HBsAg對健康成人外周血單核細胞來源樹突狀細胞Tim-3信號通路的影響

余真君 湯永志 燕飛 朱敏 朱堅勝

HBsAg對健康成人外周血單核細胞來源樹突狀細胞Tim-3信號通路的影響

余真君 湯永志 燕飛 朱敏 朱堅勝

目的 探討HBsAg對健康成人外周血單核細胞來源樹突狀細胞（MD-DCs）的免疫活性及對T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）和下游信號分子核因子-κB（NF-κB）蛋白表達的影響。方法 分離健康成人外周血單核細胞，經GM-CSF、IL-4聯合誘導為樹突狀細胞（DCs），流式細胞術檢測DCs表面標志物表達水平。MD-DCs分4組添加不同濃度HBsAg（0、1、2、5μg/ml），分別設為對照組、+1μg/ml組、+2μg/ml組、+5μg/ml組，Western印跡法檢測Tim-3、NF-κB信號蛋白表達，細胞增殖與毒性檢測試劑檢測MD-DCs刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力，ELISA法檢測細胞因子分泌水平。結果 外周血來源單核細胞成功誘導分化為DCs。與對照組相比，+2μg/ml及+5μg/ml組MD-DCs Tim-3及NF-κB表達水平均上調，刺激同種異體T淋巴細胞增殖能力均增強，炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平均增高（均P＜0.05），而+1μg/ml組較對照組無統計學差異（均P＞0.05）。與其他3組相比，+5μg/ml組MD-DCs Tim-3、NF-κB、炎癥因子分泌水平增高，刺激同種異體淋巴細胞增殖能力增強（均P＜0.05）。結論 HBsAg上調MD-DCs Tim-3及NF-κB表達水平，增強MD-DCs免疫活性，且刺激作用隨HBsAg濃度的增高而增強。

樹突狀細胞 肝炎表面抗原，乙型 T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3 核因子-κB

【 Key words】 Dendritic cells Hepatitis B virus surface antigen T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecules-3 Nuclear factor-κB

HBV感染是世界范圍內最常見的慢性病毒感染性疾病，與肝癌、肝硬化的發生、發展及預后密切相關[1]，目前約3.5億人口罹患慢性HBV感染[2]，至今仍是全球健康衛生的難題。HBV并不直接造成機體細胞損壞，但可激活固有及獲得性免疫反應，通過破壞或者紊亂機體的免疫功能，尤其是針對HBV的特異性抗病毒免疫功能，使得HBV逃避機體免疫攻擊，進而形成持續感染[3]。樹突狀細胞（DCs）是體內強大的抗原遞呈細胞，是溝通固有免疫反應和獲得性免疫反應的橋梁[4]，調節免疫反應的重要組成部分[5]。很多數據表明慢性HBV感染患者DCs等細胞免疫功能障礙[6]，最新研究表明新生兒感染HBV后更易轉為慢性感染可能為臍帶血中髓系DCs、漿細胞樣DCs濃度較低所致[7]。本研究采用健康成人外周血單核細胞來源樹突狀細胞（MD-DCs），加入HBsAg體外刺激，探討HBsAg對MD-DCs免疫功能及T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）及下游信號分子核因子-κB（NF-κB）表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 重組人粒系-巨系細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重組人白細胞介素-4（rhIL-4）均購于美國R&D公司；抗人CD11c-APC、抗人PerCP-HLA-DR、抗人CD80-PE、抗人CD86-FITC及同型對照均購于美國Ebioscience公司；重組人HBsAg購于以色列Prospec公司；Tim-3一抗購于美國BioVision公司；NF-κB一抗、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均購于美國Epitomics公司；細胞增殖與毒性檢測試劑（MTS-PMS）購于美國Promega公司；IL-6、IL-10、IFN-γ酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒均購于美國R&D公司；RPMI-1640培養基購于美國Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司；Ficoll淋巴細胞分離液購于上海華精生物高科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MD-DCs體外誘導分化及流式鑒定 4h內采集的健康成人志愿者外周血100～200ml（所有志愿者身體狀況均符合國家規定的體檢要求，并在采血前均已簽署知情同意書），經Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲得外周血單核細胞（PBMC），將PBMC分別加入至6孔板，每孔添加RPMI-1640培養基2ml重懸，培養箱中孵育2h，吸棄上清液并用4℃預冷PBS沖洗3次，獲得貼壁的單核細胞。每孔加入含20%FBS的RPMI-1640培養基2ml，然后添加細胞因子（終濃度分別為rhGM-CSF 750U/ml、rhIL-4 800U/ml）培養，隔天半量換液，并補充細胞因子。培養至第7天，收集懸浮細胞，各加入流式標記抗體CD11c、HLA-DR、CD80、CD86及同型對照免疫標記，流式細胞儀（美國BD公司）檢測各細胞表型表達水平；并將細胞分為4組，分別不添加HB－sAg（對照組）、添加HBsAg 1μg/ml（+1μg/ml組）、添加HBsAg 2μg/ml（+2μg/ml組）、添加HBsAg 5μg/ml（+5μg/ ml組）（每組3孔），培養至第9天后收集懸浮細胞。

