二氫異喹啉抗菌物質對植物種子萌發及幼苗生長的影響

鄭作略，苗 芳，楊新娟，周 樂

(西北農林科技大學 a 理學院，b 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

二氫異喹啉抗菌物質對植物種子萌發及幼苗生長的影響

鄭作略a，苗 芳b，楊新娟a，周 樂a

(西北農林科技大學 a 理學院，b 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究2-芳基-6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽類化合物對植物種子發芽和幼苗生長的安全性，為此類化合物作為新型植物抗菌藥物的開發應用提供理論依據?！痉椒ā?將糜子和油菜種子在14種2-芳基-6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽類化合物(Z-1～Z-14)溶液中浸種20 h后，均勻點播于含無離子水的培養皿中，在設定條件下進行培養，測定種子的發芽率、根長、莖長、總鮮質量、總干質量和相對含水量?！窘Y果】 在100 μg/mL測試質量濃度下，化合物Z-1、Z-3、Z-12、Z-13和Z-14對1種或2種作物的個別生長指標有顯著的抑制作用，化合物Z-2、Z-4、Z-9和Z-10能夠顯著促進糜子根和莖的生長，同時對糜子的發芽率和幼苗的相對含水量沒有顯著影響；其他供試化合物對糜子和油菜的種子發芽和幼苗生長均無顯著影響?！窘Y論】 除化合物Z-1、Z-3、Z-12、Z-13和Z-14外，其他供試的化合物在質量濃度≤100 μg/mL時，對受試作物的種子萌發和幼苗生長均不會產生不良影響，部分化合物還具有促進作物根莖生長的效果，具備進一步評測后作為作物抗菌劑開發的可能。

異喹啉類化合物；抗菌藥物；作物抗菌劑；安全性評價

生物堿具有來源廣泛和藥理活性多樣的特點，在以天然化合物為先導的藥物研發中具有非常重要的地位。季銨型苯并啡啶類生物堿(Benzo[c]phenanthridine alkaloid,QBAs)是一類數量較少且結構特殊的異喹啉類化合物，其最常見的化合物是血根堿和白屈菜紅堿。QBAs具有顯著的抗腫瘤[1-3]、抗菌[4-10]、抗炎[11]、抗血小板凝集[12]、抗寄生蟲[13-16]等多種藥理活性，是一類研發新型抗腫瘤、抗菌等藥物的理想先導化合物。據此，在前期研究中，本課題組根據QBAs的活性決定簇，采用結構仿生策略，以QBAs為分子模板，設計并合成了一系列天然QBAs的類似物(溴化2-芳基-6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽)，即仿生化合物，活性測定結果表明，與QBAs類似，絕大多數仿生化合物對10余種植物病原菌均有良好的抑制活性，且其中部分化合物的活性顯著強于QBAs[17]，具有替代QBAs而成為新型農用抗菌藥物的巨大潛力[18-19]。本研究進一步就此類仿生化合物對作物的安全性進行了評價，以期篩選出安全高效的抗菌候選藥物，為此類仿生化合物作為新型植物抗菌藥物的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 同立牌甘藍型油菜雜交種改良陜油6號(品種審定編號：陜審油2005004)，由陜西楊凌農科大農業科技發展公司提供。榆糜2號糜子(PanicummiliaceumL.)種子，由西北農林科技大學農學院馮百利教授提供。

1.1.2 試劑與儀器 供試樣品：14個溴化2-芳基-6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽(Z-1～Z-14)，純度>95%(HPLC)，具體結構如圖1所示。以上化合物均按照文獻[17]的方法合成并經波譜技術進行結構鑒定。

圖1 14種溴化2-芳基-6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽(Z-1～Z-14)的結構

二甲基亞砜(DMSO)，分析純，天津博迪化工股份有限公司。BIC-300型氣候培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 標題化合物對作物生長的安全質量濃度

