星點設計-效應面法優化牛心樸子葉多糖提取工藝的研究

■張 欣 貝盞臨 楊海嬋

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川750021)

牛心樸子(Cynanchum KomaroviiAl.Iljinski)俗稱黑心脖子、老瓜頭、蘆心草，系蘿摩科（Asclepiadaceae）鵝絨藤屬（Cynanchum）多年生直立或半直立叢生草本植物。在我國主要集中分布在西北部的寧夏、內蒙等地的沙漠及河邊或荒山坡，是喜光、極為耐旱、耐高溫的強旱生適陽植物，是土地嚴重沙質荒漠化的指示植物之一，也是草原逆行演替過程中最后階段的指示種。牛心樸子其生長條件要求不高，根系發達，耐寒，抗風沙，自我保護能力強，有很強的繁殖能力，在水分較少的干旱地帶也能保持較高的吸水和持水能力，在半沙漠化地區顯示了抗風固沙的優良特性，是干旱荒漠環境中的優勢植種。近些年來隨著中草藥開發熱潮的掀起，牛心樸子作為一種藥用植物也開始為人們所知曉，因其莖葉有毒，不能作為一般藥劑使用，所以在藥用方面受到極大限制，但據很多地方文獻記載，牛心樸子可用于鎮痛，祛痰醫藥等方面，藏醫用于治療膽囊炎?，F今對牛心樸子研究主要集中在從中分離出一些復雜化合物，如多結構烴類、多種分子結構復雜的生物堿、多糖等。很多種類成分對于醫學及其它研究有重大意義，如牛心樸子中提取、精制的多糖對抗S180肉瘤效應初步觀察實驗中表明牛心樸子多糖有較好的抑瘤作用。這對于現今很多無法醫治的腫瘤給予了可能的曙光，而如何能最大程度地提取、獲得牛心樸子多糖工藝條件，這將對牛心樸子的資源高效利用尤為重要。

本試驗以野生牛心樸子的葉為試材，以乙醇水溶液作為牛心樸子的葉多糖提取溶劑，依據星點設計-效應面法對因素變量（溶劑濃度、超聲提取時間、料液比）進行二項式擬合，效應面法分析每個因素的顯著性和交互作用來對牛心樸子葉中多糖的提取工藝進行優化，得到最佳的提取條件，為今后對牛心樸子葉多糖的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

牛心樸子成熟葉子，于2014年7月采自寧夏鹽池縣境內毛烏素沙漠邊緣（東經107°24'2.09"，北緯37°53'7.21"），標本保存于北方民族大學生物科學系植物標本室。將新鮮牛心樸子葉子，放置于陰涼處陰干，然后用萬能粉碎機進行粉碎，粉碎后過篩（80目）取細粉末，放入干凈的密封塑料袋中保藏備用。

1.1.2 試驗藥品

無水乙醇，分析純；蒽酮，分析純；濃硫酸，AR；葡萄糖，標準品；活性炭。

1.1.3 試驗器材

烘箱（DHG-9070A，380V/50HZ/140kw，武漢恒泰豐科試驗設備有限公司）、微型植物粉碎機（FZ102，220V/180W，鄭州博科儀器設備有限公司）、電子分析天平（FA3204B，220V/50HZ，上海天平儀器廠）、超聲波清洗器（KQ-500B，500W/200v/40KHZ，昆山市超聲儀器有限公司）、單光束紫外/可見分光光度計（UV1000，200V/50HZ/100W，滬制02270208號）、Millipore純水/超純水一體化系統（Di?rect-Q3,5,8）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

精確稱取牛心樸子葉細粉末0.3 g，放入150 ml錐形瓶內，加入50%乙醇50 ml，超聲提取30 min，活性炭（于25℃水浴中）脫色10 min、過濾，取濾液定容至1 000 ml。

蒽酮-硫酸試液：精密稱取蒽酮0.2 g，加100 ml濃硫酸，溶解既得，現用現配使用。

1.2.2 多糖標準曲線的繪制

用UV765紫外-可見分光光度計在390～780 nm范圍內進行波譜掃描，檢測最大吸收峰波長為620 nm。以葡萄糖（標準品）測定的線性回歸方程：y=0.038 4x+0.036 8，相關系數R2=0.999 3。

1.2.3 精密度試驗

精密吸取對照品溶液0.5 ml，按照1.2.2方法，依次顯色，測定吸光度，重復測定吸光度6次，計算吸光度相對標準偏差：RSD=1.8%，表明精密度良好。

1.2.4 多糖含量的測定

參考蒽酮-硫酸法，略有改動。

1.2.5 單因素分析

采用超聲波、水提-醇沉法提取試驗材料中多糖，并選取料液比、乙醇水溶液濃度、超聲波浸提時間為影響試驗的主要單因素，研究多糖得率。

1.2.5.1 乙醇水溶液濃度對牛心樸子葉多糖提取率的影響

室溫（25±1）℃下采用水提-醇沉法提取牛心樸子葉中多糖，其中料液比為1∶15(g/ml）、超聲波（功率為200 W）浸提時間為30 min，分別加入50 ml濃度為10%、25%、40%、55%、70%、85%的乙醇水溶液，進行提取。