圖1 細胞培養至第7天時MD-DCs形態學觀察所見（a：光鏡下，×400；b：電鏡下，×3 820）

1.2.2 Western印跡 收集各組懸浮細胞抽提蛋白，每孔總蛋白40μg上樣，一抗（Tim-3、NF-κB、GAPDH）均1∶1 000孵4℃過夜，羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育2h，增強化學發光顯色，Quantlty One軟件灰度值分析。

1.2.3 同種異體混合淋巴細胞反應 將已收集的4組懸浮細胞加入絲裂霉素C（25μg/ml）處理30min，離心、棄上清液，加入含20%FBS的RPMI-1640培養基重懸作為刺激細胞；刺激細胞與另一健康志愿者來源的淋巴細胞按不同比例（效靶比1∶5、1∶10、1∶20）加入96孔板，共培養96h；培養結束前4h，每孔加入MTS-PMS 20μl/孔，孵育4h，檢測其吸光度（A）值。+1μg/ml組刺激指數（SI）=（+1μg/ml組A-本底A）/（對照組A-本底A）；其它組SI計算方法依此類推；SI數值越大代表DCs刺激淋巴細胞增殖能力越強。

1.2.4 ELISA 收集各組細胞上清液，ELISA法檢測炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ分泌水平，按照說明書進行操作，酶標儀檢測樣品450nm處A值，繪制標準曲線并換算對應細胞因子的濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 細胞培養至第7天時MD-DCs形態學觀察及流式細胞術檢測 見圖1、表1。

由圖1可見，PBMC培養至第7天時，細胞聚集形成集落，多呈懸浮狀態，電鏡下可見細胞形態不規則，細胞表面有毛刺，呈典型DCs形態。

表1 細胞培養至第7天時MD-DCs流式細胞術檢測細胞表型陽性率（%）

由表1可見，收集懸浮細胞流式細胞術檢測MDDCs特異性細胞表型CD11c、HLA-DR以及DCs成熟度細胞表型CD80、CD86，結果顯示這些細胞表型陽性率均明顯增高（均P＜0.01）；這表明單核細胞在加入rhGMCSF、rhIL-4共培養后，已成功誘導分化為MD-DCs。

2.2 各組MD-DCs Tim-3、NF-κB信號蛋白表達水平比較 見表2。

表2 各組MD-DCs Tim-3、NF-κB信號蛋白表達水平比較

由表2可見，與對照組比較，+2μg/ml、+5μg/ml組MD-DCs Tim-3（t=2.28、6.31，均P＜0.05）及NF-κB（t= 4.27、6.69，均P＜0.01）表達水平均增高，而+1μg/ml組信號蛋白表達水平無明顯增高或降低（均P＞0.05）。與+1μg/ml組比較，+2μg/ml組MD-DCs Tim-3（t=2.68，P＜0.05）、NF-κB（t=4.98，P＜0.01）表達水平均增高。與+1μg/ml、+2μg/ml組比較，+5μg/ml組MD-DCs Tim-3（t=6.71、4.02，均P＜0.01）及NF-κB（t=7.40、2.42，均P＜0.05）表達水平均上調。

