高糖對小鼠足細胞向間充質細胞轉分化的影響

葉迅 侯鵬超 洪郁芝

高糖對小鼠足細胞向間充質細胞轉分化的影響

葉迅 侯鵬超 洪郁芝

目的 通過觀察高糖環境下小鼠足細胞表達NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的變化，探討高糖損傷足細胞的機制。方法 將培養成熟的小鼠足細胞用RandA 1.0軟件完全隨機分為高糖1、2、3組（葡萄糖濃度分別為15、25和30mmol/L）和對照組（葡萄糖濃度5mmol/L），倒置顯微鏡下觀察高糖干預前后足細胞的形態變化，采用RT-PCR和Western blot技術分別檢測足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的mRNA和蛋白表達變化。結果 與對照組相比，高糖環境下培養48h后，足細胞形態發生不同程度變化。NEPH1和Smad7的mRNA表達較對照組顯著減少（P＜0.05或0.01），desmin和TGF-β1的mRNA表達較對照組增加（P＜0.05或0.01）。其中高糖2組的NEPH1和Smad7的蛋白表達較對照組顯著減少（均P＜0.01），而desmin和TGF-β1的蛋白表達較對照組顯著增加（P＜0.01）。小鼠足細胞在高糖培養下NEPH1 mRNA和desmin mRNA的表達呈顯著負相關（r=-0.993，P＜0.01）；NEPH1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表達呈顯著負相關（r=-0.989，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA的表達和Smad7 mRNA的表達呈顯著負相關（r=-0.996，P＜0.01）。結論 高糖可能通過激活TGF-β/Smad信號通路誘導小鼠足細胞發生表型轉化。

高糖 足細胞 表型轉化 NEPH1 Smad7

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of high-glucose on epithelial-mesenchymal transition in mouse podocytes.Methods Matured mouse podocytes were cultured and randomly divided into controlgroup(5mmol/LD-glucose)and different high glucose groups(15,25 and 30 mmol/L D-glucose,respectively)by means of RandA1.0 randomized software.Morphological changes of podocytes were examined with inverted microscope and expression changes of NEPH1,desmin,TGF-β1 and Smad7 mRNAand protein were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Results Matured podocytes incubated with high glucose were converted from arborized cells into cobblestone appearance after 48h culture.Compared with the control group,the expression ofNEPH1 and Smad7 mRNA in pedocytes cultured with different high glucose were significantly decreased (P＜0.05 or 0.01);meanwhile,the expressions ofdesmin and TGF-β1mRNAin pedocytes cultured with different doses ofhigh glucose were significantly increased in comparison with those ofcontrolgroup(P＜0.05 or 0.01).The protein expressions ofNEPH1 and Smad7 were significantly decreased while those ofdesmin and TGF-β1 were significantly increased in 25mmol/Lglucose group compared with control group(P＜0.01).The expression of NEPH1 mRNA was negatively correlated with that of desmin mRNA (r=-0.993,P＜0.01)and TGF-β1mRNA(r=-0.989,P＜0.01).The expression ofTGF-β1 mRNAwas negatively correlated with that ofSmad7 mRNAin mouse podocyte exposed to high glucose (r=-0.996,P＜0.01).Conclusion The phenotypic transformation of mouse podocytes can be possibly induced by high glucose via activating the TGF-β/Smad signalpathway.

目前已知足細胞脫落或凋亡是導致糖尿病腎病發生進行性腎小球硬化和腎臟纖維化的關鍵因素[1]。近年來的研究顯示，成熟足細胞的上皮細胞樣表型標志蛋白在高糖環境、糖基化終產物等有害刺激誘導下，表達下降或消失，向間充質細胞轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），即足細胞喪失特異性標志物，發生表型轉化，是其脫落或凋亡的關鍵病理學變化，也是導致足細胞功能紊亂和產生蛋白尿的潛在病理機制[2-3]。TGF-β/Smad信號通路在足細胞EMT過程中起重要的調節作用[4]。Smad7是TGF-β/Smad信號通路中起負反饋作用的分子，一旦Smad7的表達量明顯減少，TGF-β/ Smad信號通路的活性會增強，從而啟動足細胞EMT。本研究通過觀察不同濃度高糖體外干預小鼠足細胞發生EMT，及對TGF-β/Smad信號通路的影響，探討高糖誘導足細胞轉分化的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗對象及試劑 小鼠足細胞（英國倫敦大學國王學院Guy′s醫院贈送），RPMI 1640培養液、胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），γ-干擾素（美國PEPROTECH公司），葡萄糖（中國大冢制藥有限公司）。Trizol提取試劑盒（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），RCR引物（上海生工生物工程公司）。NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7抗體（美國SANTA CRUZ公司），蛋白Marker（美國Thermo公司），SDSPAGE凝膠試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠足細胞的復蘇、凍存與傳代 復蘇-196℃液氮罐凍存的小鼠足細胞，0.25%胰蛋白酶液1ml室溫下消化，細胞變圓、細胞間隙增寬時終止消化，置33℃、5% CO2培養箱孵育，待細胞長至80%～90%融合時再傳代培養。

