隱丹參酮單劑量和多劑量給藥在大鼠體內藥代動力學研究

曾 金，王猛猛，沈淑嬌，張志榮，蔣 健*，裘福榮*

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院臨床藥理科，上海 201203）

隱丹參酮單劑量和多劑量給藥在大鼠體內藥代動力學研究

曾 金，王猛猛，沈淑嬌，張志榮，蔣 健*，裘福榮*

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院臨床藥理科，上海 201203）

目的評價單劑量和多劑量灌胃隱丹參酮（Cryptotanshinone，CTS）的藥動學特征。方法將20只SD雄性大鼠隨機分為單劑量組（隱丹參酮10 mg/kg，1 d）、多劑量組（隱丹參酮10 mg/kg，每天1次，連續10 d）給予灌胃后，用LC-MS/MS法測定血漿中隱丹參酮的濃度。血藥濃度數據用DAS 2.0藥代動力學軟件處理，按兩室模型擬合并求算藥代動力學參數。結果隱丹參酮單劑量給藥后，Cmax為 （12.16±14.11）ng/mL，Tmax為 （2.88±2.56）h，T1/2為 （3.70±3.50）h，MRT為 （6.69±0.54）h，AUC0～24為 （58.40± 25.73）ng·h/mL；多劑量給藥后，Cav為（1.95±0.61）ng/mL，Tmax為（3.20±2.08）h，T1/2為（7.12±5.06）h，AUCss為（46.74±14.51）ng·h/mL，DF為2.42±0.28。單劑量和多劑量的AUC0～24、Tmax、T1/2差異無統計學意義。結論隱丹參酮長期給藥后無蓄積風險。

隱丹參酮；單劑量和多劑量；藥代動力學；LC-MS/MS

目前臨床上許多藥物長期使用會產生蓄積或耐藥現象，有特殊用途的藥物如抗腫瘤藥、抗病毒藥等出現蓄積現象提高藥物在體內的血藥濃度，加大臨床藥物運用的危險性；耐藥將會降低患者體內的藥物濃度，使藥物的治療作用降低甚至消失?？v觀臨床上發生耐藥現象，究其原因可能是長期服藥后造成體內藥物代謝酶發生變化，進而影響藥物在體內的吸收、代謝、排泄等過程，加速藥物排出體外；而蓄積效應的原因則更需要研究，以便更有效的保證臨床用藥的安全可靠。

隱丹參酮（Cryptotanshinone，CTS）是中藥丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的脂溶性成分之一。丹參味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。CTS是二萜醌類化合物，是從丹參中提取出的脂溶性混合物丹參酮成分之一，這類化合物在骨架上大多具有三元或四元碳環的鄰醌或對醌結構，其特殊結構使其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等活性。在眾多實驗及臨床研究中發現，CTS單體在抑制細菌生長[1]、改善組織炎癥[2-3]、抑制腫瘤增殖[4]、改善腦缺血損傷[5]、治療多囊卵巢綜合征[6]等發面發揮了有效的作用，含有CTS的中成藥如丹參酮膠囊、婦炎康片、丹蔞片等在臨床中得到廣泛的運用。有關CTS的單用以及合并用藥等研究已有報道，然而其劑量研究卻未見實驗報道。本研究通過灌胃SD大鼠CTS，評價單劑量和多劑量給藥后CTS在健康SD大鼠的藥動學特性，探討單劑量多劑量給藥方式之間是否存在差異，為該藥進一步在臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

日本島津LC-20A超高速液相色譜儀 (日本島津公司)：配置二元泵、系統控制器、自動進樣器、柱溫箱；API 4000-QTRAP型質譜儀(美國ABI/SCIEX公司)：配有電噴霧離子化源(ESI)、大氣壓化學離子化接口、三重四極桿質量分析器以及Analyst 1.5.2數據處理軟件；XS-105型十萬分之一電子天平 (瑞士 Mettler Toledo公司)；AS20500A型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；Millipore純水系統 (美國Millipore公司)；Thermo超低溫冰箱 (美國Thermo公司)；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.2 藥品及試劑

