活性菌肽豆蛋白噴霧干燥工藝研究

■ 謝帝芝 陳 芳 劉 臻 聶國興 魯雙慶

(1.河南師范大學水產學院，河南新鄉453007；2.長沙學院生物工程與環境科學系，湖南長沙410003)

青魚生長激素（black carp growth hormone,bc?GH）能促進魚體生長發育，加速蛋白質的合成，促進脂類降解等。酵母不僅是水產餌料中較為理想的蛋白源，而且還是外源基因理想表達受體系統，表達蛋白可以正確折疊、糖基化，具有活性等。近年來，本實驗室成功構建了青魚生長激素基因工程酵母菌（簡稱，工程酵母菌）。并以豆粕為發酵底物，用該菌進行液態發酵，以甲醇做基因表達的誘導劑，研究了工程酵母菌在豆粕中的發酵工藝。工程酵母菌的發酵產物中既含有促生長的bcGH蛋白，又含有豆粕降解的肽類物質，人們將這種的發酵豆粕稱為活性菌肽豆蛋白。本研究室利用活性菌肽豆蛋白配合飼料飼喂鯽,結果表明活性菌肽豆蛋白具有顯著的促生長效果。上述研究為活性菌肽豆蛋白作為一種新型蛋白飼料，廣泛地應用到水產配合飼料中奠定了基礎。

為了能使工程酵母菌發酵產物——活性菌肽豆蛋白產業化，需將其干燥濃縮化。然而，同大多數微生物一樣，工程酵母菌也具有熱敏性和濕敏性，干燥過程需要改變物料的溫度和濕度。噴霧干燥是一種生產率高、干燥時間短，操作工程簡單且費用低的工藝，是最普遍采用的濃縮微生物的方法之一。所以，本研究擬采用噴霧干燥法濃縮活性菌肽豆蛋白，探討干燥工藝參數對濃縮活性菌肽豆蛋白中工程酵母菌存活率的影響，為工業化生產活性菌肽豆蛋白提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與培養基

菌種：工程酵母菌為本實驗室構建保存。

菌種活化培養基（MD培養基）：15 g/l瓊脂粉，高壓滅菌20 min，再加入過濾除菌的13.4 g/l酵母基本氮源、20 g/l葡萄糖和0.4 mg/l生物素；種子培養基（BMGY培養基）：20 g/l胰蛋白胨，10 g/l酵母粉，高壓滅菌20 min，再加入過濾除菌的13.4 g/l酵母基本氮源、pH值6.0 100 mM磷酸鉀、1%甘油和0.4 mg/l生物素；發酵培養基：6%豆粕粉；檢測培養基（YPD培養基）：10 g/l酵母提取物，20 g/l胰蛋白胨，20 g/l瓊脂粉，高壓滅菌20 min,再加入過濾除菌的20 g/l葡萄糖。

1.1.2 儀器與設備

INFORS AGCH-4103控溫搖床；TOMYSS-325滅菌鍋；Thermo Forma超凈工作臺；BECKMAN Avanti J-30I離心機；SHIMADZU UV-2550紫外可見分光光度計；數顯生化培養箱；SY3000發酵罐；YC-015實驗型噴霧干燥機。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養

①菌種活化：取-80℃冰箱保藏的工程酵母菌菌種劃線轉接到MD培養基，30℃恒溫倒置培養72 h。

②種子培養：接1環生長良好的MD平板種子至50 ml種子培養基的500 ml搖瓶中，置于300 r/min恒溫搖床，30 ℃振蕩培養24 h，當菌液A560為2～6時，作為發酵用種子。

③種子濃度的測定：采用紫外可見分光光度計測定種子的光密度。以種子培養基作空白對照，取1 ml種子液于1 cm比色皿中，560 nm波長下測定OD值。

1.2.2 發酵罐發酵

使用火焰接種法接種工程酵母菌，將培養好的種子接入裝填量為7 L的10 L發酵罐。具體發酵工藝見作者前期研究工作[7]。發酵完畢后，取100 ml樣本用于檢測其含菌量。

1.2.3 噴霧干燥

用YC-015實驗型噴霧干燥機干燥1 L工程酵母菌發酵液，氣體經過鼓風機后被過濾并分別加熱到相應的溫度，以一定的速度進風，蠕動泵將發酵液分別以應的速度傳送到雙流不銹鋼噴霧器。排出氣體溫度通過調控發酵液進樣速度而控制在60℃左右。從旋風分離器下收集發酵產品——活性菌肽豆蛋白（約100 g），取1 g樣本用于檢測其含菌量。

1.2.4 工程酵母菌計數及存活率計算

取0.1 ml工程酵母菌發酵液或0.1 g活性菌肽豆蛋白粉末溶于9.9 ml中，用無菌水逐級稀釋104倍，再取0.1 ml稀釋液均勻涂布于YPD平板上，30 ℃，倒置培養72 h，計數每個平板上的工程酵母菌菌落數，同時做三個平行。

