴增反應，再以擴增產物為模板，使用引物Chr1-GSP2和3′RACE試劑盒中的Inner Primer進行Inner PCR反應，擴增得到目的基因3′端序列。Outer PCR反應體系：上述1.3.1的反轉錄反應液 1 μL,1×cDNA Dilution Buffer 8 μL，3′ RACE Control Outer Primer 2 μL,3′ RACE Outer Primer 2 μL，10×LA PCR Buffer 4 μL，MgCl23 μL，TaKaRa LATaq0.25 μL，ddH2O 28.75 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性5min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環；72 ℃延伸10 min。

Inner PCR反應體系：Outer PCR產物 1 μL,dNTP Mixture 8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，3′ RACE Control Inner Primer 2 μL,3′ RACE Inner Primer 2 μL，MgCl25 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，ddH2O 26.5 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 5′端cDNA片段 以大豆新鮮葉部組織總RNA為模板，按照5′-Full RACE Kit(TaKaRa公司)說明書進行5′ RACE，通過 Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)以去掉mRNA的5′帽子結構，使用T4 RNA 連接酶將5′ RACE Adaptor連接到mRNA的5′ 端后，使用5′ RACE Adaptor上的引物與核心序列的引物Chr1-GSP1進行RT-PCR反應，高特異性地擴增目的基因的5′ 端序列。Outer PCR反應體系：上述1.3.1的反轉錄反應液 2 μL,1×cDNA Dilution Buffer 8 μL，5′ RACE Control Outer Primer 2 μL,5′ RACE Outer Primer 2 μL，10×LA PCR Buffer 4 μL，MgCl23 μL，TaKaRa LATaq0.25 μL，ddH2O 28.75 μL。 PCR擴增條件:94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20個循環；72 ℃延伸10 min。

Inner PCR反應體系：Outer PCR產物1 μL,dNTP Mixture 8 μL，10×LA PCR Buffer 5 μL，5′ RACE Control Inner Primer 2 μL,5′ RACE Inner Primer 2 μL，MgCl25 μL，TaKaRa LATaq0.5 μL，ddH2O 26.5 μL。 PCR擴增條件:94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 cDNA全長片段 將獲得的3′和5′端cDNA片段進行拼接，設計擴增全長基因片段的特異性引物GSP3和GSP4。GSP3序列為5′-ATGTCGATCCCTATACCTT-3′，GSP4序列為5′-TTAAGGAGACTTGTACCAC-3′。以大豆新鮮葉部組織總RNA反轉錄的cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。PCR 反應體系為：10×TaqBuffer 2.5 μL,MgCl22.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，GSP3 1 μL，GSP4 1 μL，cDNA 1 μL，TaqDNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 28.75 μL。PCR擴增條件除退火溫度升高到56 ℃外，其余條件均與1.3.1節相同。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的產物。

1.4 chr3基因編碼蛋白CHR3的結構與功能位點分析

應用在線程序ProMod Version 3.70 (http://beta.swissmodel.expasy.org/)，分析chr3基因編碼蛋白CHR3的氨基酸序列，預測chr3基因表達產物的基本性質及其催化功能。在NCBI網站中下載已知查爾酮還原酶基因序列，用DNAMAN軟件對chr3基因序列與下載的已知查爾酮還原酶基因序列進行同源性比對，同時用NCBI網站在線分析程序ORF FINDER(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對chr3基因序列進行開放閱讀框分析，并尋找基因的保守域，通過DNAMAN軟件將chr3基因開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，用MEGA 4.0軟件分析chr3基因編碼蛋白CHR3與其他物種CHR蛋白質的同源性，構建系統進化樹。

1.5 重組表達載體BL21-pET28a-chr3的構建

將目的基因Chr3連接到克隆載體pMD18-T上，構建載體pMD18T-chr3，以pMD18T-chr3載體為模板進行PCR反應，擴增帶有設計酶切位點的目的基因。用SalⅠ和XhoⅠ雙酶切擴增產物，經凝膠回收目的片段后，將其用T4 DNA連接酶連接至經同樣雙酶切處理的pET28a表達載體中，再轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取轉化菌落，經PCR和雙酶切鑒定，送至北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。將獲得的重組表達載體命名為BL21-pET28-chr3。同時，以原核表達載體pET28a為陰性對照。