按照文獻[20-21]的方法，采用平皿法測定供試化合物對植物的安全性。隨機選取化合物Z-1和Z-3為參考，以抗菌化合物對植物真菌的半數有效濃度(EC50)為參考指標[18]，以體積分數0.5%的DMSO水溶液為溶劑，將Z-1和Z-3配制成200 μg/mL的溶液，采用對倍稀釋法配制100，50及25 μg/mL的測定液備用。挑選顆粒飽滿、大小一致的糜子或油菜種子90粒，放入設定濃度的Z-1和Z-3溶液中浸種，20 h后，取出種子，用清水洗凈種子表面的藥液。將浸種后的種子隨機均分為3組，每組30粒，均勻點播于鋪有雙層濾紙的培養皿(Φ=9 cm)中，每皿加入30滴純水。將培養皿用雙層濕紗布覆蓋后置于相對濕度為100%的氣候培養箱中進行培養。氣候培養箱設置為：每天光照和黑暗各12 h，光照期間保證光照充足，溫度為(26±1) ℃；黑暗期間關閉熱源，溫度自然降至17 ℃左右。期間每隔3～4 h觀察一次水分情況，并及時補水；在設定的處理時間統計種子的發芽和生長情況。以體積分數0.5%的DMSO水溶液浸種作為空白對照。待空白對照組的發芽率超過90%后繼續培養72 h，測定每個試驗濃度下單個種子的平均根長和平均莖長以及每個試驗組所有種子(30粒)的總鮮質量和總干質量。單個種子的平均相對含水量按下式進行計算：相對含水量=(總鮮質量-總干質量)/總鮮質量×100%。

根據上述試驗結果，選取對種子發芽及生長無抑制作用的最大質量濃度為安全質量濃度，采用同樣方法測定其他化合物的安全性。

1.3 數據處理

采用SPSS V19.0軟件對試驗數據進行統計分析。試驗數據均采用“平均值±標準差”表示，數據間差異顯著性采用鄧肯氏多重比較法進行。

2 結果與分析

2.1 化合物Z-1和Z-3對糜子、油菜種子萌發及幼苗生長的影響

為了確定化合物對作物的最大安全測試質量濃度，隨機選定Z-1和Z-3作為代表，測定其在不同質量濃度下對糜子和油菜種子發芽和幼苗生長的影響，結果見表1～3。

從表1可以看出，Z-1不同質量濃度處理組對于糜子的發芽率無顯著影響(P>0.05)；Z-1對油菜發芽總體無顯著影響，僅在200 μg/mL時具有顯著的抑制作用(P<0.05)。Z-3所有質量濃度處理組對糜子和油菜的發芽率均無顯著影響(P>0.05)。

表1 不同質量濃度Z-1和Z-3對糜子、油菜種子發芽率的影響 Table 1 Effects of various mass concentrations of Z-1 and Z-3 on germination rate of Panicum miliaceum L. and Brassica campestris L. %

注：*同種植物的同列數據后標不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。表2～6相同。

Note:Different lowercase letters within each column mean significant difference (P<0.05).The same for Tables 2-6.

表2 不同質量濃度Z-1對糜子和油菜幼苗生長的影響Table 2 Effect of various mass concentrations of Z-1 on seedling growth of Panicum miliaceum L. and Brassica campestris L.

注：*總鮮質量和總干質量為各試驗組所有幼苗的鮮質量和干質量。表3,5,6同。

Note:Gross fresh weight and gross dry weight represent fresh weight and dry weight of all seedlings in each group.The same for Tables 3,5,6.