2.3 各組MD-DCs對淋巴細胞SI比較 見表3。

表3 各組MD-DCs對淋巴細胞SI比較

由表3可見，在效靶比1∶5情況下，+1μg/ml組MD-DCs對淋巴細胞SI與對照組比較無統計學差異（t=1.12，P＞0.05）；+2μg/ml組在效靶比1∶5情況下，其SI較+1μg/ml、對照組明顯增高（t=6.62、7.75，均P＜ 0.01）；+5μg/ml組在效靶比1∶5、1∶10情況下，SI較+ 1μg/ml、+2μg/ml、對照組均增高（t=9.56、2.94、10.68、6.50、2.84、6.01，均P＜0.05）。

2.4 各組MD-DCs炎癥因子分泌水平比較 見表4。

表4 各組MD-DCs炎癥因子分泌水平比較（pg/ml）

由表4可見，與對照組比較，+2μg/ml、+5μg/ml組炎癥因子IL-6（t=3.88、6.61，均P＜0.01）、IL-10（t=4.13、6.41，均P＜0.01）、IFN-γ（t=5.77、13.05，均P＜0.01）濃度均明顯增高，+1μg/ml組炎癥因子分泌水平無明顯增高或降低（均P＞0.05）。與+1μg/ml組比較，+2μg/ml組IL-6（t=3.49，P＜0.01）、IL-10（t=4.50，P＜0.01）、IFN-γ（t=5.39，P＜0.01）升高。與+1μg/ml、+2μg/ml組比較，+ 5μg/ml組IL-6（t=6.21、2.73，均P＜0.05）、IL-10（t= 6.97、2.28，均P＜0.05）、IFN-γ（t=12.67、7.27，均P＜0.01）分泌水平均上調。

3 討論

Tim-3與多種疾病如病毒感染、腫瘤、自身免疫疾病、過敏反應、移植免疫排斥反應等的發病機制相關[8]。Tim-3 mRNA最初發現高表達于人輔助性T細胞1（Th1），Tim-3被認為是Th1細胞特異表達的膜蛋白；后來越來越多的研究表明，CD8+T細胞、Th17細胞、調節性T細胞、巨噬細胞、NK細胞、DCs、肥大細胞等表面均可發現Tim-3表達[8]，最新研究發現Tim-3也表達于腫瘤細胞，并可能為腫瘤患者的獨立預后因素[9]。Tim-3與其配體半乳糖凝甘素-9（Gal-9）結合可誘導細胞內鈣流出，致使Th1細胞聚合、死亡，下調Th1免疫反應、誘導免疫耐受，抑制獲得性免疫反應。然而在固有免疫反應中，Tim-3可能因為所處免疫環境的變化，促進或者抑制免疫反應；例如Anderson等[10]研究表明抗原遞呈細胞表面Tim-3可協同Toll樣受體（TLRs）促進促炎細胞因子的分泌，而Chiba等[11]發現腫瘤相關DCs過表達的Tim-3抑制核酸介導的固有免疫反應。

Tim-3信號分子在HBV感染的發病機制中起重要的免疫調節作用。研究表明慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血單核細胞、循環NK細胞、CD4+/CD8+T細胞上Tim-3信號蛋白表達水平較健康成人對照組均明顯增高，阻斷Tim-3信號通路可部分恢復NK細胞、CD8+T細胞等的免疫功能[12-13]，充分說明了過表達的Tim-3與CHB患者免疫功能障礙密切相關。CHB患者DCs免疫功能障礙，不能有效地提呈抗原給T淋巴細胞和B淋巴細胞，導致機體無法產生有效的抗病毒免疫反應是HBV持續感染的重要原因。HBV感染患者血液循環內存在大量HBV病毒微粒和病毒蛋白，尤其是HBsAg，病毒或病毒蛋白與DCs之間存在多元免疫反應[14]。本研究發現HBsAg體外刺激MD-DCs可上調Tim-3、NF-κB信號蛋白表達水平，增強其刺激淋巴細胞增殖能力和炎癥因子IL-6、IL-10、IFN-γ等分泌水平，即HBsAg體外刺激增強MD-DCs免疫活性，且其刺激作用與HBsAg濃度相關；與本文研究結論相符。Jan等[15]發現HBsAg體外刺激MD-DCs,細胞表型CD80、CD83、CD86表達水平上調，可通過NF-κB、p38 MAPK信號通路促進IL-12、IL-10等炎癥因子分泌。

