魚粉國標中氨基酸指標的快速檢測方法

■李 豐 葉竹林 鄭衛紅 賴彩冰 彭志通

（廣州匯標檢測技術中心，廣東廣州 510300）

魚粉是一種必需氨基酸種類相當平衡的優質動物性蛋白質原料，可通過氨基酸分析對魚粉的質量予以評價[1-2]。魚粉氨基酸分析首先要用不同的水解方式將肽鏈打開。目前最常用的水解方式是GB/T 18246—2000中的常規水解法和微波水解法。常規水解法是使蛋白質在鹽酸的作用下，經液氮或干冰冷凍，抽真空后封口，再放入恒溫干燥箱中，水解22～24 h后形成單一氨基酸[3]。此過程步驟繁瑣，耗時長，勞動強度大且處理過程中部分氨基酸易損失。微波水解是使用微波爐在2 450 Hz的微波電磁場的作用下，微波通過試樣及鹽酸時，極性分子隨微波頻率快速變換取向，分子來回轉動，與周圍分子相互碰撞，分子的總能量增加，使試樣溫度急劇上升。這種加熱方式與傳統的加熱方式相比具有操作簡單、樣品水解快、節約能源、工作效率高和勞動強度小等優點[4-5]。因此，研究微波水解法快速測定魚粉氨基酸的含量，有助于提高檢測效率。有筆者也對微波水解法測定魚粉中氨基酸進行了研究[4]，從微波水解法的快速、準確方面入手，得出研究數據。但是并沒有考察微波水解法最佳條件及檢測結果的穩定性。本研究根據蛋氨酸和賴氨酸含量的高低可以判斷魚粉質量的優劣[6]，從魚粉蛋氨酸和賴氨酸含量測定方面入手，考察微波水解法最佳條件及檢測結果的穩定性。本研究擬通過正交設計選擇微波水解的最佳條件并在一定時期內探討微波水解的穩定性，同時與常規水解方法相比較，以探索微波水解快速測定氨基酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

魚粉樣品為市售進口魚粉；16種氨基酸混標（Sigma）；巰基乙醇（Sigma）、茚三酮（Sigma）、乙腈（Merck）、甲醇（Merck）、純凈水（實驗室自制）,其他試劑均為分析純。

氨基酸分析儀（日立L-8900）、EZChromtion工作站、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030A，上海一恒）、電子天平（EL104，梅特勒）、氮吹儀（N-Evap，Organomation）、微波消解儀（mutiwave GO，安東帕）。

1.2 試驗方法

1.2.1 微波水解正交試驗設計

采用L9(34)四因素三水平正交試驗。因素水平見表1。

表1 微波水解魚粉的因素水平設計

1.2.2 微波水解穩定性試驗設計

魚粉的微波水解氨基酸穩定性考察時間為3個月。樣品保存于0～4℃冰箱冷藏柜中備用。按所選擇的最佳微波水解條件，分別于2015年3月5日、3月18日、4月9日、4月21日、5月11日、5月29日對魚粉的氨基酸含量進行測定。

1.2.3 試驗操作

1.2.3.1 微波水解魚粉

稱取約20 mg魚粉，放入水解罐中，加入6 mol/l鹽酸溶液0.5 ml，抽真空，再充入高純氮以排凈空氣。密封放入微波爐中，按正交試驗設計擬定微波水解條件設置微波爐，開始水解。水解結束后冷卻至常溫，開罐，過濾入25 ml容量瓶，用去離子水定容。搖勻后移取一定量溶解液至旋轉蒸發儀中，旋轉蒸干，以0.02 mol/l HCl溶解蒸發的剩余物，定容至100 ml容量瓶中，搖勻，以注射器吸取后通過濾膜，抽濾入專用進樣瓶。最后上機分離、測定。所有樣品重復4次測定，結果取平均值。

1.2.3.2 常規水解魚粉

樣品前處理參考GB/T 18246—2000中酸水解法，其余步驟同微波水解。所有樣品重復4次測定，結果取平均值。

2 結果與討論

2.1 正交試驗結果分析（見表2～表4）

表2 微波水解魚粉中蛋氨酸結果

表3 微波水解魚粉中賴氨酸結果

表4 常規水解魚粉結果

綜合表2～表4的試驗結果可知，微波水解法3個因素的主次順序為：B→C→A，與常規水解結果相比可得微波水解最佳組合為：A1B2C2，即在巰基乙醇含量0.5%，160℃下水解20 min。

正交試驗方差分析結果：賴氨酸FB=5.789＞F0.05(2，6)、FA=0.196 4＜F0.10(2，6)、FC=0.42＜F0.10(2，6)；蛋氨酸FA=0.733＜F0.10(2，6)、FB=0.318＜F0.10(2，6)、FC=0.236＜F0.10(2，6)。方差分析表明：B因素對魚粉的賴氨酸有顯著性影響，A和C因素對魚粉賴氨酸無顯著性影響；A、B、C 3個因素對魚粉的蛋氨酸均沒有顯著性影響。

2.2 微波水解穩定性分析

6次微波水解穩定性結果見表5。從表5可知，魚粉在為期3個月的試驗過程中，參與比較分析的2種氨基酸結果的RSD值均小于1.0%。經F檢驗，同一魚粉樣品在不同時間的賴氨酸和蛋氨酸含量測定結果均不存在顯著差異(F＜F0.10)。

表5 魚粉微波水解穩定性結果（%）

2.3 常規水解法和微波水解法測定結果比較

①微波輔助水解法與常規水解法進行比較，結果見表6。兩種水解方法測定結果的相對偏差均小于2.0%，符合國家標準GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》規定要求，經F檢驗，微波輔助水解法與常規水解法測定結果不存在顯著差異(F＜F0.10)，在所選擇的最佳條件下微波水解法測定結果與常規水解法一致。

表6 微波水解與常規水解結果對比(%)

②在微波水解過程中，由于高壓和高溫，具有極性側鏈的氨基酸，如蘇氨酸、絲氨酸等易被破壞，回收率比較低，所以在考慮用微波水解法測定氨基酸含量的同時要考慮到個別氨基酸的含量測定偏低問題。

3 結論

①從以上結果分析可知，微波水解的最佳條件是巰基乙醇含量0.5%、溫度160℃、水解時間20 min；通過比較分析3個月內魚粉氨基酸結果的變化情況，證明微波水解法的穩定性較好。

②微波水解法與常規水解法在測定時間上差別較大，常規水解法至少水解22 h，而微波水解最多只需20 min，因為微波水解的加熱方式與常規水解的加熱方式截然不同，除了分子間的來回運動升溫，試液中的帶電粒子在交變的電磁場中受電場力的作用而來回遷移運動，也會與臨近分子撞擊，使試樣溫度升高，從而加快了水解速度，使工作效率提高了20倍以上。

③微波水解法與常規水解法在所用實驗儀器上，常規水解需要儀器設備較多，操作繁瑣且勞動強度大。而微波水解只需微波消解爐，操作簡單。

綜上所述，微波水解法具有操作簡捷、方便、快速，不但節約了試劑，更節約了能源，大大提高了工作效率而且測定結果準確、可靠。因此，可應用于魚粉國標中氨基酸的快速測定。