CTS，批號 110852-200305，規格 20 mg，純度98%，購自中國藥品生物制品檢定所；內標（IS）：地西泮 （DZP），批號115-9302，規格20 mg，純度100%，購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈均為色譜純(美國TEDIA公司)；甲酸、吐溫-80、乙酸銨、無水乙醇等均為分析純，購自中國醫藥集團總公司；水為去離子水；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜及質譜條件

液相條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm，美國Agilent Technologies公司）；流動相4 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈 (15∶85，v/v)，流速1 mL/min；等度洗脫5 min；進樣量20μL；柱溫30℃；進樣器溫度4℃。

質譜條件：離子檢測方式多重反應監測（MRM）；離子極性正離子（Positive）；離子化方式電噴霧離子化（ESI）；離子對CTS m/z 297.3→251.2；內標m/z 285.2→193.1；傳輸電壓103 V（CTS）、98 V（IS）；碰撞能量33 eV（CTS）、43 eV（IS）；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速10 L/min；霧化室壓力50 psi；毛細管電壓5 000 V。

2.2 對照品溶液的配置

精密稱取CTS對照品5.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶內，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.49 mg/mL的CTS儲備液，取儲備液適量，依次稀釋至所需濃度。精密稱取內標2.5 mg，加乙腈溶于10 mL棕色容量瓶內，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.25 mg/mL的內標儲備液，取適量儲備液用乙酸乙酯配置成0.4 ng/mL的溶液，作為內標溶液備用。

2.3 血漿處理方法

將血漿從-80℃取出，37℃解凍，振蕩5 min，用移液槍精密吸取血漿樣品100μL加入1.5 mL EP管中，并加入含 0.4 ng/mL內標的乙酸乙酯800μL，渦旋混勻3 min，靜置10 min，4℃ 12 000 r/min高速離心10 min，吸700μL上清，于60℃氮氣揮干，加100μL乙腈復溶，渦旋混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取上清，進行LC-MS/MS分析。

2.4 動物實驗方案

2.4.1 實驗動物 6～8周齡SPF級SD雄性大鼠20只，體質量（220±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2014-0002，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，自由飲水、飲食。

2.4.2 實驗用藥配制 精密稱取CTS標準品適量，吐溫-80、超聲振蕩器超聲助溶，用生理鹽水溶解并定容至濃度為2 mg/mL的混懸液，置4℃冰箱中保存，備用。

2.4.3 動物分組及給藥 將20只SD大鼠隨機分為單劑量組、多劑量組兩組，每組10只。

單劑量組：前9天每天予生理鹽水（含10%吐溫-80）灌胃，灌胃劑量為5 mL/kg（劑量換算與灌胃CTS體積相當），第10天以10 mg/kg灌胃含有CTS的生理鹽水混懸液，每天每只大鼠給藥量不超過2 mL。末次給藥前空腹取血后再灌胃，并按如下時間點進行采血取樣：0、10、20、30、45 min，1、1.5、2、3、4、8、12、24 h。至大鼠眼底靜脈竇取血0.3 mL，肝素鈉100μL抗凝，放置片刻后室溫下4 000 r/min離心10 min，分離血漿，于-80℃保存待測。

多次給藥組：每天按10 mg/kg的劑量連續灌胃含有 CTS的生理鹽水混懸液 （含吐溫-80）10 d，每天每只大鼠給藥量不超過2 mL。末次給藥前空腹取血后再灌胃，余下不同時間點采血取樣等操作同單劑量組。上述兩組動物整個實驗過程中不禁水，給藥前禁食12 h，給藥后2 h給予食物。

