鈣蛋白酶-10基因SNP-19與多囊卵巢綜合征相關性研究

鄧妙 劉元偉 張紅艷 岑加萍 張治芬

●論 著

鈣蛋白酶-10基因SNP-19與多囊卵巢綜合征相關性研究

鄧妙 劉元偉 張紅艷 岑加萍 張治芬

目的 探討鈣蛋白酶-10基因（CAPN-10）單核苷酸多態性-19（SNP-19）與多囊卵巢綜合征（PCOS）的相關性。方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術，對107例PCOS患者（PCOS組）及111例健康體檢者（對照組）的CAPN-10 SNP-19進行分析，并測定其性激素和生化指標。PCOS組再根據BMI與胰島素抵抗（IR）穩態模型指數（HOMA-IR）分為肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組，分析CAPN-10 SNP-19與其關系。結果 與對照組相比，PCOS組BMI、空腹血糖（FPG）、TG、TC、LDL、黃體生成素（LH）、黃體生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）、睪酮（T）均升高（均P＜0.01）。PCOS組CAPN-10 SNP-19 1等位基因及1/2基因型頻率均高于對照組（均P＜0.05）；且CAPN-10 SNP-19 1/2基因型PCOS發病風險較1/1、2/2基因型增加約2倍（OR=1.9，95%CI=1.1～3.3，P＜0.05）。CAPN-10 SNP-19 1、2等位基因頻率PCOS肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組比較均無統計學差異（均P＞0.05）；PCOS肥胖組和IR組CAPN-10 SNP-19 1/2基因型頻率分別高于非肥胖組和非IR組，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。結論 CAPN-10 SNP-19與PCOS遺傳易感性有關，可能與PCOS肥胖及IR無關。

多囊卵巢綜合征 半胱氨酸內肽酶類，鈣蛋白酶-10 多態性，單核苷酸 胰島素抵抗

【 Abstract】 Objective To investigate the relationship between single nucleotide polymorphisms-19(SNP-19)in calpain-10 (CAPN-10)gene and polycystic ovary syndrome(PCOS). Methods One hundred and seven PCOS patients(PCOS group)and 111 healthy female subjects(control group)were recruited in the study.The distribution of CAPN-10 SNP-19 was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Serum hormones and biochemical indicators were also measured.Oral glucose tolerance test(OGTT)was performed in PCOS group. Results The BMI,FPG,TG, TC,LDL,LH,LH/FSH and T levels were significantly increased in PCOS group compared to control group(P＜0.01).The frequency of allele 1 and genotype 1/2 of CAPN-10 SNP-19 were higher in PCOS group than those in control group.Genotype 1/2 was closely associated with PCOS compared to 1/1 and 2/2(OR=1.9,95%CI=1.1-3.3,P＜0.05).There was no significant difference in frequency of genotype 1/2 between obese group and non-obese group,between insulin resistance(IR)group and non-IR group of PCOS patients(P＞0.05). Conclusion The SNP-19 in CAPN-10 may contribute to the genetic susceptibility to PCOS,but it may be not correlate with obesity or IR of PCOS patients.

【 Key words】 Polycystic ovary syndrome Cysteine endopeptidases,CAPN-10 Polymorphism,single nucleotide Insulin resistance