1.2.2 小鼠足細胞培養 將復蘇的小鼠足細胞轉入含有5ml 10%FBS1640培養液的25cm2培養瓶，每瓶加入500U γ-干擾素。置33℃、5%CO2培養箱孵育，細胞增殖傳代后，轉移入37℃、5%CO2培養箱分化成熟。將成熟的足細胞以4×104/cm2的密度接種于25cm2培養瓶中，待細胞長至80%～90%融合時再次傳代，直到在37℃培育箱中培養滿14d。

1.2.3 高糖干預小鼠足細胞 37℃培養滿14d，細胞處于70%～80%融合時，加入無血清培養液饑餓24h使細胞同步化后根據10%FBS1640培養液要求，分別配置成含有5、15、25和30mmol/L的葡萄糖細胞培養液。將分化成熟為樹枝狀的小鼠足細胞20瓶，采用RandA 1.0軟件完全隨機分組法分為4組：高糖1、2、3組（葡萄糖濃度分別為15、25和30mmol/L）和對照組（葡萄糖濃度5mmol/L），每組5瓶足細胞在不同濃度的葡萄糖培養液中培養。37℃、5%CO2培養箱孵育48h后供檢測各組足細胞 NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的表達。

1.2.4 RT-PCR半定量檢測小鼠足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH mRNA的表達 Trizol試劑和氯仿抽提足細胞總RNA，微量核酸測量儀（美國Thermo公司）測定每個RNA樣品的濃度（ng/μl）；逆轉錄酶M-MulV催化下合成cDNA；在DNA自動擴增儀上進行PCR反應。25μl反應體系中含10×buffer 2.5μl，dNTP 10μl，引物正反義鏈各10μl，TaqDNA聚合酶1.25U，cDNA 1μl，加去離子水至終體積25μl。PCR引物均根據已知的小鼠NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH設計，見表1。試驗重復3次。

表1 PCR引物序列

1.2.5 擴增反應條件 在94℃2min進行預變性后，NEPH1：94℃30s、56.9℃30s、72℃30s，進行35個循環。desmin：95℃3min，進入循環，94℃30s、58.7℃30s、72℃60s，進行34個循環。TGF-β1：94℃30s、59.6℃30s、72℃60s，進行33個循環。Smad7：94℃30s、59.1℃30s、72℃60s，進行35個循環。GAPDH：94℃30s、59.8℃30s、72℃30s，進行25個循環。完成循環后，在72℃2min進行終延伸。陰性對照以雙蒸水替代cDNA。各PCR產物與DNA Marker（上海生工生物工程公司）在1.7%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml溴化乙錠），0.5%TBE液中電泳（100V，30min），用Bio-Rad凝膠成像系統成像，凝膠定量軟件Quantity-one分析其光密度值，以GAPDH為內參照基因，比較各目的基因條帶與內參照基因條帶的光密度比值。

1.2.6 Western blot檢測高糖2組和對照組小鼠足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和 Smad7蛋白的表達 用RIPA冰上提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照測定濃度添加4×上樣緩沖液和雙蒸水，使蛋白上樣量為20μg，并使上樣體積達到20μl。取各組細胞蛋白在100℃變性5min，然后與Marker一起行SDS-PAGE電泳，后濕轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h后與NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH兔抗小鼠一抗抗體（稀釋度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000和1∶10 000）結合，洗膜后與山羊抗兔IgG（目的蛋白1∶5 000，內參1∶40 000）雜交1h，洗膜后顯影。凝膠定量軟件Quantity-one掃描其光密度值，以NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7條帶與內參GAPDH條帶的光密度值之比值代表目的蛋白的相對含量。試驗重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Tamhane檢驗；相關性分析采用Pearson相關。

2 結果

2.1 小鼠足細胞在不同溫度條件下形態變化 見圖1（插頁）。

由圖1可見，在33℃條件下細胞呈現“鵝卵石狀”，胞體較小，在小鼠γ-干擾素誘導下不斷地增生傳代；在37℃條件下，經1～2周逐漸長出足突，胞體變大，足突與足突之間相互連接，足細胞逐漸分化成熟為“樹枝狀”。