3 結果

3.1 分析方法驗證

3.1.1 方法專屬性 在“2.1”項下的色譜和質譜條件下，分別將空白血漿以及實驗大鼠給藥后的血漿樣品按“2.3”項下方法處理后，進樣，記錄色譜圖。由圖1可見，CTS（保留時間3.44 min）和DZP（保留時間2.11 min）峰形良好，血漿中內源性物質對測定干擾不明顯。

3.1.2 標準曲線 取1.5 mL的EP管數支，分別精密加入不同量的CTS標準液，加入空白血漿0.1 mL，渦旋混勻，配成含CTS濃度分別為0.1、0.25、0.625、1.5、2.5、7.5、15 ng/mL的標準含藥血漿。按“2.3”項下方法處理，進樣，記錄色譜圖。計算以血漿中CTS的濃度C為X軸，CTS峰面積AS和IS的峰面積Ai比值f（AS/Ai）為Y軸，采用加權（1/ x2）最小二乘法分別進行線性回歸，CTS的標準曲線回歸方程為：f=0.006 03X+0.000 05，r=0.999 6，n= 7，線性范圍 0.1～15 ng/mL。最低定量下限為0.1 ng/mL。

3.1.3 精密度和準確度 依“3.1.2”方法精密配制含CTS濃度分別為 0.2 ng/mL（低）、2.5 ng/mL（中）、15 ng/mL（高）的標準含藥血漿，每個濃度平行5份，并制備隨行標準曲線，按“2.3”項下方法處理，進行檢測，并于3 d內重復測定得到日間精密度，將所測定的結果進行t檢驗（P＞0.05），無統計學意義，計算精密度（RSD）和準確度，結果見表1。

圖1 專屬性考查的LC-MS/MS色譜圖

表1 CTS大鼠血漿濃度測定精密度準確度測定結果 （±s，n=5，%）

表1 CTS大鼠血漿濃度測定精密度準確度測定結果 （±s，n=5，%）

分組 測得濃度(ng/m L)日內精密度RSD準確度低 0.19–0.08 4.96 95.29 0.21–0.01 3.24 105.20 日間(3 d)測得濃度(ng/m L)精密度RSD準確度中 2.81–0.24 4.16 112.27 2.45–0.19 7.64 98.31高 14.63–1.26 3.24 97.59 15.88–1.86 7.46 105.85 ?

3.1.4 介質效應和提取回收率 以CTS的0.2 ng/mL（低）、2.5 ng/mL（中）、15 ng/mL（高）3種濃度考察CTS的介質效應，結果見表2，其結果表明CTS和IS無明顯的介質效應。取含CTS濃度為0.2 ng/mL（低）、2.5 ng/mL（中）、15 ng/mL（高）3種濃度的標準含藥血漿，按照絕對回收率方法處理后進樣。3種血藥濃度的絕對回收率結果見表2。

表2 CTS提取回收率和基質效應 （n=5）

3.1.5 穩定性試驗 取低（0.2 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（15 ng/mL）的CTS標準含藥血漿，分別在4、12 h測定以考察CTS的穩定性；反復凍融穩定性：同法配制低中高3種濃度的血漿樣品各5份，置于-20℃冰箱冷凍，后拿出融化，反復3次，并按照前法分別加以測定；長期冷凍：將血樣放置-80℃保存30 d后按前法配置3種濃度的CTS標準含藥血漿后進行檢測。

以上穩定性的檢測結果無明顯改變。

3.2 藥代動力學研究

3.2.1 血藥濃度-時間曲線 20只SD大鼠隨機分組灌胃CTS后，采取血漿經LC-MS/MS分析后，發現CTS呈雙峰吸收，與大多數藥物在體內的藥時曲線模式一致，即經過首過效應后藥物的吸收曲線呈雙峰現象。單劑量和多劑量組給藥后CTS的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 單劑量和多劑量灌胃隱丹參酮的平均血藥濃度-時間曲線（±s，n=20）