由表2可以看出，各質量濃度Z-1處理對糜子的根莖生長均無顯著性影響(P>0.05)，但對幼苗相對含水量有顯著降低作用(P<0.05)，對總鮮質量和總干質量有顯著促進作用(P<0.05)。對油菜而言，25～100 μg/mL的Z-1對根長具有顯著的促進作用(P<0.05)，但200 μg/mL Z-1對油菜根長的促進作用消失；所有質量濃度Z-1處理對莖生長均表現出了顯著的抑制作用(P<0.05)，對幼苗的總鮮質量和總干質量有不同程度的抑制作用，對相對含水量則無顯著影響(P<0.05)。

由表3可以看出，對糜子而言，200 μg/mL Z-3對糜子幼苗的莖長、總鮮質量、總干質量有顯著的抑制作用(P<0.05)；50和100 μg/mL Z-3對糜子的總鮮質量有顯著抑制作用(P<0.05)，對根長、莖長、總干質量及相對含水量大多無顯著影響。對于油菜而言，所有質量濃度Z-3處理對根長均有顯著的促進作用(P<0.05)，對莖長呈現不同程度的抑制作用，對幼苗的總干質量和相對含水量均無顯著影響(P>0.05)，對總鮮質量則呈現不規律的顯著抑制或促進作用。

綜合分析可見，對糜子和油菜種子的發芽及根生長而言，100 μg/mL Z-1或Z-3是安全的，因此選擇100 μg/mL作為其他化合物安全性評價的測試質量濃度。

2.2 其他化合物對糜子和油菜種子萌發及幼苗生長的影響

基于2.1節的結果，選擇100 μg/mL為測試質量濃度，采用與1.2節相同的方法測定其他12種化合物(Z-2，Z-4～Z-14)對糜子和油菜種子萌發和生長的影響，結果見表4～6。

表4顯示，對糜子48 h的發芽率而言，Z-2、Z-4、Z-6和Z-9處理組顯著高于空白對照(P<0.05)，其他化合物處理組與空白對照均無顯著性差異(P>0.05)；對于糜子72 h的發芽率而言，Z-2、Z-4、Z-9和Z-10處理組顯著高于空白對照(P<0.05)，其他化合物處理組與空白對照均無顯著性差異(P>0.05)。上述結果說明，Z-2、Z-4、Z-6、Z-9和Z-10對糜子的發芽具有顯著促進作用，其他化合物對糜子發芽無顯著影響。

表4 12種供試化合物對糜子和油菜種子發芽率的影響 Table 4 Effect of 12 tested compounds on germination rate of Panicum miliaceum L.and Brassica campestris L. %

對于油菜48 h的發芽率而言，Z-12、Z-13和Z-14處理組顯著低于空白對照(P<0.05)，其他化合物處理組與空白對照組無顯著差異(P>0.05)；對于油菜72 h的發芽率而言，化合物Z-5、Z-8和Z-10的處理組顯著高于空白對照(P<0.05)，Z-12和Z-14處理組顯著低于空白對照(P<0.05)。以上結果表明，Z-12和Z-14對油菜發芽有一定抑制作用，而Z-5、Z-8和Z-10有一定的促進作用，其他化合物無顯著影響。

表5顯示，對于糜子的根生長情況而言，Z-4、Z-8、Z-9和Z-10處理組顯著高于空白對照組(P<0.05)，其他化合物處理組與空白對照無顯著性差異(P>0.05)；對于糜子的莖生長而言，Z-2、Z-9和Z-10處理組顯著高于空白對照組(P<0.05)，Z-6、Z-12、Z-13和Z-14處理組顯著低于空白對照組(P<0.05)，其他化合物處理與空白對照處理差異不顯著；對于糜子的總鮮質量和總干質量而言，除Z-12處理總鮮質量及Z-12、Z-13處理組總干質量與空白對照組無顯著差異外，其他處理均顯著高于空白對照組，表明絕大部分供試化合物對糜子幼苗的總鮮質量和總干質量有一定的促進作用；對糜子幼苗的相對含水量而言，所有供試化合物組與空白對照組間均無顯著差異(P>0.05)，說明其對糜子幼苗的相對含水量無顯著影響。

表5 12種供試化合物(100 μg/mL)對糜子幼苗生長的影響Table 5 Effect of 12 tested compounds (100 μg/mL) on seedling growth of Panicum miliaceum L.