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性常見的內分泌疾病，影響女性從青春期到絕經后整個過程的身心健康。其發病機制尚不十分清楚，但大部分研究認為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是PCOS病理生理的中心環節，約65%的PCOS患者存在IR[1]。鈣蛋白酶-10基因（CAPN-10）是第1個被克隆定位的與2型糖尿?。═2DM）有關的基因，該基因的變異與IR的發生密切相關[2]。隨后大量研究也證實CAPN-10與多種IR相關性疾病，如妊娠期糖尿?。℅DM）、肥胖癥、高血壓等有關[3-5]。因為PCOS與T2DM、GDM等有共同的IR機制，所以CAPN-10也成為PCOS的重要候選基因。本研究旨在探討CAPN-10單核苷酸多態性-19（single nucleotide polymorphisms-19，SNP-19）與PCOS的相關性，為PCOS發病的遺傳因素、分子機制、臨床診斷和基因治療提供可能的實驗依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年1月至2014年1月在杭州市第一人民醫院婦科就診的PCOS患者設為PCOS組；納入標準：近3個月未服用避孕藥或其他影響性激素水平及糖脂代謝的藥物；診斷標準參照2003年ESHRE/ASRM鹿特丹會議標準[6]。另以隨機數字表法選取同期來本院體檢的健康女性設為對照組；納入標準：月經周期規律，無高雄激素血癥及高雄激素表現，經陰道B超檢查卵巢無多囊樣改變；近3個月未服用避孕藥或其他影響性激素水平及糖脂代謝的藥物，并排除甲狀腺、腎上腺等內分泌疾病。PCOS組共107例，年齡18～34（26.7± 4.8）歲。對照組共111例，年齡21～36（27.1±4.2）歲。兩組受檢者年齡比較無統計學差異（P＞0.05）；均于月經第2～4天或PCOS組患者閉經期B超檢查未見優勢卵泡時，禁食12h后清晨空腹采靜脈血進行生化指標（TG、TC、HDL、LDL）、性激素[卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、睪酮（T）]測定和基因檢測。PCOS組當日行糖耐量試驗（OGTT）：75g葡萄糖溶于250ml水中，3min內服下，空腹及服糖后2h分別采血測定血糖、胰島素水平。兩組受檢者采血當日測量身高、體重，計算BMI、胰島素抵抗穩態模型指數（HOMA-IR），HOMA-IR=[空腹血糖（FPG，mmol/L）×空腹胰島素（mIU/L）]/22.5。PCOS組再根據HOMA-IR分為IR組（HOMA-IR≥2.0，76例）和非IR組（HOMA-IR＜2.0，31例）；根據BMI分為肥胖組（BMI≥25，29例）和非肥胖組（BMI＜25，78例）。

1.2 方法

1.2.1 性激素及生化指標測定 性激素測定采用化學發光法（德國西門子ADVIA-centaur XP全自動化學發光免疫分析儀及配套試劑）；血糖及血脂測定采用酶法（美國貝克曼-庫爾特AU5800全自動生化分析儀及配套試劑）；胰島素測定采用電化學發光法（瑞士羅氏ebol電化學發光免疫分析儀及配套試劑）。

1.2.2 CAPN-10 SNP-19基因型檢測 美國AXYGEN DNA提取試劑盒提取外周血有核細胞中的基因組DNA，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）檢測技術（美國Applied Biosystems-2720 PCR儀）。引物序列：上游引物 5′-GTTTGGTTCTCTTCAGCGTGGAG-3′，下游引物5′-CATGAACCCTGGCAGGGTCTAAG-3′；反應體系：25μl反應體系，1×PCR緩沖液（含Mg2+）12.5μl，2mmol/L dNTPs 2.5μl，5μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，基因組DNA 2μl，加注射用水至總體積25μl；循環條件：預變性95℃，5min；變性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，30s；終止72℃，10min；共40個循環；PCR產物用3%瓊脂糖凝膠電泳80V，60min跑膠；UVP凝膠成像系統拍照存圖，在155bp處出現條帶為缺失多態（del），等位基因記為1，在187bp處出現條帶為插入多態（ins），等位基因記為2。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；檢測兩組等位基因頻率在群體中的代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結果

2.1 PCOS組與對照組BMI及生化指標比較 見表1。

表1 PCOS組與對照組BMI及生化指標比較

由表1可見，與對照組相比，PCOS組除HDL外BMI、FPG、TG、TC、LDL均升高（均P＜0.01）。

2.2 PCOS組與對照組性激素指標比較 見表2。

表2 PCOS組與對照組性激素指標比較

由表2可見，與對照組相比，PCOS組LH、LH/FSH、T均升高（均P＜0.01）；兩組FSH、E2、P、PRL水平均無統計學差異（均P＞0.05）。

2.3 PCOS組中肥胖組與非肥胖組血糖、胰島素水平及HOMA-IR比較 見表3。

表3 PCOS組中肥胖組與非肥胖組血糖、胰島素水平及HOMA-IR比較

由表3可見，與非肥胖組相比，肥胖組空腹胰島素、HOMA-IR均顯著升高（均P＜0.01）；兩組FPG、服糖后2h血糖、服糖后2h胰島素水平均無統計學差異（均P＞0.05）。

2.4 PCOS組中肥胖組與非肥胖組性激素指標比較 見表4。

由表4可見，與非肥胖組相比，肥胖組LH升高（P＜0.05）；LH/FSH及T也升高，但差異無統計學意義（均P＞0.05）；兩組FSH、E2、P、PRL水平均無統計學差異（均P＞0.05）。