1.6 表達產物的分離純化及SDS-PAGE電泳分析

將BL21-pET28a-chr3單菌落接種于5 mL的LB液體培養基(含100 mg/L卡那霉素)中，37 ℃條件下200 r/min振蕩培養過夜。再將菌液接種于100 mL新鮮LB液體培養基(含100 mg/L卡那霉素)中，37 ℃、200 r/min振蕩培養至OD600值約為0.6，加入IPTG至終濃度為5 mmol/L誘導表達，繼續22 ℃、200 r/min振蕩培養4 h。取表達產物，4 ℃、5 000 r/min離心10 min后收集菌體，用PBS重懸菌體，超聲破碎，分別收集上清液和沉淀。將上清液通過Ni-NTA柱進行親和層析，用10倍體積PBS溶液(20 mmol/L KH2PO4+0.2 mol/L NaCl,pH 7.6)平衡柱體，然后用含有30，200，400 mmol/L 咪唑的緩沖液(pH 7.6)進行梯度洗脫，收集各個洗脫峰，運用SDS-PAGE電泳分析收集成分。

1.7 chr3基因編碼蛋白CHR3的功能鑒定與分析[13-16]

1.7.1 CHR3蛋白的制備及其催化反應 將1.5中構建的BL21-pET28a-chr3重組載體單菌落接種于5 mL的LB液體培養基(含100 mg/L卡那霉素)中，37 ℃條件下200 r/min振蕩培養過夜。再將菌液接種于100 mL新鮮LB液體培養基(含100 mg/L卡那霉素)中，37 ℃振蕩培養至OD600值約為0.6，加入IPTG至終濃度為5 mmol/L誘導表達后，繼續于22 ℃、200 r/min振蕩培養4 h。取表達產物，4 ℃離心后收集菌體，用PBS重懸菌體，超聲破碎，收集BL21-pET28a-chr3菌液的處理液。稱取0.5 g大豆粉，將其與2.5 mL BL21-pET28a-chr3重組質粒菌液混合，調整pH為6.5，18 ℃條件下200 r/min振蕩處理45 min，將反應液立即置于80 ℃水浴中，終止催化反應。同時，以只含有pET28a質粒的BL21-pET28a為對照。

1.7.2 CHR3催化產物含量的測定 待1.7.1中大豆粉與重組蛋白CHR的催化反應終止后，將反應液轉移到50 mL三角瓶中，先加入7.5 mL體積分數90%甲醇溶液，超聲波處理之后浸泡過夜。過濾除去不溶的雜質，蒸發脫去萃取溶液中的溶劑，再加入乙醋酸鹽緩沖液充分溶解提取物，同時加入適量的纖維素酶，37 ℃條件下過夜，確保除去所有修飾異甘草素糖苷的糖基。然后采用乙酸乙酯萃取酶水解液中的配基異甘草素，再將乙酸乙酯萃取相于N2中蒸干。將獲得的樣品溶解于甲醇溶液中，用0.22 μm有機濾膜抽濾，上樣量為10 μL，用高效液相色譜技術(HPLC)進行定性與定量分析。

2 結果與分析

2.1 大豆chr3基因cDNA全長片段的克隆

2.1.1 核心片段 以大豆新鮮葉片總RNA轉錄的cDNA為模板，RT-PCR反應擴增目的基因的核心片段，得到長度為1 191 bp的片段(圖1-A)。測序結果表明，擴增片段與NCBI中EST文庫對應序列相似度為99%。

2.1.2 3′端cDNA片段 以大豆新鮮葉片總RNA轉錄的chr-1 cDNA為模板，使用特異性引物chr-1 GSP1分別與3′ RACE試劑盒中的引物擴增目的基因chr3 3′端片段，測序結果表明，獲得的片段長度為1 294 bp，其中1 135 bp的區域與核心序列重疊，有159 bp的序列為新擴增的片段(圖1-B)。

2.1.3 5′端cDNA片段 以大豆新鮮葉片總RNA轉錄的cDNA為模板，按照5′-Full RACE Kit說明書，擴增目的基因chr3的5′端片段，測序結果表明，得到的片段為533 bp，與核心片段有467 bp的重疊區域(圖1-C)。

圖1 大豆chr3基因的克隆A.核心片段;B.3′端cDNA片段;C.5′端cDNA片段;M.DNA標準分子量;1～2.PCR 產物

2.1.4 cDNA全長片段 將chr3 3′端cDNA片段和5′端cDNA片段的克隆測序結果進行拼接，去掉中間411 bp的重疊區域，得到chr3全長基因序列。設計擴增全長序列的特異性引物GSP3和GSP4,以大豆新鮮葉片的cDNA為模板，PCR反應擴增chr3基因的全長cDNA序列，得到長度為1 416 bp的片段，將其在GenBank上注冊,登錄號為KF927169(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF927169)。