表6顯示，對于油菜幼苗的根長、莖長及總干質量而言，各化合物處理組與相應的空白對照組間均無顯著性差異(P>0.05)；在相對含水量方面，僅Z-14處理組較空白對照組顯著降低，其他供化合物處理組與空白對照組均無顯著差異(P>0.05)；在總鮮質量方面，Z-14處理組顯著低于空白對照組(P<0.05)，Z-5、Z-9、Z-12處理與空白對照差異不顯著(P>0.05)，其他各化合物處理均顯著高于空白對照組(P<0.05)。以上結果說明，除Z-14對油菜的總鮮質量和相對含水量有一定的不良影響外，其他化合物對油菜的所有生長指標均無不良影響。

表6 12種供試化合物(100 μg/mL)對油菜幼苗生長的影響Table 6 Effect of 12 tested compounds (100 μg/mL) on seedling growth of Brassica campestris L.

2.3 化合物對糜子和油菜種子萌發及幼苗生長的安全性評價

根據2.1和2.2節的試驗結果，表7列出了各化合物(100 μg/mL)對糜子和油菜種子的萌發及幼苗生長的安全性評價結果。由表7可以看出，在14種供試化合物中，有9種化合物(Z-2、Z-4～Z-11)對2種作物的所有生長指標均無顯著不良影響，且幾乎每個化合物對每種植物的一個或數個生長指標還具有改善作用；有5個化合物(Z-1、Z-3、Z-12～Z-14)對1種或2種植物的個別生長指標具有顯著的不良作用。

表7 14種供試化合物對糜子和油菜發芽及幼苗生長的安全性(100 μg/mL)Table 7 Safety of 14 tested compounds (100 μg/mL) on plant seed germination and seedling growth of Panicum miliaceum L. and Brassica campestris L.

注：*PM和BC分別代表糜子和油菜；+、―和o分別表示顯著提高、顯著抑制和無顯著影響。

Note:PM and BC representP.miliaceumL.andB.campestrisL.,respectively.+,― and o mean improvement,inhibition and no significant effect,respectively.

3 結論與討論

本研究評價了14種溴化2-芳基6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽類化合物對單子葉植物糜子和雙子葉植物油菜發芽、幼苗生長的影響和安全性，結果表明用其(100 μg/mL)浸種時，絕大部分化合物對植物的發芽、根生長、莖生長、幼苗質量及相對含水量等無顯著影響，當其使用質量濃度≤100 μg/mL 時，多數化合物對植物的生長是安全的，而且有些化合物對植物的生長還具有一定的促進作用。

供試化合物是一類天然抗菌化合物QBAs的簡單類似物。與QBAs相比，該類化合物對植物病原菌的抑制活性更強、抗菌譜更廣[18]，對多數植物病原菌的EC50<20 μg/mL[19-21]。一般而言，植物抗菌劑實際使用的質量濃度多為其EC50值的2～3倍，據此推斷，供試化合物作為植物抗菌劑的實際使用質量濃度應<60 μg/mL。結合本研究的結果，筆者認為，在藥效和安全性2個方面供試化合物均具有良好的開發前景。

2-芳基-3,4-二氫異喹啉鹽是另一類與2-芳基-6,7-亞甲二氧基-3,4-二氫異喹啉鹽結構高度類似但不相同的抗菌化合物，二者的差異僅在于后者較前者多了一個6,7-亞甲二氧基。張冰玉等[22]報道了8個2-芳基-3,4-二氫異喹啉鹽對植物種子萌發及幼苗生長的影響，并證明當浸種質量濃度為100 μg/mL 時，其中7個化合物對植物是安全無害的，這與本研究的結果基本一致。此外，向N-苯環上引入不同取代基一般不會導致2-苯基-3,4-二氫異喹啉鹽類對植物生長的明顯危害。本研究的結果則進一步證明，在分子中存在6,7-亞甲二氧基時，向N-苯環的不同位置引入不同的取代基一般也不會引起分子對植物生長的明顯危害?；蛘哒f，向2-芳基-3,4-二氫異喹啉分子中引入6,7-亞甲二氧基對植物生長是安全的。