在本研究中，HBsAg體外刺激MD-DCs，Tim-3表達水平上調，與MD-DCs免疫活性正性相關；且隨著HBsAg刺激濃度升高，Tim-3表達水平亦相應上調。然而既往研究多表明高水平表達的Tim-3與CHB患者免疫細胞功能障礙相關，結合Tim-3信號分子在固有免疫反應中的雙重調節作用，我們可以推測不同免疫環境下Tim-3扮演的角色也不同；例如有研究數據證實腫瘤患者體內高表達的Tim-3可能致患者DCs免疫功能障礙[11]，也有研究發現急性炎癥反應中DCs表面Tim-3信號蛋白過表達并促進免疫應答反應[10]。慢性HBV感染者體內免疫內環境與體外單純HBsAg刺激免疫環境之間的巨大差異，或許導致了Tim-3信號蛋白截然不同的免疫調節作用。

綜上所述，體外環境下HBsAg上調MD-DCs細胞Tim-3及下游信號分子NF-κB蛋白表達水平，增強MD-DCs細胞免疫活性，且刺激作用隨HBsAg濃度的增高而增強。CHB患者體內免疫環境下Tim-3對DCs免疫功能的調節作用，以及Tim-3對MD-DCs功能調節的確切機制均待進一步的研究。

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Effects of hepatitis B virus surface antigen on Tim-3 signaling pathway of dendritic cells

YU Zhenjun,TANG Yongzhi,YAN Fei,et al.
Department of Infectious Diseases,Affiliated Taizhou Hospital of Wenzhou Medical University,Linhai 317000,China

Objective To investigate the effect of hepatitis B virus surface antigen(HBsAg)on the expression of T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecules-3(Tim-3)and the downstream signal molecule Nuclear Factor-κB (NF-κB)of human monocyte-derived dendritic cells(MD-DCs). Methods Monocytes obtained from normal adult peripheral blood were co-cultured with GM-CSF and IL-4 to induce to dendritic cells,the cell phenotypes expressions on MD-DCs were detected by flow cytometry.Different concentrations of HBsAg(0,1μg/ml,2μg/ml,5μg/ml)were added in the culture medium.The expressions of signaling proteins were determined by Western blotting assay,the lymphocytes-stimulatory capacity of MD-DCs was determined with a proliferation and cytotoxicity detection kit(MTS),and the concentrations of cytokines in the supernatant were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Results Monocytes were successfully induced to dendritic cells.Compared with the control group,the expressions of signaling proteins Tim-3 and NF-κB of the HBsAg(2μg/ml or 5μg/ml) stimulation group were both up-regulated,the lymphocytes-stimulation capacity was enhanced,and the secretion levels of IL-6, IL-10 and IFN-γ were increased(P＜0.05),while there was no significant difference between 1μg/ml HBsAg stimulation group and control group.Compared with the other three groups,the treatment with 5μg/ml HBsAg led to increased expressions of Tim-3,NF-κB and cytokines,and enhanced lymphocytes-stimulation capacity of MD-DCs(P＜0.05). Conclusion HBsAg stimulation can increase the expressions of Tim-3 and downstream signaling molecule NF-κB of MD-DCs,and enhance the immune function of MD-DCs in a dose-dependent manner.

2015-02-13）

（本文編輯：李媚）

浙江省醫藥衛生科學研究基金計劃項目（2010KYB125）

317000 臨海，溫州醫科大學附屬臺州醫院感染科（余真君、湯永志、燕飛、朱堅勝），公共科研平臺（朱敏）

朱堅勝，E-mail：zhujs@enzemed.com