姜黃素下調結直腸癌細胞Notch1信號通路研究

楊 芳，劉少瓊*，李春花，尹 玲，劉 婭，謝婉瑩

（南華大學附屬第一醫院，湖南 衡陽 421001）

姜黃素下調結直腸癌細胞Notch1信號通路研究

楊 芳，劉少瓊*，李春花，尹 玲，劉 婭，謝婉瑩

（南華大學附屬第一醫院，湖南 衡陽 421001）

目的檢測Notch1信號通路中Notch intracellular domain蛋白（NICD1蛋白)在大腸腺癌組織中表達的情況；探討姜黃素對人結腸癌細胞SW480及HT29細胞中Notch1信號通路的影響。方法二步法免疫組化檢測40例結直腸癌、31例癌旁腸組織石蠟切片中Notch1 intracellular domain蛋白（NICD1)的表達情況，通過對比人結腸直腸癌與癌旁正常腸黏膜細胞中蛋白陽性表達率判斷NICD1蛋白與人結直腸癌的關系；不同濃度姜黃素（0、7.5、15、30、60μmol/L)分別處理結腸腺癌細胞SW480和HT29細胞24 h和48 h后，Western blot法檢測細胞內NICD1、Notch1及HES-1蛋白的表達情況。結果NICD1在人結直腸癌組織中均表達，陽性率100%，癌旁腸組織中部分表達，陽性率為90.3%，但癌組織表達強度明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義 （P＜0.05）；Western blot結果示姜黃素能下調人結腸腺癌細胞SW480及HT29細胞中NICD1、Notch1及HES-1蛋白的表達，有時間和劑量依賴。結論Notch1信號通路中NICD1蛋白在結直腸癌組織中的過度表達可能與腫瘤的發生發展相關，其陽性表達的部位可能與癌組織的病理分期有關；姜黃素可能通過調控Notch1信號通路抑制結直腸癌細胞增殖。

姜黃素；Notch1通路；NICD；結直腸癌；結腸癌細胞SW480；結腸癌細胞HT29

結直腸癌是常見惡性腫瘤之一，男性和女性患者發病率分別位居第三位和第二位[1]，亞洲地區結直腸癌發生率和死亡率近幾十年快速增長，亞洲東部國家如中國、日本、韓國和新加坡，發生率以2倍到4倍速度增長，死亡率增長了35%[2]。結直腸癌傳統治療方法有外科手術、放化療等[3]。經規范聯合化療，可使結直腸癌病人5年生存率達42.7%[4]，但放化療給結直腸癌患者帶來明顯的毒副作用嚴重影響患者的生活質量，因此尋找高效、低毒抗腫瘤藥物任重道遠。

姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的活性成分，相對分子量為368.4，近幾年的研究顯示姜黃素對多種腫瘤有抑制作用，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌等[5]，還具備抗炎、抗氧化、防衰老等作用，除了功效多外，其毒副作用小、耐受性好，是極具潛力的抗癌藥物；此外，它還可以提高直腸癌患者對放療的敏感性，增加放射療法的治療效果，而且還可減輕化療藥物帶來的毒副作用，如皮膚損傷、腸道反應等[6]。

在哺乳動物中，Notch信號主要由配體（Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2)，受體（Notch 1-4）和相關靶基因：HES和HERP等構成。Notch信號激活由臨近細胞配-受體結合后，受體蛋白水解，釋放胞漿內活性結構域 （Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細胞核，與核內轉錄因子CSL（人類CBF1/RBPjk、果蠅SU(H)、線蟲Lag-1)結合，替換出轉錄抑制因子，募集轉錄激活因子，誘導Notch信號靶基因表達和轉錄[7]。Notch1信號通路在多種腫瘤組織中檢測出表達，包括乳腺癌、腎癌、食管癌、前列腺癌及結直腸癌等，并且Notch1信號與這些腫瘤對化療藥物耐藥及腫瘤向周圍侵襲轉移相關[8]。本研究通過免疫組化等方法檢測人結直腸癌組織中NICD1蛋白的表達及結腸腺癌細胞中 NICD1、Notch1及HES-1蛋白表達，探討姜黃素抑制結腸癌細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 病理切片 切片組織篩選來自源于南華大學附屬第一醫院病理科2010年至2012年所有大腸癌根治術患者，標本選取腫瘤組織蠟塊及癌旁組織蠟塊，對照組、正常組來源于癌組織切緣，距腫瘤組織>5 cm的切緣組織。其中直腸癌19例，結腸癌21例，腫瘤組織中高分化11例，中分化25例，低分化4例，男性患者29名，女性患者11名，平均年齡60歲，所有患者均無術前放化療及其他治療史，所有病例均經術后病理診斷明確。