式中:A為每ml液含菌量；B為每g活性菌肽豆蛋白粉末含菌量；X為0.1 ml稀釋液含菌量；C為工程酵母菌存活率。

1.3 數據統計

結果以每個處理3個平行的“平均值±標準誤（Mean±SE）”表示。

2 結果與分析

2.1 工程酵母菌發酵液含菌量

工程酵母菌發酵液通過稀釋、倒置培養和計數，測得每1 L發酵液平均含菌量高達7.96×109CFU/ml。

2.2 進風溫度對工程酵母菌存活率的影響

為摸索最適的進風溫度，將進風速度和進樣速度分別固定為在1.10 m3/min和12.00 ml/min，研究不同進風溫度對工程酵母菌存活率的影響（見表1）。結果表明，工程酵母菌存活率隨著進風溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢。當進風溫度為120℃時，活菌數高達2.09×1010CFU/g，存活率最高。進風溫度越高，表面水分蒸發得越快，水分蒸發雖是瞬間，但過高的溫度也會導致工程酵母菌大量死亡；進風溫度太低，工程酵母菌發酵產品會因含水量高而嚴重粘壁，影響產品收集和菌的存活率。

表1 進風溫度對bcGH工程菌存活率的影響

2.3 進風速度對工程酵母菌存活率的影響

探討了進風速度對工程酵母菌存活率的影響，在進風速度達到1.10 m3/min之前，活菌數和存活率與進風速度成正比例，而當進風速度超過1.10 m3/min時，工程酵母菌存活率明顯下降，其結果如表2。進風速度太快，產品不能完全干燥，而且隨廢氣一起排出，降低了工程菌存活率；速度過慢，也會因嚴重粘壁而影響菌的存活率。

表2 進風速度對工程酵母菌存活率的影響

2.4 進樣速度對工程酵母菌存活率的影響

表3 進樣速度對工程酵母菌存活率的影響

由表3可以看出，當進樣速度為14.00 ml/min時，工程酵母菌存活率有所下降，而進樣速度為12.00 ml/min時，工程酵母菌存活率最高。結果提示活菌數和存活率并不是隨著進樣速度的增加而一直提高，這是因為單位時間內供熱量不變，進樣速度越大，干燥效率就越低，造成嚴重的粘壁現象，影響產品的收集和菌存活率；進樣速度太低，單位物料承受的熱量過大，蒸發過度，使菌體大量死亡。

2.5 噴霧干燥正交試驗

通過單因素試驗大致確定了噴霧干燥的條件，為了使獲得的工程酵母菌存活率達到最大，選用進風溫度、進風速度、進樣速度3個因素，采用3因素4水平正設計方法進行噴霧干燥條件的優選試驗，因素水表與正交設計及試驗結果分別見表4和表5。

表4 噴霧干燥正交試驗因素水平

根據表5所示計算結果，比較各因素極差R值大小，可以看出各因素對工程酵母菌存活率的影響主次順序：進風溫度＞進樣速度＞進風速度，最優干燥組合條件為A3B2C3，即進風溫度120℃，進風速度1.10 m3/min，進樣速度12.00 ml/min。

表5 噴霧干燥正交試驗結果

2.6 噴霧干燥正交試驗驗證試驗

將正交試驗得到的最佳噴霧干燥條件組合與理論最佳組合（10號）進行比較，每個組合重復3次，確定最佳組合。

表6 酵母工程菌存活率正交試驗驗證結果

表6的數據說明，通過正交試驗所獲得最佳噴霧干燥工藝條件，重復性很好，工程酵母菌平均存活率為28.54%，平均值比10號（A3B2C4）的試驗結果高出5個百分點，說明優化條件具有很好大的重現性和可靠性。

3 討論

為了使活性菌肽豆蛋白中工程酵母菌存活率最大化，本文正交實驗探討了噴霧干燥的進風溫度、進風速度、進樣速度等3個因素對工程酵母菌存活率的影響。研究結果表明，進風溫度對工程酵母菌的存活率影響最大，為主要影響因素。在其它微生物的噴霧干燥研究中，也發現進風溫度顯著影響了菌體存活率。例如，張煜等研究表明當進風溫度高于170℃，活性乳酸菌豆粉中的乳酸菌存活量明顯降低。在植物乳桿菌MA2噴霧干燥過程中，發現140℃進風溫度下得到的發酵劑活菌數最高，達到7.3×108CFU/g，當進口溫度達到200℃時，活菌數降低到2.7×107CFU/g。本研究也發現130℃進風溫度下工程酵母菌存活率低于120℃近4個百分點。Teixeira等[13]研究發現噴霧干燥溫度對微生物的致死作用主要是由于菌體蛋白質凝固變性，核酸發生降解變性失活，從而破壞細胞的組成；熱溶解細胞膜上類脂質成分形成極小的孔，使細胞內容物流失，從而導致死亡。雖然噴霧干燥影響微生物的存活率，但是相對冷凍濃縮干燥法來說，其產業化利用的價值更大，前景更廣。

4 結論

活性菌肽豆蛋白的最適宜干燥工藝條件為：進風溫度為120℃、進風速度為1.10 m3/min，進樣速度為12.00 ml/min下，在此組合條件下活性菌肽豆蛋白中的工程酵母菌活菌數高達2.10×1010CFU/g，存活率為28.54%。本試驗驗證了噴霧干燥方法對活性菌肽豆蛋白干燥是完全可行的，為工業化生產活性菌肽豆蛋白的新型微生態飼料添加劑提供試驗依據。

（參考文獻13篇，刊略，需者可函索）