1.2.5.2 超聲波浸提時間對牛心樸子葉多糖提取率的影響

室溫（25±1）℃下采用水提-醇沉法提取牛心樸子葉中多糖，其中加入50 ml濃度為50%乙醇水溶液、料液比為1∶15(g/ml）、超聲波（功率為200 W）浸提時間分別為10、20、30、40、50、60 min，進行提取。

1.2.5.3 料液比對牛心樸子葉多糖提取率的影響

室溫(25±1)℃下采用水提-醇沉法提取牛心樸子葉中多糖，其中加入50 ml濃度為50%乙醇水溶液、超聲波(功率為200 W)浸提時間為30 min，料液比（g/ml）分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，進行提取。

1.2.6 效應面分析

綜合單因素試驗結果，采用效應面優化法（re?sponse surface methodology，RSM），實驗設計采用星點設計(Central Composite Design,CCD)，選擇出對多糖提取率有顯著影響的k個因素進行試驗，分別為：（A）乙醇水溶液濃度、（B）超聲波浸提時間、（C）料液比，作為自變量，牛心樸子葉中多糖提取率作為因變量，按照CCD設計的方法進行多元線性回歸和二項式擬合，用效應面法優化提取工藝條件。將每個因素設定5水平，分別用代碼-α、-1、0、+1、+α表示，k表示因素個數，α表示極值，當k＜5時，α=(2k)1/4進行計算。效應面實驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 乙醇水溶液濃度、超聲波浸提時間、料液比對牛心樸子葉多糖提取率的影響（見圖1)

由圖1所示，隨著乙醇水溶液濃度增加，牛心樸子葉多糖提取率呈“S”型上升，從曲線中可以看出溶劑濃度在70%～85%的時候提取率達到了一個頂峰；隨著超聲提取時間的延長，牛心樸子葉多糖提取率也呈“S”型上升，從曲線中可以看出超聲提取時間在設計的時間范圍，50～60 min的時候牛心樸子葉提取率較高；料液比中隨著液體的體積逐漸增大，牛心樸子葉多糖提取率呈先上升下降又上升的過程，從曲線中可以看出選擇料液比在設計的比例范圍，1∶20～1∶25的時候牛心樸子葉提取率較高。

2.2 星點設計試驗計算

圖1 溶劑濃度、超聲提取時間、料液比對多糖提取率的影響

根據表1，效應面分析法中的星點設計CCD試驗計算（A）乙醇水溶液濃度（v/v）、（B）超聲提取時間（min）、（C）料液比（g/ml），其中λ為各因素中的極值，M為每個因素里的中值，k=3，α=1.682，此外根據[-1-(-α)]/（XA2-λA2）=[+α-(-α)]/（λA1-λA2）求解得XA2，（XA1+XA2）=（λA1+λA2）求解得XA1，其它 XB1、XB2、XC1、XC2同理求得。最終結果見表2。根據星點設計試驗安排及結果見表3。將因變量（牛心樸子葉多糖提取率）與參考因素分別擬合為效應面與等高線（見圖2～圖4）。

2.3 提取條件的優化結果

通過軟件Design-Expert8.0.6分析，各因素取最優值后的效應所能取到的最大值（見圖5～圖7），多糖取條件殘差正態概率分布呈線性趨勢擬合，殘差與預測分布毫無規律，而預測與實際分布呈線性趨勢擬合。當提取乙醇水溶液濃度（A）為80%，超聲提取時間(B)為60 min，料液比(C)為1∶15 g/ml，牛心樸子葉多糖提取率最大值為2.89%(見表 3)。

表2 牛心樸子葉多糖提取條件的星點設計因素水平

表3 牛心樸子多糖提取條件的星點設計與效應面運算解決方案

圖2 乙醇水溶液濃度與超聲提取時間對多糖提取率影響的效應面與等高線

圖3 乙醇水溶液濃度與料液比對多糖提取率影響的效應面與等高線

圖4 超聲提取時間與料液比對多糖提取率影響的效應面與等高線

圖5 提取條件殘差正態概率分布

圖6 提取條件殘差與預測分布

圖7 提取條件預測與實際分布

3 結論

本實驗考察了在室溫條件下，以乙醇水溶液作為溶劑的不同濃度、超聲波輔助提取的不同時間、料液比的不同比例，外界因素對牛心樸子葉多糖提取率的影響。隨著溶劑濃度的增加，多糖提取率先上升后減緩又逐漸上升減緩的上升過程；隨著超聲提取時間的延長，多糖提取率先上升速度較快后上升減緩；料液比中隨著溶劑體積逐漸增大，多糖提取率先上升下降又上升。星點設計-效應面法分析牛心樸子葉多糖的理論提取率最高值為2.89%，而依據此優化提取工藝模型進行牛心樸子葉多糖提取，實際提取率為2.78%，明顯高于單因素條件的提取率，說明響應面分析的最優值真實可行，優化的提取條件具有實用價值。

（參考文獻12篇，刊略，需者可函索）