1.1.2 細胞系、試劑及儀器 結腸腺癌細胞SW480購于湘雅細胞管理中心，結腸腺癌細胞HT29細胞購于中科院上海細胞庫。無噬菌體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，MCCOY'S 5A培養基購自sigma公司。姜黃素粉末（HPLC≥98.5%）購于成都瑞芬思生物科技有限公司。兔/鼠DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購于上海諾倫生物公司。兔抗人(Anti-NICD1 antibody，ab83232)購于英國Abcam公司，鼠抗人Anti-human Notch1 Purified（貨號：14-5785）購于affymetrix公司，Anti-HES-1抗體購于GeneTex公司。二抗山羊抗兔購于武漢博士德生物工程有限公司，兔抗鼠購于美國CST公司。蛋白裂解液、蛋白定量液、上樣緩沖液、SDS制膠試劑盒、蛋白Marker、顯影液均購于上海碧云天技術有限公司，SDS制膠電泳儀及轉膜槽產于北京六一公司，PVDF膜購自millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 二步法免疫組化檢測人結直腸癌組織及癌旁組織蠟塊NICD1蛋白表達情況 標本處理：病理切片常規脫蠟、水化，蒸餾水洗5 min，PBS漂洗3次，高壓抗原修復2 min后自然冷卻至37℃以下，PBS漂洗3次，3%H2O2封閉10 min，PBS漂洗 3次，除去PBS液，滴加1滴兔抗人NICD1單克隆抗體（稀釋濃度1∶1200），4℃孵育過夜；次日PBS漂洗3次，滴加聚合物增強劑 （試劑A），37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；滴加酶標抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30 min，PBS漂洗3次；滴加即用型Maxvision TM試劑，室溫下孵育10 min，PBS漂洗3次。滴加現配DAB顯色劑溶液，顯微鏡下觀察5 min；沖洗后蘇木精復染、中性樹膠封片。每次PBS漂洗4 min。

1.2.2 組織切片HE染色法 免疫組化相同石蠟標本切片，常規蘇木精-伊紅染色作組織學診斷。病理切片，常規脫蠟、水化，蒸餾水洗5 min，蘇木精染色液染色10 min；漂洗后1%鹽酸乙醇3 s；漂洗后0.5%伊紅液染色；梯度酒精漂洗后中性樹膠封固。

由2位有經驗的病理科醫師讀片，結果判定標準：NICD1蛋白主要表達在細胞質與細胞核。用陽性細胞數量和著色程度兩項加權法，陽性細胞數＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50% ～75%為3分，＞75%為4分；著色程度淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者相加，總分1～2分計為“-”，3分計為“+”，4分計為“++”，≥5分為“+++”。

1.2.3 細胞培養及蛋白免疫印跡 （1）細胞培養及藥物配制 含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，加1%青-鏈霉素雙抗，于5%CO2，37℃孵育箱中常規培養結腸腺癌細胞SW 480，同樣條件，用含10%胎牛血清的MCCOY’S 5A培養基培養常規培養結腸腺癌HT29細胞，1～2 d換液1次；待其貼壁生長融合至80%左右時，使用0.25%胰酶消化傳代。姜黃素粉末溶于二甲基亞砜（DMSO），母液濃度為1 mol/mL，經0.22μm無菌過濾器過濾后4℃冰箱避光保存，使用時用培養基稀釋成工作液，并使工作液中DMSO最終濃度＜0.01%。（2）蛋白免疫印跡取對數生長期細胞，消化后用含10%胎牛血清的培養基配成單個細胞懸液，均勻接種到6孔板，待其貼壁后加入含姜黃素培養基，濃度分別為0、7.5、15、30、60μmol/L繼續培養24 h和48 h，經消化、離心、洗滌收集細胞后加入含PMSF裂解液冰上裂解30 min；裂解后12 000 r/min離心10 min收集上清液，蛋白定量后加蒸餾水稀釋配平，使每組總蛋白量均等。加入SDS上樣緩沖液混勻后99℃煮沸5 min變性。

按照制膠試劑盒說明步驟配制分離膠和濃縮膠，根據蛋白分子量選擇10%分離膠，取25μL蛋白上樣，恒壓電泳，濃縮膠電泳80 v，30 min；分離膠電泳120 v，90 min，電泳后轉膜，大分子使用0.45μm PVDF膜、小分子使用0.22μm PVDF膜進行濕轉，轉膜條件：4℃冰浴中恒流200 mA，90 min。轉膜完成后5%脫脂牛奶封閉2 h后37℃一抗孵育1 h、4℃過夜。次日TBST漂洗濾膜3次，每次10 min，加入二抗37℃搖床孵育1 h，TBST漂洗濾膜3次，每次10 min，采用化學免疫發光法對膜進行顯影，一抗稀釋比例：NICD1（1∶1000），內參（1∶500），Notch1（1∶500），HES-1（1∶800）；二抗山羊抗兔：1∶3000，兔抗鼠：1∶2000。內參β-actin、NICD1、Notch1、HES-1蛋白分子量分別為 43、88、110、30 kDa。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行分析，免疫組化采用Wilcoxon符號秩和檢驗進行統計分析，蛋白免疫印跡圖片使用Image J軟件掃描，所得目的蛋白灰度比值=目的條帶灰度值/內參灰度值，采用ONEANOVA雙因素檢驗；P<0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 Notch1信號通路中NICD1蛋白在人結直腸腺癌及癌旁腸組織中的表達

