超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜法分析不同炮制紅參的化學成分差異

鐘 薇，戴雨霖，李曉宇，王一博，越 皓，劉淑瑩,2

(1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林 長春 130022)

人參屬傘形目、五加科植物人參PanaxginsengC. A. Meyer的干燥根。紅參是鮮人參的熟用品，加工過程中因發生熱解和水解反應，人參皂苷的種類和含量發生了變化，藥理作用也隨之發生改變[1-3]?，F代藥理研究表明，人參中皂苷類化合物是主要的活性成分，對增強人體免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗動脈硬化、抗高血壓、抗糖尿病、抗癌等有很好的作用[4-5]。人參皂苷屬三萜類化合物，按皂苷元結構的不同可分為原人參二醇型皂苷(Protopanaxadiol,PPD)、原人參三醇型皂苷(Protopanaxatriol,PPT)和齊墩果烷型人參皂苷(Oleanolic acid)3類。人參被批準為人參新資源食品后，呈現了適用人群擴大、方式多樣化的特點。紅參因炮制方法的不同，成分差異很大，蒸制紅參是在高溫條件下通過水蒸氣蒸制的；醋制紅參是在溫度、pH值酸性和水共同作用下獲得的；而烘干紅參是在高溫條件下炮制得到的。除紅參的傳統加工品外，醋制紅參和烘干紅參是新開發的人參產品，其藥效功能和化學成分不同于傳統的生曬參和紅參[6-8]。

本研究擬采用四極桿-靜電場軌道阱質譜分析高溫烘干紅參、蒸制紅參和醋制紅參的化學成分差異及含量，旨為更好地發揮人參不同炮制品的作用和指導臨床工作。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜系統、Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀：美國Thermo-Fisher公司產品。人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2對照品(純度均大于98%)：南京澤朗醫藥科技有限公司產品；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 紅參的炮制

蒸制紅參的制備：取鮮參，在100 ℃蒸參柜中蒸制4 h，于50 ℃鼓風烘箱中烘干。

醋制紅參的制備：取鮮參，在陳醋中浸泡30 min，向100 ℃蒸參柜中加入陳醋蒸制4 h，于50 ℃鼓風烘箱中烘干。

高溫烘干紅參：取鮮參，在105 ℃鼓風烘箱中高溫快速烘干。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取1 g紅參粉末，加入20 mL甲醇超聲提取30 min，蒸干濾液，再經乙醚脫脂，飽和正丁醇萃取，蒸干后加甲醇溶解，并定容至10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，即得。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 C18毛細管柱(100 mm×3 mm×1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～3 min、25%～30%A，3～6 min、30%～32%A，6～7 min、32%～35%A，7～13 min、35%～37%A，13～19 min、37%～48%A，19～22 min、48%～70%A，22～25 min、70%～90%A，30 min、25%A；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量0.5 μL。

1.4.2質譜條件 負離子掃描方式，霧化溫度300 ℃，霧化氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，質量掃描范圍m/z100～1 400。

2 結果與分析

靜電場軌道阱質量分析器的質量精度誤差小于1×10-6，全掃描模式自動觸發二級質譜，能夠在不因離子數目增加而損失靈敏度的前提下進行準確的定性分析，從而發現天然產物不同炮制品化學成分的差異[9-10]。紅參的3種不同炮制品的色譜圖示于圖1。

人參皂苷Rd、Re的理論值均為946.550 1，元素組成相同，且二者在一級質譜圖中均產生[M+HCOOH-H]-離子(理論值m/z991.548 3)，所以很難區分。人參皂苷Rd為二醇型人參皂苷，而人參皂苷Re為三醇型人參皂苷，在負離子模式下，它們的二級質譜圖示于圖2。人參皂苷Rd丟失1～3分子中性葡萄糖殘基(162 u)，得到m/z783、621、459碎片離子，其中m/z459離子為二醇型人參皂苷的特征碎片離子，示于圖2a；而人參皂苷Re可連續脫去一分子甲酸得到m/z945碎片離子、一分子鼠李糖殘基(146 u)得到m/z799碎片離子、兩分子葡萄糖殘基(162 u)得到m/z637、475碎片離子，其中m/z475為三醇型人參皂苷的特征碎片離子，示于圖2b。

圖1 負離子模式下，蒸制紅參(a)、醋制紅參(b)和烘干紅參(c)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of red ginseng processed by steaming (a), vinegar (b) and drying (c) in negative ion mode

圖2 負離子模式下，人參皂苷Rd(a)和人參皂苷Re(b)的MS/MS譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of ginsenoside Rd (a) and ginsenoside Re (b) in negative ion mode

丙二?；藚⒃碥誖b1(mRb1)為二醇型人參皂苷，其C-3位取代基團為一分子丙二?；蛢煞肿悠咸烟撬纬傻膫孺?。丙二?；藚⒃碥誱Rb1的二級串聯質譜圖示于圖3，從中可觀察到m/z1 107、945、783、621、459等碎片離子。其中，m/z1 107[M-malonyl-H]-為m/z1 193離子脫去丙二?；?86 u)產生的特征碎片離子；m/z1 193脫去丙二?；退纬闪薽/z1 089離子；脫去1～4分子葡萄糖殘基和水分子分別產生了m/z945、783、621、459等碎片離子。人參皂苷mRb1存在于鮮人參和生曬參中，易受熱分解，在醋制紅參中能夠發現，但在蒸制紅參和高溫烘干紅參中未檢出。

圖3 負離子模式下，人參皂苷mRb1的MS/MS譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of ginsenoside mRb1 in negative ion mode

人參皂苷Rg1和Rf的分子質量均為800.492 2，但根據保留時間的不同，能夠很好的進行區分，其色譜圖示于圖4a。人參皂苷Rg1和Rf的二級質譜圖分別示于圖4b和4c，二圖中均可看到m/z637和m/z475碎片離子，但同樣的電離能碎片豐度比不同。經方法重現性考察，人參皂苷Rg1子離子m/z475與母離子的比例大于人參皂苷Rf子離子m/z475與母離子的比例。人參皂苷Rg1分別在C6位和C20位連接一分子葡萄糖基，人參皂苷Rf在C6位連接兩分子葡萄糖基。研究表明，在串聯質譜中，C20位失去葡萄糖基所需的能量更低，從而更容易將其失去。

通過保留時間、MS/MS碎片離子、精確質量等信息與標準對照品、文獻數據[11-16]信息比較，對蒸制紅參、醋制紅參及高溫烘干紅參進行鑒定，其結果附于文后表中。

圖4 負離子模式下，人參皂苷Rg1和Rf的色譜圖(a)，人參皂苷Rg1(b)和Rf(c)的MS/MS譜圖Fig.4 Chromatogram of ginsenoside Rg1 and Rf (a), MS/MS spectrum of ginsenoside Rg1 (b) and Rf (c) in negative ion mode

3 結論

本研究在蒸制紅參、醋制紅參和烘干紅參中分別鑒定出24、25和24個人參皂苷。其中，人參皂苷mRb1、Rh1、F1、20(R)-Rh1、Rg5和Rs5僅在醋制紅參中檢出，notoR1僅在蒸制紅參中檢出。酸性條件對丙二酰人參皂苷有穩定作用，同時對于稀有人參皂苷的生成也有促進作用。

本研究共發現11組同分異構體，在人參皂苷的串聯質譜中，C20位取代基比C6位取代基更容易失去葡萄糖基，這可作為區分同分異構體的參考。

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