2.5 CAPN-10 SNP-10 3種基因型電泳結果 見圖1。

表4 PCOS組中肥胖組與非肥胖組性激素指標比較

圖1 CAPN-10 SNP-19 3種基因型電泳結果（marker：標志物；1/1：155bp片段純合子；2/2：187bp片段純合子；1/2：155/187bp片段雜合子）

由圖1可見，本研究共檢測到CAPN-10 SNP-19 1/1、1/2、2/2這3種基因型。

2.6 PCOS組與對照組CAPN-10 SNP-19等位基因及基因型頻率比較 見表5。

表5 PCOS組與對照組CAPN-10 SNP-19等位基因及基因型頻率比較[例（%）]

由表5可見，PCOS組CAPN-10 SNP-19 1等位基因、1/2基因型頻率均高于對照組（均P＜0.05）。且PCOS組、對照組CAPN-10 SNP-19基因型頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則（χ2=0.84、1.32，均P＞0.05）；CAPN-10 SNP-19 1/2基因型PCOS發病風險較1/1、2/2基因型增加約2倍（OR=1.9，95%CI=1.1～3.3，P＜0.05）。

2.7 PCOS組中肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組CAPN-10 SNP-19等位基因、基因型頻率比較 見表6。

表6 PCOS組中肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組CAPN-10 SNP-19等位基因、基因型頻率比較[例（%）]

由表6可見，CAPN-10 SNP-19 1、2等位基因頻率在肥胖組與非肥胖組、IR組與非IR組均無統計學差異（均P＞0.05）；肥胖組和IR組1/2基因型頻率分別高于非肥胖組和非IR組，但差異無統計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

CAPN-10位于稱為非胰島素依賴型糖尿病1的染色體2q37.3中，該基因全長31 kb，含有15個外顯子和14個內含子。Turner等[2]研究發現CAPN-10 mRNA除心臟外，在胰島表達水平最高，提示CAPN-10對內分泌功能有影響。CAPN-10編碼的蛋白酶屬于Ca2+依賴性非溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族，通過激活及自溶而表現出蛋白水解酶活性，水解在Ca2+調節信號途徑中起重要作用的其他蛋白酶，從而參與細胞骨架調整、酶的修飾及多種細胞過程。目前SNP數據庫已列出521個人類CAPN-10 SNP位點。在眾多位點中，對SNP-19、-22、-43、-44、-56、-58、-63和-110的研究較多。其中SNP-19位于內含子6nt7919、rs3842570，是32 bp的2次或3次重復多態。Hachisu等[7]研究顯示串聯重復序列的數目在轉錄調控中發揮重要作用，可影響mRNA的穩定性，并通過改變結構修飾的蛋白質活性，從而發揮病理生理作用。

本研究結果顯示PCOS組CAPN-10 SNP-19 1等位基因及1/2基因型頻率高于對照組（均P＜0.05），且1/2基因型PCOS發病風險較1/1、2/2基因型增加約2倍。這提示CAPN-10 SNP-19與PCOS遺傳易感性有關，是PCOS的易感基因。這與Gonzalez等[8]對西班牙PCOS患者的研究結果一致。而Dasgupta等[9]對印度南部地區PCOS患者的相關研究則表明，CAPN-10 SNP-19等位基因頻率及基因型分布與PCOS無明顯相關性。Vollmert等[10]對德國PCOS患者的研究表明SNP-19 2/2基因型與PCOS發病風險相關（OR=2.98）。本研究進一步統計了不同人種PCOS組CAPN-10 SNP-19次要等位基因頻率，發現中國浙江地區PCOS患者次要等位基因頻率1（40.2%）與西班牙PCOS患者（34.0%）[8]相近，但低于印度（54.0%）[9]、高于德國（29.0%）[10]，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。這提示CAPN-10 SNP-19等位基因分布存在種族和地域的差異。

本研究顯示與對照組相比，PCOS組BMI、FPG、TG、TC、LDL均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。27.1%的PCOS患者存在肥胖，71.0%存在IR，且PCOS肥胖組較非肥胖組空腹胰島素、HOMA-IR均顯著升高（均P＜0.01）。研究表明，高胰島素水平可誘導肥胖相關基因表達[11]，影響脂肪細胞分化，同時刺激食欲，從而引起肥胖；而肥胖者，游離脂肪酸、乳酸鹽等代謝產物利用率增加又影響胰島素的分泌、代謝及靶器官的敏感性，從而加重IR，形成惡性循環。肥胖及IR近期可影響PCOS患者促排卵效果及妊娠結局，遠期可增加T2DM、心腦血管疾病風險。因此對PCOS合并肥胖患者，控制體重仍為首選的最基本的治療方案。