2.2 各組足細胞 NEPH1、desmin、TGF-β1和 Smad7 mRNA的表達 見表2、圖2。

表2 各組足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7 mRNA的表達

圖2 各組足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7 mRNA的表達電泳圖（M：標準參照物；A：對照組；B：高糖1組；C：高糖2組；D：高糖3組）

由表2可見，與對照組相比，在不同濃度的高糖培養液孵育48h后，足細胞NEPH1和Smad7 mRNA表達顯著減少差異均有統計學意義（均P＜0.05或0.01），且NEPH1 mRNA的表達以高糖2組減少最明顯，高糖3組的表達反而較高糖2組增加（P＜0.05）；Smad7 mRNA表達在高糖2、3組之間無統計學差異（P＞0.05），但與高糖1組相比表達顯著減少差異均有統計學意義（均P＜0.01）。不同濃度高糖組足細胞desmin和TGF-β1 mRNA的表達較對照組顯著增多（P＜0.05或0.01）。高糖2、3組之間desmin mRNA和TGF-β1 mRNA的表達無統計學差異（P＞0.05），但兩者均較高糖1組顯著增多（均P＜0.01）。

2.3 對照組和高糖2組小鼠足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表達 見表3、圖3。

表3 對照組和高糖2組小鼠足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表達

圖3 對照組和高糖2組小鼠足細胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表達

由表3可見，與對照組相比，高糖2組小鼠足細胞在25mmol/L高糖培養液孵育48h后，表達NEPH1和Smad7蛋白顯著減少而desmin和TGF-β1蛋白顯著增加，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.4 兩因素間的相關性分析 小鼠足細胞在濃度從低到高的葡萄糖培養下NEPH1 mRNA和desmin mRNA的表達呈顯著負相關（r=-0.993，P＜0.01）；NEPH1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表達呈顯著負相關（r=-0.989，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA和desmin mRNA的表達呈顯著正相關（r=0.991，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA和Smad7 mRNA的表達呈顯著負相關（r=-0.996，P＜0.01）。

3 討論

晚近的研究發現足細胞的脫落和凋亡明顯滯后于蛋白尿的發生，當糖尿病大鼠模型中出現明顯的微量白蛋白尿時，腎小球足細胞的數量并沒有明顯的改變。導致早期足細胞功能受損、形成蛋白尿的機制可能和足細胞在持續的高糖環境誘導下，上皮細胞樣表型標志蛋白表達下降或消失，向EMT有關，而后期出現的大量蛋白尿則與足細胞脫落和凋亡有關，并且足細胞EMT是脫落和凋亡之前的一個可逆過程。足細胞發生EMT時，將失去成熟足細胞的上皮細胞樣表型標志物，而表達上調間充質細胞樣表型標志物。表型轉化為間充質細胞樣的足細胞凋亡增多，且和腎小球基底膜的黏附力下降。導致足突融合、引發蛋白尿。在以蛋白尿為特征的糖尿病腎病發生發展過程中，EMT可能是導致足細胞功能失調和蛋白尿的共同始發途徑。若深入研究其發生機制，并阻斷調節該過程的信號轉導通路，將會有效逆轉足細胞的EMT，從而減輕腎小球濾過屏障損傷、減少糖尿病腎病蛋白尿。

NEPH1是裂孔隔膜上的重要的組成蛋白和信號分子，當基因突變或者蛋白缺失時會破壞裂孔隔膜的完整性，導致足突融合、蛋白尿。越來越多的臨床和動物研究提示NPHS1基因編碼的nephrin蛋白參與糖尿病腎病足細胞EMT過程，雖然NEPH1和nephrin有相似的結構和亞細胞定位，兩者的基因缺失均可導致足突融合、蛋白尿[5]。但在高糖環境下NEPH1是否參與足細胞EMT目前尚缺乏實驗證據。當足細胞因各種原因發生損傷時，可大量表達desmin蛋白并發生表型轉化。后者可作為光鏡下足細胞損傷的標志性蛋白。