3.2.2 藥代動力學參數 單劑量灌胃CTS后，10只SD大鼠血漿中的CTS的Cmax為（12.16±14.11）ng/mL，AUC0～t為（58.40±25.73）ng·h/mL，Tmax為（2.88±2.56）h，主要藥動參數結果見下表3。10只大鼠多劑量灌胃CTS后，平均穩態血藥濃度為Cav為 （1.95±0.61）ng/mL，穩態血藥濃度-時間曲線下面積 AUCss為 （46.74± 14.51）ng·h/mL，波動度DF為2.42±0.28，多劑量灌胃CTS后的主要藥動學參數結果見表3。

利用統計學軟件SPSS 18.0對單次和多次給藥條件下血漿中CTS的各藥動學參數進行統計分析，AUC0～24和Cmax等經劑量矯正和自然對數轉換后用獨立樣本t檢驗分析，用“獨立樣本 t檢驗”對t1/2、“獨立樣本非參數檢驗”對Tmax進行檢驗，分析結果見表4。分析數據表明，單次給藥和多次給藥各藥動學參數血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0～24）、半衰期（t1/2）、達峰時間（Tmax）等差異無顯著統計學意義（P>0.05），CTS在大鼠體內沒有發生蓄積現象。

表3 CTS單劑量、多劑量的主要藥動學參數（±s，n=20）

表3 CTS單劑量、多劑量的主要藥動學參數（±s，n=20）

CTS參數t1/2(h) Tmax1(h) Tmax2(h) CL/F(L/kg) Vd/F(L/h·kg) AUCssng·h/mL AUC0～tng·h/mL AUC0～∞ng·h/mL Cmax1ng/mL Cmax2ng/mL Cavng/mL MRT(h) DF單劑量3.70±3.50 0.54±0.16 5.60±0.84 392.57±168.48 1 974.30±1 703.47—58.40±25.73 59.73±25.60 8.20±5.19 6.69±3.31—6.69±0.54—多劑量7.16±5.02 1.11±1.11 5.30±2.21 203.96±49.99 2 162.71±1 665.27 46.74±14.51 46.74±14.51 52.02±13.94 4.14±2.05 4.60±1.74 1.95±0.61 8.16±1.09 2.42±0.28

表4 CTS單劑量、多劑量的主要藥動學參數統計分析結果 （n=20）

4 討論

CTS是丹參的脂溶性成分，口服給藥的生物利用度很低，長期給藥后是否會產生耐藥。本研究基于這一問題進行研究，同時LC-MS/MS是實驗中檢測藥物濃度的常用方法，本試驗建立了CTS的LCMS/MS測定方法。

關于CTS單次給藥[7-9]以及復方給藥[10-11]的研究已經很多，都是基于CTS或者丹參酮在大鼠、豬、狗等動物上研究，缺乏CTS多劑量給藥后體內藥動學的研究，本文將SD大鼠單次、多次灌胃CTS后，采用LC-MS/MS檢測CTS血漿中的濃度，考察CTS在單次和多次給藥條件下體內藥動學行為是否存在差異，為臨床運用提供必要的數據支持。研究比較SD大鼠多劑量與單劑量給藥CTS，其藥動學主要參數經統計分析發現，二者的藥代動力學參數基本無差異，其AUC、t1/2統計的P值<0.05。單、多劑量的Tmax統計發現有差異，反應到平均藥時曲線上二者顯示出差異。從藥時曲線圖看，單次給藥的體內暴露量大于多次給藥，實際情況為單劑量組第5只大鼠給藥后體內暴露量明顯高于其他大鼠，導致單劑量平均藥時曲線較多劑量高。第5只大鼠體內超高暴露量提示CTS在大鼠體內的代謝可能存在基因多態性，具體原因有待進一步研究。如果將第5只大鼠的數據剔除后，單多次給藥的藥時曲線是相似的。灌胃CTS在體內屬于二室模型，與之前的研究[11]一致。