農用抗菌劑的使用一般有葉面噴施、灌根和浸種3種方式。3種方式所采用的藥物質量濃度可以相同，也可以不同。通常，葉面噴施和浸種質量濃度較小，灌根質量濃度較大。雖然本研究的結果證明，用供試化合物浸種不會影響植物種子的發芽和幼苗生長，但尚不能說明其葉面噴施和灌根不會影響植物的生長發育，這有待進一步深入研究。

[1] Vrba J,Dolezel P,Vicar J,et al.Cytotoxic activity of sanguinarine and dihydrosanguinarine in human promyelocytic leukemia HL-60 cells [J].ToxicolinVitro,2009,23:580-588.

[2] Jang B C,Park J G,Song D K,et al.Sanguinarine induces apoptosis in A549 human lung cancer cells primarily via cellular glutathione depletion [J].ToxicolinVitro,2009,23:281-287.

[3] Ahsan H,Reagan-Shaw S,Breur J,et al.Sangninarine induces apoptosis of human pancreatic carcinoma AsPC-1 and BxPC3 cells via modulations in Bcl-2 family proteins [J].Cancer Lett,2007,249:198-208.

[4] Meng F Y,Zuo G Y,Hao X Y,et al.Antifungal activity of the benzo[c]phenanthridine alkaloids fromChelidoniummajusLinn against resistant clinical yeast isolates [J].J Ethnopharmacol,2009,125:494-496.

[5] Zuo G Y,Meng F Y,Hao X Y,et al.Antibacterial alkaloids fromChelidoniummajusLinn (Papaveraceae) against clinical isolates of methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].J Pharm Pharm Sci,2008,11:90-94.

[6] Mahajan V M,Sharma A,Rattan A.Antimycotic activity of berberine sulphate:An alkaloid from an Indian medicinal herb [J].Sabouraudia,1982,20:79-81.

[7] Iwasa K,Kamigauchi M,Ueki M,et al.Antibacterial activity and structure-activity relationships of beberine analogs [J].Eur J Med Chem,1996,31:469-478.

[8] Pitea M,Margineanu C.Correlations between chemical structure and antibacterial activity of berberine [J].Clujul Med,1972,45:465-469.

[9] Miao F,Yang X J,Zhou L,et al.Structural modification of sanguinarine and chelerythrine and their antibacterial activity [J].Natural Product Research,2011,25(9):863-875.

[10] Yang X J,Miao F,Yao Y,et al.Invitroantifungal activity of sanguinarine and chelerythrine derivatives against phytopathogenic fungi [J].Molecules,2012,17:13026-13035.

[11] Lenfeld J,Kroutil M,Marsálek E,et al.Antiinflammatory activity of quaternary benzophenanthridine alkaloids fromChelidonoummajus[J].Planta Med,1981,43:161-165.

[12] Tsai I L,Wun M F,Teng C M,et al.Anti-platelet aggregation constituents from formosanToddaliaasiatica[J].Phytochemistry,1998,48:1377-1382.

[13] Miao F,Yang X J,Ma Y N,et al.Structural modification of sanguinarine and chelerythrine and theirinvitroacaricidal activity againstPsoroptescuniculi[J].Chem Pharm Bull,2012,60:1508-1513.

[14] Yao J,Li X,Shen J,et al.Isolation of bioactive components fromChelidoniummajusL.with activity againstTrichodinasp. [J].Aquaculture,2011,318:235-238.

[15] Wang G X,Zhou Z,Jiang D X,et al.Invivoanthelmintic activity of five alkaloids fromMacleayamicrocarpa(Maxim) Fedde againstDactylogyrusintermediusinCarassiusauratus[J].Vet Parasitol,2010,171:305-313.

[16] Nyangulu J M,Hargreaves S L,Sharples S L,et al.Antimalarial benzo [c] phenanthridines [J].Bioorg Med Chem Lett ,2005,15:2007-2010.

[17] Yang X J,Yao Y,Qin Y Y,et al.Synthesis andinvitroantifungal activities of new 2-aryl-6,7-methylenedioxy-3,4-dihydroisoquinolin-2-ium bromides [J].Chem Pharm Bull,2013,61(7):731-739.