進一步統計分析發現，PCOS肥胖組和IR組1/2基因型頻率分別高于非肥胖組和非IR組，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）。究其原因可能有：（1）本研究采用HOMA-IR作為IR的評估標準，今后需要進一步測定服糖后1h血糖、胰島素，根據曲線下面積、是否存在高峰延遲等綜合評估IR，必要時完善高胰島素正葡萄糖鉗夾術（IR的金標準）。以BMI評估肥胖，今后需完善腰圍、臀圍、腰臀比等綜合評估肥胖，并明確肥胖類型；（2）本研究中71.0%PCOS患者存在IR，非IR組僅31例，需要增加樣本量以明確CAPN-10 SNP-19與PCOS IR的關系；（3）CAPN-10 SNP-19可能與PCOS肥胖及IR有關，但其相關性被CAPN-10內部影響CAPN-10轉錄活性的其他單核苷酸所改變。因此，今后有必要研究CAPN-10其他SNP、單倍型及單倍型組合與PCOS的相關性；（4）CAPN-10 SNP-19可改變結構修飾的蛋白質活性，SNP-19不同基因型的產物結構、組織分布及生物活性與PCOS肥胖和IR的關系有待進一步基因功能研究。

綜上所述，CAPN-10 SNP-19與PCOS遺傳易感性有關，是PCOS的易感基因。今后有必要進一步完善相關臨床資料，擴大樣本含量，綜合研究CAPN-10 SNPs、單倍型及單倍型組合與PCOS發病風險、PCOS各臨床表型及高危型PCOS的相關性，進而進行基因功能研究，探討PCOS發病的遺傳因素和分子機制，為臨床診斷、預防和基因治療提供理論依據。

[1]Rizzo M,Tyndall E K,Frontoni S,et al.Rapid and easy assessment of insulin resistance contributes to early detection of polycystic ovary syndrome[J].EndocrinolInvest,2013,36(7):527-530.

[2]Turner M D,Cassell P G,Hitman G A.Calpain-10:from genome search to function[J].Diabetes Metab Res Rev,2005,21(6):505-514.

[3]Mendoza-Lorenzo P,Salazar A M,Cortes-Arenas E,et al.The reduction of Calpain-10 expression is associated with risk polymorphisms in obese children[J].Gene,2013,516(1):126-131.

[4]羅毅平,劉國成,張溫麑,等.妊娠糖尿病Calpain10基因表達與其單倍型組合的研究[J].中國婦幼保健,2013,28(25):4235-4238.

[5]Neuhaus T,Graf C,Stier S,et al.Variation in the calpain-10 gene is not associated with gestational diabetes mellitus[J].Scand J Clin Lab Invest,2014,74(1):59-66.

[6]Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome[J]. Fertil Steril,2004,81(1):19-25.

[7]Hachisu Y,Hashimoto R,Kishida K,et al.Analytical procedure of variable number of tandem repeats(VNTR)analysis and effective use of analysis results for tuberculosis control[J].Rinsho Byori,2013,61(12):1123-1135.

[8]Gonzalez A,Abril E,Aragon M J,et al.Comment:CAPN10 alleles are associated with polycystic ovary syndrome[J].Clin Endocrinol Metab,2002,87(8):3971-3976.

[9]Dasgupta S,Sirisha P V,NeelaveniK,et al.Association ofCAPN10 SNPs and haplotypes with polycystic ovary syndrome among South Indian Women[J].PLoS One,2012,7(2):e32192.

[10]Vollmert C,Hahn S,Lamina C,et al.Calpain-10 variants and haplotypes are associated with polycystic ovary syndrome in Caucasians[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,292(3): E836-E844.

[11]Palacios-Ortega S,Varela-Guruceaga,Milaqro F I,et al.Expression of Caveolin 1 Is Enhanced by DNA Demethylation during Adipocyte Differentiation Status of Insulin Signaling[J]. PLoS One,2014,9(4):e95100.

Association of CAPN-10 SNP-19 with polycystic ovary syndrome

DENG Miao,LIU Yuanwei,ZHANG Hongyan,et al.
Department of Gynecology and Obstetrics，Hangzhou First People′s Hospital，Hangzhou 310006,China

2014-07-03）

（本文編輯：李媚）

浙江省科技計劃項目（2009C33114）

310006 杭州市第一人民醫院婦產科（鄧妙現在杭州市婦產科醫院工作）

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn