丹酚酸A對H2O2所致大鼠腦微血管內皮細胞氧化損傷保護的實驗研究

易志紅 白洋 陳立蓀 徐峰 陳利江

丹酚酸A對H2O2所致大鼠腦微血管內皮細胞氧化損傷保護的實驗研究

易志紅 白洋 陳立蓀 徐峰 陳利江

目的 觀察丹酚酸A對H2O2所致大鼠腦微血管內皮細胞（RCMECs）氧化損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。方法 分離并培養大鼠腦微血管內皮細胞，用H2O2損傷的方法建立氧自由基損傷模型。采用丹酚酸A進行干預后，分別測定細胞培養液中乳酸脫氫酶（LDH）活性、血栓素B2（TXB2）水平、6-酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）的含量，以及細胞內和培養液中脂質過氧化產物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結果 H2O2致RCMECs氧化損傷后，細胞LDH釋放水平、TXB2和MDA的含量均明顯增加，同時6-keto-PGF1α含量和SOD活性顯著下降；而丹酚酸A預處理后能呈濃度依賴性的降低RCMECs氧化損傷后LDH水平、TXB2含量和細胞內外的MDA含量，提高受損細胞6-keto-PGF1α的表達和細胞內外SOD活性。結論 丹酚酸A對H2O2所致RCMECs氧化損傷具有保護作用，其機制可能與其抗氧化作用有關。

丹酚酸A H2O2氧自由基損傷 腦微血管內皮細胞

血管內皮細胞是血液與組織間進行物質交換的屏障，其能分泌和釋放多種生物活性物質，參與多種生理和病理過程[1-2]。在腦缺血損傷時，H2O2造成的氧化應激效應可直接導致腦血管內皮細胞的損傷，進而觸發漸進性的缺血后低灌注，嚴重時將導致繼發性大腦或脊髓組織退變[3-4]。尋找能對抗缺血性腦血管疾病所致血管內皮細胞氧自由基損傷的藥物具有重要的臨床意義。丹酚酸A是從丹參中提取的一種水溶性成分，對缺血再灌注引起的心肌細胞損傷具有一定保護作用，其機制可能與其對抗氧化損傷，穩定線粒體膜有關，但目前對于丹酚酸A在腦血管缺血損傷保護中的作用及機制尚不清楚[5-6]。本研究采用大鼠腦微血管內皮細胞（RCMECs）氧化損傷模型，研究了丹酚酸A對RCMECs氧化損傷的保護作用，希望為丹酚酸A用于缺血性腦血管疾病的治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 RCMECs由正大青春寶藥業有限公司提供，丹酚酸A（批號：130821）購于上海友思生物技術有限公司；含酚紅及不含酚紅的M199干粉培養基和Ⅱ型膠原酶購于Gibco公司；新生小牛血清購于杭州四季青生物技術研究所；30%H2O2溶液于臨用前稀釋配制；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：20131222）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20130516）和丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20130820）購于南京建成生物工程研究所；6-酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）測試盒（批號：20140526）及血栓素B2（TXB2）測試盒（批號：20140321）購于天津九鼎醫學生物工程有限公司；兔抗人Ⅷ因子相關抗原多克隆抗體（批號：ZA-0321）購于北京中山公司；Edaravone（批號：1138017）購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 H2O2損傷 RCMECs模型的建立和實效分析RCMECs的原代培養、傳代及鑒定參照參考文獻[7]，并采用MTT比色法確定適宜的H2O2濃度及孵育時間：RCMECs按1×105/孔培養于96孔板中，待其貼壁后分別加入不含酚紅的M199培養液配置的H2O2，使其終濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mmol/L的溶液，并分別在37℃、5%CO2培養箱中培養0.5、1、2和4h。采用MTT法，用酶標儀在490nm波長下測定吸光度值，并根據結果選擇最適宜的H2O2濃度和孵育時間。其中H2O2濃度測定按Spitz的方法[8]進行。

1.2.2 實驗細胞分組 取第2～8代RCMECs按1×105/孔培養于96孔板中，每組6個復孔，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，待其貼壁后生長至亞融合狀態時換成無血清培養基作用12h進行實驗。將細胞分為4組：正常組、損傷組、給藥組、對照組。其中正常組不加任何處理因素；損傷組根據最適宜的H2O2濃度和孵育時間進行造模；給藥組預先給予2.5、5.0、10μmol/L丹酚酸A（分別設為給藥組1、給藥組2、給藥組3），對照組則預先給予0.4μmol/l自由基清除劑edaravone，分別孵育20h后，與損傷組一起根據最適宜H2O2濃度和孵育時間進行造模，并檢測下述指標。

1.2.3 RCMECs培養液中LDH活性、TXB2以及6-keto-PGF1α含量的檢測 取上述4組細胞培養的上清液各100μl，按照檢測試劑盒說明，分別采用比色法檢測RCMECs培養液中的LDH活性，采用放射性免疫法檢測細胞培養液中血栓素A2的最終代謝產物TXB2的水平和前列環素最終代謝產物6-keto-PGF1α的含量。

1.2.4 RCMECs培養液中SOD活性的檢測 采用黃嘌呤氧化酶法分別對各組細胞SOD的吸光度值進行檢測并計算其活性。將各組細胞移入離心管中，每管細胞數（1～2）×105個，200×g離心10min，棄上清液；沉淀中加入0.6ml冰三蒸水，旋渦振蕩混勻1min；加入0.3 ml無水乙醇，混勻30s；加入三氯甲烷0.3ml，混勻1 min；200×g離心10min；吸取上層抽提液100μl，并按照SOD測定試劑盒說明，比色法檢測各組細胞內SOD的吸光度值并計算其活性。

1.2.5 RCMECs培養液和細胞內中脂質過氧化產物丙二醛（MDA）含量的檢測 MDA含量的檢測采用硫代巴比妥酸法。取上清液200μl，按照MDA測定試劑盒說明，以比色法在532 nm處測定吸光度值，并計算培養液中MDA的的含量。細胞內MDA含量的檢測方法同細胞內SOD活性測定方法。取抽提液300μl，按照MDA測定試劑盒說明，比色法檢測細胞內MDA的吸光度值并計算其含量。以上步驟重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件，計量資料以表示，樣本均數間比較采用t檢驗，多組間的比較采用方差分析。

2 結果

2.1 H2O2致RCMECs氧化損傷的時效、量效分析 見表1。

表1 H2O2致RCMECs氧化損傷的時效、量效分析

由表1可見，不同濃度H2O2干預者的吸光度值均顯著低于0mmol/L者（P＜0.01）；且RCMECs的活性隨著H2O2濃度增加及作用時間的延長逐漸降低。由此，實驗最終選取了0.125 mmol/L H2O2作用0.5h作為最適的造模條件，這一條件一方面可以縮短實驗時間，另一方面能使損傷后細胞活力有效降至正常組50%左右。

2.2 丹酚酸對抗氧化損傷的結果 見表2。

由表2可見，（1）H2O2損傷組細胞LDH釋放量較正常組明顯增加（P＜0.01）。與損傷組相比，各給藥組經丹酚酸A、對照組經edaravone預處理后，均使H2O2所致RCMECs損傷后LDH的釋放顯著降低（P＜0.05或0.01），并隨著丹酚酸A濃度的升高其作用逐漸增強，呈現濃度依賴性；（2）H2O2致RCMECs氧化損傷后，細胞培養液中TXB2的含量顯著性增加（P＜0.01）。各給藥組丹酚酸A和對照組edaravone預處理后，均使H2O2所致細胞培養液中TXB2的含量明顯降低（P＜0.05），并呈現濃度依賴性；同時，H2O2能顯著抑制內皮細胞6-keto-PGF1α的表達（P＜0.01），而丹酚酸A預處理則可有效降低H2O2對6-keto-PGF1α表達的抑制作用（P＜0.01），且呈濃度依賴；（3）H2O2可致細胞內和培養液中MDA含量較正常組顯著升高（P＜0.01）。而5μmol/L和10μmol/L丹酚酸A給藥組，以及對照組則可有效降低MDA含量（P＜0.05）；（4）H2O2能顯著抑制RCMECs細胞內和培養液中SOD活性（P＜0.01）。不同給藥組丹酚酸A和對照組edaravone預處理后，均可使H2O2作用后細胞內和培養液中SOD的活性明顯提高（P＜0.01），并呈現濃度依賴性。

表2 丹酚酸對抗氧化損傷的結果

3 討論

目前己知氧自由基引發的過氧化反應是缺血性腦損傷的重要機制之一[9-10]。正常情況下，體內自由基的產生和消除處于動態平衡狀態，故不發生自由基連鎖反應和組織損傷。腦缺血發作時，腦細胞生物氧化功能發生異常，產生大量自由基，自由基氧化損傷血管內皮細胞、毛細血管基底膜和腦細胞，造成毛細血管通透性增高和細胞功能障礙等[9-10]。本研究中我們采用H2O2作為外源性自由基生成系統，成功建立了大鼠腦微血管內皮細胞（RCMECs）過氧化損傷模型。同時，為進一步分析丹酚酸A在RCMECs氧化損傷中的保護作用和機制，我們重點對氧化損傷過程中幾個重要指標進行了評測。

MDA是自由基對內皮細胞損害后，引起生物膜上不飽和脂肪酸脂質過氧化反應的最終代謝產物，常用來反映組織脂質過氧化損傷的程度[9-10]。而SOD作為目前發現的人體唯一的負氧離子天然酶類清除劑，其活性高低亦可間接反映組織自由基的含量[11-12]。測定MDA和SOD水平不僅可反映內皮損傷的原因而且還可判斷內皮損傷的程度。本實驗結果顯示，H2O2損傷RCMECs后，SOD活性顯著降低而MDA含量顯著升高，這在一定程度上也表明了該細胞氧化損傷模型的有效性。而丹酚酸A預處理則可增加培養液中及細胞內SOD活性，降低MDA水平。該結果提示丹酚酸A對內皮細胞功能的保護作用可能與其抗過氧化損傷作用有關。

LDH水平的增高是細胞受損的一個敏感指標，它能一定程度上反映細胞的損傷程度。我們的實驗發現，H2O2可顯著的增加RCMECs中LDH的釋放水平，同時，丹酚酸A可呈濃度依賴性的減少H2O2所致RCMECs的LDH過度釋放，一定程度上顯現了其對氧化損傷的保護作用。

RCMECs不僅是血腦屏障的重要組成部分，還可釋放多種生物活性物質如PGI2和TXA2等參與多種生理和病理過程[13]。其中PGI2是花生四烯酸經PGI2合成酶催化合成的一種重要血管活性物質，具有擴張血管、抑制血小板黏附、聚集，以及抑制中性粒細胞產生氧自由基等作用。TXA2是前列腺素H2（PGH2）經TXA2合成酶催化合成的代謝產物，具有收縮腦血管、促進血小板黏附、聚集的作用。PGI2和TXA2互相制衡，維持著正常腦微循環及腦血管內皮功能。而H2O2一方面通過增強環氧酶的活性，刺激RCMECs分泌TXA2，并抑制PGI2合成酶的活性，使PGI2合成減少，從而打破PGI2和TXA2之間的平衡；另一方面，H2O2還可通過Fenton反應生成超氧陰離子氧化損傷內皮細胞，使的PGI2/TXA2失衡，引起血小板聚集及腦微循環障礙，加重腦缺血癥狀。由于PGI2和TXA2半衰期極短，因此，我們分別測定了其穩定代謝產物6-keto-PGF1α與TXB2，間接反映兩者的實際水平。實驗結果表明，與正常組相比，H2O2損傷后6-keto-PGF1α含量降低而TXB2含量則升高，兩者比值亦顯著降低；而丹酚酸A預處理能顯著抑制血管內皮細胞氧化損傷后6-keto-PGF1α的降低，并抑制TXB2含量的增高，進一步提示丹酚酸A對H2O2所致過氧化損傷的RCMECs具有保護作用。

綜上所述，本實驗在成功建立大鼠腦微血管內皮細胞過氧化損傷模型的基礎上，發現丹酚酸A對H2O2所致RCMECs損傷具有保護作用，其作用機制可能與丹酚酸A的抗氧化作用有關。

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Protective effects of salvianol acid A on hydrogen peroxide-induced oxidative injury of rat cerebral microvascular endothelial cells

YI Zhihong，BAI Yang，CHEN Lisun，et al.
Department of Internal Medicine-Neurology,Keqiao Traditional Chinese Medicine Hospital, Shaoxing 312030,China

【 Abstract】 Objective To investigate the protective effects of salvianol acid A(Sal A)on hydrogen peroxide-induced oxidative injury in rat cerebral microvascular endothelial cells(RCMECs). Methods RCMECs were isolated and cultured;the cultured cells were treated with hydrogen peroxide to induce the oxidative injury.Different concentrations of SalA were added in cell culture to intervene the cell injury.Lactate dehydrogenase(LDH),malondialdelyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)activities were measured by automatic biochemistry analyzer.Radioimmunoassay was applied to measure the thromboxane B2 (TXB2)and 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α). Results After incubated with 0.125 mmol/L hydrogen peroxide for 0.5 h,the viability of RCMECs was significantly inhibited,the LDH,MDA and TXB2 levels in culture supernatant were significantly increased,while 6-keto-PGF1α and SOD levels were decreased.Pre-incubated with different concentrations of SalA for 20h significantly decreased the levels of LDH,MDA and TXB2,and increased 6-keto-PGF1α level and the activity of SOD. Conclusion SalA can protect RCMECs against hydrogen peroxide-induced injury in a concentration-dependent manner,which may be associated with its antioxidant effects.

Salvianol acid A Hydrogen peroxide Oxygen free radical injury Cerebral microvascular endothelial cell

2014-08-20）

（本文編輯：楊麗）

312030 紹興市柯橋區中醫醫院神經內科（易志紅、陳立蓀、徐峰、陳利江）；正大青春寶藥業有限公司研究所（白洋）

白洋，E-mail：1651937146@qq.com