[18] Hou Z,Yang R,Zhang C,et al.2-(substitutedphenyl)-3,4-dihydroisoquinolin-2-iums as novel antifungal lead compoounds:Biological evaluation and structure-activity relationships [J].Molecules,2013,18:10413-10424.

[19] Ma Y N,Yang X J,Pan L,et al.Synthesis of 2-aryl-3,4-dihydroisoquinolin-2-ium bromides and theirinvitroacaricidal activity againstPsoroptescuniculi[J].Chem Pharm Bull,2013,61(2):204-211.

[20] 竇花妮,鄭昀紅,徐小燕,等.新型芳氧乙酰胺類化合物的合成與除草活性 [J].農藥,2009,48(10):720-723.

Dou H N,Zheng Y H,Xu X Y,et al.Synthesis and herbicidal activities of new aryloxyacetamide compounds [J].Agrochemicals,2009,48(10):720-723.(in Chinese)

[21] 陸 濤,汪雨瀟.吡唑并嘧啶衍生物的合成及其生物活性研究 [J].江西師范大學學報:自然科學版,2011,35(1):10-14.

Lu T,Wang Y X.The study on synthesis and biological activity of pyrazolopyrimidine derivatives [J].Journal of Jiangxi Normal University:Nat Sci Ed,2011,35(1):10-14.(in Chinese)

[22] 張冰玉，鄭作略，苗 芳，等.2-芳基-3,4-二氫異喹啉類抗菌物質對植物種子萌發及幼苗生長的影響 [J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2014,42(3):169-174.

Zhang B Y,Zheng Z L,Miao F,et al.Effects of 2-aryl-3,4-dihydroisoquinolin-2-iums on seed germination and seedling growth [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2014,42(3):169-174.(in Chinese)

Effects of 2-aryl-3,4-dihydroisoquinolin-2-iums as antifungal agents on plant seed germination and seedling growth

ZHENG Zuo-lüea,MIAO Fangb,YANG Xin-juana,ZHOU Lea

(aCollegeofScience,bCollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This paper investigated the effects of 2-Aryl-6,7-methylenedioxy-3,4-dihydroisoquinolin-2-ium salts on plant seed germination and seedling growth to provide theoretical basis for the development and application of such compounds as new phytofungicides.【Method】 The seeds ofPanicummiliaceumL.andBrassicacampestrisL.were soaked in the solution of 14 2-Aryl-6,7-methylenedioxy-3,4-dihydroisoquinolin-2-ium salts for 20 h before being evenly sowed in Petri dish containing a small amount of deionized water.Then they were cultured in set conditions and germination rate,average root length,stem length,gross fresh weight,gross dry weight and relative water content were determined.【Result】 At 100 μg/mL,compounds Z-1,Z-3,Z-12,Z-13 and Z-14 showed significantly negative effects on some indicators of germination and growth of one or two plants.Compounds Z-2,Z-4,Z-9,and Z-10 significantly improved the roots and stems ofPanicummiliaceumL.The other compounds showed no significant effects.【Conclusion】 Except Z-1,Z-3,Z-12,Z-13 and Z-14,other tested compounds were safe to plants when used with mass concentrations of no higher than 100 μg/mL.Some compounds even promoted crops roots and stems,and could be developed as crop antifungal agents after further evaluation.

isoquinoline compounds;antifungal medicines;phytofungicides;safety evaluation

時間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.017

2014-02-21

國家自然科學基金項目(31000865，31172365，31101469)

鄭作略(1987-)，男，廣東汕頭人，在讀碩士，主要從事天然產物化學研究。E-mail:zhengzuolue@gmail.com

周 樂(1965-)，男，陜西蒲城人，教授，博士，博士生導師，主要從事藥物化學研究。 E-mail:zhoulechem@nwsuaf.edu.cn

O626.32

A

1671-9387(2015)09-0116-07

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.034.html