2.2 大豆chr3基因編碼蛋白CHR3的結構與功能位點預測

根據ProMod Version 3.70分析結果，理論預測chr3基因編碼含有345個氨基酸殘基的蛋白產物CHR3，其分子質量為32 189.42 u，理論等電點為5.90。對chr3基因編碼蛋白CHR3的氨基酸序列分析發現，其中在48-65和72-155處共含有2個Aldo/Keto還原酶家族特征性催化位點 (Aldo/Keto reductase family signature)，預示該蛋白可能屬于Aldo/Keto型還原酶蛋白。同時構建chr3基因編碼蛋白CHR3的3D立體結構，結果如圖3所示。圖3顯示，chr3基因編碼蛋白CHR3的3D立體結構中含有典型的Aldo/Keto型還原酶超家族(Aldo/Keto reductase superfamily，AKRs)的(α/β)8型桶式折疊結構。

圖2 大豆chr3基因全長片段的PCR擴增結果 M.DNA標準分子量；1.PCR產物Fig.2 PCR product of soybean full chr3 geneM.DNA Marker;1.PCR product

圖3 預測的大豆chr3基因編碼蛋白3D立體結構Fig.3 Three-dimensional structure of protein of soybean chr3 gene

氨基酸同源性分析表明，chr3基因編碼蛋白CHR3與大豆已知的CHR1蛋白的同源性為82%，與CHR2蛋白的同源性為98%。系統進化樹分析結果(圖4)顯示，CHR3的進化距離與CHR2更為相近,與CHR1稍遠，相對于CHR1，CHR3與葛根、苜蓿等其他物種的進化距離較遠，這也反映了大豆中不同CHR蛋白的進化趨勢是有差異的。

圖4 大豆chr3基因編碼蛋白CHR3與其他物種CHR蛋白的系統進化樹分支上的數字表示該樹枝可信度的百分比
Fig.4 Phylogenetic tree of CHR protein Numbers on the cluster nodes are homology ratios among CHR verified by bootstrap

2.3 大豆重組蛋白CHR3在大腸桿菌中的表達與純化

用在線分析程序ORF FINDER(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)對chr3基因序列進行開放閱讀框分析，預測其長度為969 bp。經限制性內切酶SalⅠ、XhoⅠ酶切后，將chr3開放閱讀框序列連接到原核表達載體pET28a，將重組載體轉化到大腸桿菌BL21中，得到重組質粒BL21-pET28a-chr3，對其進行PCR和雙酶切鑒定，結果(圖5和圖6)顯示，重組質粒BL21-pET28a-chr3構建成功。

圖5 大豆chr3基因原核表達載體 BL21-pET28a-chr3的PCR擴增結果 M.DNA標準分子； 1～4.BL21-pET28a-chr3的PCR產物；5.陰性對照 (pET28a)Fig.5 PCR identification of recombinant vector of soybean chr3M.DNA Marker;1-4.PCR products of BL21-pET28a-chr3 recombinant vector;5.Negative control (pET28a)

圖6 大豆chr3基因原核表達載體 BL21-pET28a-chr3的雙酶切鑒定結果 M.標準DNA分子；1，2.陰性對照 (pET28a)；3，4.BL21-pET28a-chr3的SalⅠ、XhoⅠ雙酶切產物Fig.6 Double digest identification of BL21-pET28a-chr3 recombinant vector of soybean chr3 M.DNA Marker;1,2.Negative control (pET28a);3,4.Products of BL21-pET28a-chr3 recombinant vector digested by SalⅠ and XhoⅠ

將構建的大腸桿菌工程菌BL21-pET28a-chr3用IPTG誘導表達4 h后，超聲破碎樣品，并用Ni-NTA柱進行親和層析，將純化的目的蛋白進行SDS-PAGE分析,結果(圖7)顯示，在誘導前沒有目的條帶出現，誘導但未純化的樣品中有分子質量約為32.5 ku的條帶出現，與chr3基因表達產物的預期分子質量相符；此外，純化后樣品中只含有1條目的條帶。經分析，表達產物約占菌體總蛋白的20%，說明CHR蛋白已能在大腸桿菌中正常表達。

圖7 大豆重組CHR3蛋白的SDS-PAGE鑒定M.標準低分子量蛋白；1.IPTG誘導前的表達蛋白；2.IPTG誘導后的表達蛋白；3.經過Ni-NTA柱純化后的蛋白

2.4 大豆重組蛋白CHR3的催化功能

通過HPLC技術檢測催化反應產物，鑒定基因chr3表達產物的催化功能。觀察反應前后大豆粉中異甘草素的含量變化，結果如圖8所示。由圖8可以看出，異甘草素的保留時間為(5.374±0.1) min。在對照組中異甘草素峰面積為542 256，換算成含量為1.597 μmol/g，在重組蛋白CHR3處理的樣品中，異甘草素峰面積則明顯上升，為1 241 766,換算成含量為33.673 μmol/g。說明大腸桿菌表達的CHR3蛋白催化合成了異甘草素。