本研究發現不同濃度高糖培養48h后，小鼠足細胞與對照組相比形態、表型均發生明顯變化；NEPH1 mRNA表達顯著減少，desmin mRNA表達顯著增多，從低到高濃度葡萄糖培養下NEPH1和desmin mRNA的表達呈顯著負相關；與對照組相比，高糖2組NEPH1的蛋白表達顯著減少，而desmin的蛋白表達則顯著增加；均表明足細胞在高糖誘導下發生了EMT。此外，本研究觀察到小鼠足細胞發生EMT的程度并非呈葡萄糖濃度依賴性增加，NEPH1 mRNA表達減少以高糖2組最明顯，在高糖3組NEPH1 mRNA表達反而有所上調，desmin mRNA表達增加在這兩組之間無統計學差異，NEPH1這種表達上調是否與NEPH1相關信號轉導的上下游分子調節有關，值得研究。

TGF-β是誘導足細胞和小管上皮細胞EMT的主要介質，在介導EMT中發揮著至關重要的作用。糖尿病腎病患者和小鼠模型纖維化的腎臟均普遍存在TGF-β表達的上調[6]。目前認為高糖可通過TGF-β/Smad信號途徑介導足細胞損傷。Smad7是TGF-β/Smad信號通路中起負反饋作用的分子，一旦Smad7的表達量減少，該通路活性會增強。研究發現高糖誘導近曲小管上皮細胞Smad7的表達下調可能是腎臟近曲小管發生EMT的啟動因素[7]。

本研究發現與對照組相比，不同濃度高糖培養48h后小鼠足細胞Smad7 mRNA表達顯著減少，TGF-β1mRNA表達顯著增多，從低到高濃度葡萄糖培養下TGF-β1和Smad7的表達呈顯著負相關；高糖2組足細胞Smad7的蛋白表達較對照組顯著減少，而TGF-β1的蛋白表達較對照組顯著增加。提示高糖可能通過誘導Smad7表達下調后激活TGF-β/Smad信號途徑，啟動足細胞發生EMT。此外，本研究觀察到小鼠足細胞Smad7 mRNA表達下調和TGF-β1 mRNA表達增加并非呈葡萄糖濃度依賴性，在高糖2、3組表達無統計學差異，提示高糖誘導小鼠足細胞EMT作用似乎存在一個濃度平臺期。

綜上所述，高糖誘導小鼠足細胞轉分化是導致早期

足細胞功能受損、糖尿病腎病早期微量蛋白尿發生的病理機制。同時，Smad7表達下調可能是高糖激活TGF-β/ Smad信號途徑，促使足細胞轉分化的因素之一。因此，研發抑制TGF-β/Smad信號通路的活化，靶向保護足細胞的藥物，有望在糖尿病腎病早期抑制甚至部分逆轉足細胞的EMT，延緩蛋白尿的發生。

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（本文編輯：章潔）

本刊可直接用縮寫的常用詞匯

Impact of high-glucose on epithelial-mesenchymal transition in mouse podocytes

YE Xun,HOU Pengchao,HONG Yuzhi.
Department of Endocrinology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou 310007，China

High glucose Podocyte Phenotypic transformation NEPH1 Smad7

白細胞介素（IL）變異系數（CV）丙氨酸轉氨酶（ALT）丙型肝炎病毒（HCV）磁共振成像（MRI）蛋白質印跡（Western blot）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）動脈血氧二氧化碳分壓（PaCO2）動脈血氧分壓（PaO2）輔助性T淋巴細胞（Th）干擾素（IFN）甘油三酯（TG）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）核因子-κ（NF-κB）紅細胞沉降率（ESR）活化部分凝血活酶時間（APTT）獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）甲型肝炎病毒（HAV）接受者操作特征曲線（ROC曲線）精制結核菌素試驗（PPD）磷酸鹽緩沖液（PBS）酶聯免疫吸附測定（ELISA）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）凝血酶時間（TT）凝血酶原時間（PT）曲線下面積（AUC）人類免疫缺陷病毒（HIV）腎小球濾過率（GFR）食品藥品管理局（FDA）世界衛生組織（WHO）隨機對照試驗（RCT）胎牛血清（FBS）體重指數（BMI）天冬氨酸轉氨酶（AST）纖維蛋白原（Fb）血管性血友病因子（vWF）血紅蛋白（Hb）嚴重急性呼吸綜合征（SARS）乙型肝炎病毒（HBV）乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBc）直接膽紅素（DBil）腫瘤壞死因子（TNF）重癥監護病房（ICU）自然殺傷細胞（NK細胞）總膽固醇（TC）總膽紅素（TBil）最小抑菌濃度（MIC）

2014-09-25）

浙江省中醫藥科學研究基金計劃（2012ZA097）；杭州市科委醫療衛生及重點?？茖２】蒲泄リP專項（20130733Q16）

310007 杭州市中醫院內分泌代謝科

洪郁芝，E-mail：hyzhcy@aliyun.com