對于此次研究藥時曲線出現的雙峰，原因可能有下面幾點：（1）本次實驗采取口服灌胃給藥，胃按一定時間排空，藥物分成兩次到達小腸，造成藥物兩次入血，出現雙峰；（2）CTS由于肝腸循環的原因；（3）CTS是脂溶性化合物，其吸收后，迅速分布到組織中，在血液中藥物代謝到一定程度后，又出現二次釋放入血。如要知曉是何種原因造成藥物吸收后出現的雙峰現象，需要更進一步的研究。

本文比較SD大鼠單劑量和多劑量給藥條件下血漿CTS的濃度，發現單劑量和多劑量的AUC、t1/2等無統計學差異，提示單劑量和多劑量的生物利用度無差異，說明長期給藥后CTS在大鼠體內的吸收、分布、代謝和排泄沒有顯著改變，長期給藥后無藥物蓄積的風險，同時長期給藥后大鼠體內仍然能維持較穩定的血藥濃度。有研究[12]發現CTS在人肝臟微粒體內可通過CYP3A4進行代謝，大鼠的代謝酶確證暫時未知。本次研究中單劑量第5只大鼠出現體內超高暴露量則提示在未來研究中需要進行CTS的大鼠代謝酶型進行確證。

本研究對今后臨床運用CTS血藥濃度、藥物蓄積等安全性問題提供必要的數據支持，盡管實驗對象為SD大鼠，和人相比有一定的差異，但實驗結果提示多次給藥后CTS血藥濃度的蓄積風險較低。有關CTS在人體內多次給藥后的藥動學行為仍需進一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Pharmacokinetics of Cryptotanshinone w ith Single and M ultip le Doses in Rats

ZENG Jin,WANG Mengmeng,SHEN Shujiao，ZHANG Zhirong,JIANG Jian*,QIU Furong*
(Department of Clinical Pharmacology,Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Chinese Medicine, Shanghai 2012203,China)

ObjectiveTo evaluate the pharmacokinetic properties of cryptotanshinone(CTS)with single and multiple doses administration in SD rats.MethodsTotally 20 male SD rats were random ly divided into 2 groups:the single-dose group(CTS 10 mg/kg,1 d)and multiple-dose group(CTS 10 mg/kg,once a day,10 consecutive days).The CTS concentration in plasma was detected by LC-MS/MS method.The data of plasma concentration was processed by DAS 2.0 software and the pharmacokinetic parameters were calculated according to a two-compartment open model.ResultsThe pharmacokinetic parameters obtained from the single-dose study were as follows:Cmaxwas(12.16±14.11)ng/mL,Tmaxwas(2.88±2.56)h,T1/2was (3.70±3.50)h,MRT was(6.69±0.54)h and AUC0～24was(58.40±25.73)ng·h/mL;The pharmacokinetic parameters obtained from the multiple-dose study were as follows:Cavwas(1.95±0.61)ng/mL,Tmaxwas(3.20±2.08)h,T1/2was(7.12±5.06)h,AUCsswas (46.74±14.51)ng·h/mL and DF was 2.42±0.28.There was no significant difference in AUC0～24,Tmaxand T1/2of single and multiple doses.ConclusionThere was no risk of accumulation after long-term administration with cryptotanshinone.

cryptotanshinone;single dose and multiple doses;pharmacokinetics;LC-MS/MS

R285.5；R969.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.001

2014－12－01

十二五重大新藥創新《創新藥物研究開發技術平臺建設》（2012ZX09303009-001）；國家自然科學基金資助項目（81173118）；上海市中醫臨床重點實驗室項目（C10dZ2220200）。

曾 金，男，博士研究生，研究方向：中醫內科學。

*蔣 健，男，博士，主任醫師，博士生導師。*裘福榮，男，博士，主任藥師，碩士生導師。