3 討 論

CHR3行使催化作用時需要在NADPH存在情況下與查爾酮合成酶(CHS)聯合作用。而對于這種聯合作用機制目前尚不清楚。Dixon等[15]認為，在豆科植物中CHR與CHS都是以多基因型的形式存在于基因組中，并且其基因數量呈現出一種復雜的對應關系。迄今為止，在紫花苜蓿中發現了5種chr3基因；蒺藜苜蓿中發現了6種chr3基因；鷹嘴豆和黃芪等豆科植物也都分離得到2種以上chr基因，而大豆中至今僅確認了chr1(GenBank登錄號:X55730)和chr2 (GenBank登錄號:KF758935)2種基因。同時在大豆中已經至少發現了9種chs3基因。大豆中已知的chr3基因與chs3基因數量的不匹配限制了人們對于CHR與CHS聯合作用機制的研究。

圖8 重組蛋白CHR3催化后大豆粉中異甘草素含量的HPLC分析圖譜

目前，已知的所有CHR都被驗證屬于AKRs超家族[17-18]。AKRs是自然界中三大氧化還原蛋白超家族中的一種。該蛋白超家族的結構特點是每個單體含有(α/β)8型桶式折疊結構，平均含有320個氨基酸殘基，依靠NAD(P)(H)結合在催化位點上形成具有催化活性功能的酶蛋白[19-20]。另外分析顯示所有CHR蛋白進化趨勢相對保守，但在不同物種間還是有一定的差異。本研究分離得到能夠編碼345個氨基酸殘基的新大豆chr3基因，預測其表達產物的肽鏈結構均符合上述特點。同時chr3基因編碼蛋白CHR3在進化趨勢上與chr1基因編碼蛋白CHR1稍遠，與chr2基因編碼蛋白CHR2更為接近。本研究構建了含有chr3基因的原核表達載體pET28a-chr3，并將其重組到大腸桿菌BL21中并誘導表達，催化大豆粉中的底物合成了異甘草素，在對照組中異甘草素含量為 1.597 μmol/g，在重組菌處理的樣品中異甘草素含量為33.673 μmol/g，重組菌的異甘草素含量是對照組的21.1倍，從而為確認chr3克隆成功，且其編碼蛋白有明顯的體外催化活性。

在大豆中，當染料木素不再進行代謝，直接貯存大豆苷元于細胞的液泡中，大豆苷元則作為大豆抗毒素類化合物合成必需前體物質被持續代謝。由于在大豆等豆科植物中大豆苷元含量少于染料木素，因此關于大豆苷元的相關研究和實際應用均落后于染料木素。關于大豆苷元的合成機理研究因為chr3基因資源不足而受到限制[21-23]，本研究分離鑒定了一個新的大豆chr3基因，為研究大豆苷元的合成機理、基因調控和生產應用奠定了必要的基礎。

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Cloning of soybean chalcone reductase gene (chr3) and its expression inEscherichiacoli

ZHANG Chaoa,WANG Pi-wua,ZHANG Zhuob

(aCollegeofAgriculture,bCollegeofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 Soybean chalcone reductase 3 (chr3) was cloned and its coding protein catalyticinvitrowas analyzed to provide references for synthesis and regulation of daidzein.【Method】 The soybeanchr3 was amplified by RACE technology and the domain and function of its coding protein was analyzed using soybean “Jinong 17” as material.The fragment was introduced into pET28a vector,which was transformed intoE.coliBL21.Recombinant vector BL21-pET28a-chr3 was constructed and recombinant protein was verified by high performance liquid chromatography (HPLC).【Result】 The geneschr3 (GenBank accession:KF927169) with full length of 1 416 bp was cloned successfully.The recombinant vector BL21-pET28a-chr3 was constructed successfully,and HPLC showed that synthesis of isoliquiritigenin catalyzed by recombinant protein increased the content of soybean isoliquiritigenin to 33.673 μmol/g.【Conclusion】 The soybeanchr3 genes was isolated and identified,which improved catalytic activities of coding protein CHR3.

soybean;daidzein;chalcone redutase 3 gene (chr3);gene cloning;Escherichiacoli

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.013

2014-01-20

國家自然科學基金面上項目“大豆查爾酮還原酶(CHR)在大豆苷元合成中的作用機理”(31171568)

張 超(1988-),男，吉林長春人, 在讀碩士，主要從事生物技術在作物遺傳育種中的應用研究。 E-mail：312703991@qq.com

王丕武(1958-)，男，吉林長春人，教授，博士，博士生導師，主要從事生物技術與作物遺傳育種研究。 E-mail：peiwuw@163.com

Q78;S565.103.3

A

1671-9387(2015)09-0089-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.026.html