免疫組化結果顯示，NICD1的陽性顆粒主要分布于細胞質與細胞核，表達情況見表1、封三彩圖圖1，P=0.000＜0.05，可認為癌組織中NICD1表達強于癌旁組織，相同組織HE染色見封三彩圖圖2。

2.2 蛋白免疫印跡法檢測蛋白

表1結直腸腺癌與癌旁組織中NICD1的蛋白表達

結腸腺癌細胞HT29和結腸癌SW480細胞分別用不同濃度姜黃素 （0、7.5、15、30、60μmol/L）處理24 h和48 h后，Notch1通路中受體蛋白Notch1，通路中活性蛋白NICD1，下游靶蛋白HES-1的表達情況：Notch1、NICD1、HES-1、β-actin蛋白免疫印跡結果見圖3、圖4，姜黃素降低了結腸腺癌細胞HT29和SW480細胞中Notch1、NICD1、HES-1蛋白的表達，有濃度和時間依賴；姜黃素處理組（60μmol/L）與對照組 （0μmol/L）相比，Notch1、NICD1、HES-1蛋白表達差異有統計學意義 （P＜0.0001＜0.01）；姜黃素處理HT29細胞24 h和48 h，相同濃度處理不同時間，Notch1蛋白表達差異無統計學意義（P=0.296 0＞0.01），而NICD1和HES-1蛋白表達有差異（P＜0.000 1＜0.01），見圖5；姜黃素處理SW480細胞HT29細胞24 h和48 h，相同濃度處理不同時間，Notch1、NICD1、HES-1 3種蛋白表達均有意義（P＜0.000 1＜0.01），見圖6；相同濃度姜黃素處理結腸腺癌HT29與SW480相同時間，蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖3 結腸腺癌HT29細胞經姜黃素處理24 h（A）和48 h（B）蛋白表達

圖4 結腸腺癌SW480細胞經姜黃素處理24 h（C）和48 h（D）蛋白表達

3 討論

結直腸癌是常見惡性腫瘤之一，其發生發展是由遺傳和生理改變多種因素作用共同而成，其主要分子機制尚未明確。Notch信號通路與腫瘤的相關性最先在1991年T細胞型急性淋巴細胞白血病中確定，認為Notch信號通路失調控誘發腫瘤，屬于致癌信號通路[9]。然而，隨著研究的深入，人們對Notch信號的認識逐漸加深，Notch信號通路在腫瘤組織中異?；钚跃哂袃擅嫘?，致癌作用或抑癌作用，這主要取決于組織或細胞類別的不同[10]，包括曾經認為Notch信號通路是致癌作用的T細胞型急性淋巴細胞白血病、慢性B淋巴細胞性白血病等，被證實其起抑癌作用[11]。Notch信號通路激活由臨近細胞配-受體結合后，Notch受體蛋白裂解，釋放胞內活性結構域 （Notch-ICD，NICD)，NICD由胞漿轉移至細胞核，與核內DNA結合轉錄因子RBP-J、MAML結合成RBP-J/NICD/MAML激活復合體，作為啟動子誘導靶基因轉錄，當NICD在核內大量磷酸化和泛素化后，其轉錄激活的功能停止，這意味著Notch信號終止[12]。Notch1信號通路是Notch信號通路之一，它能在結直腸腫瘤組織中高表達并在結直腸癌發展過程中起致癌作用，不僅如此，Notch1在組織中高表達與病人總生存期短以及病人預后差有關，因此Notch1基因表達可作為判斷預后和治療結直腸癌的潛力生物標記[13]。Hristova NR等[14]認為p27及skp2在Notch1信號通路中起重要作用，并且Notch1是結直腸腺癌治療靶點。

姜黃素是中藥姜黃中提取的活性成分，已有研究者對姜黃素進行了Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，結果示姜黃素結合其他化療藥物使用，能減輕化療藥物的毒副作用，減少化療藥物的使用劑量，提高患者的生存質量、延長生存時間；且姜黃素無明顯副作用，患者耐受性好，可作為結直腸癌長期預防治療方案[15]。

以往的研究表明Notch1蛋白能在結直腸癌組織中過度表達[16]，而NICD1的表達尚未報道，本實驗免疫組化結果示NICD1能在結直腸腺癌組織中表達，并且表達強度顯著高于癌旁組織，進一步證實了Notch1信號通路在結直腸腺癌中起致癌效應。

已有研究表明姜黃素能抑制結腸腺癌細胞HT29和SW480細胞大的增殖并促進其凋亡[17-18]，本實驗中應用不同濃度姜黃素處理以上2種細胞，使用免疫蛋白印跡方法檢測 Notch1信號通路中NICD1、Notch1及下游靶基因HES-1蛋白表達情況，結果示三種蛋白表達均降低，有時間和劑量依賴，同樣本研究前期工作檢測到姜黃素能降低與Notch1信號相關的skp2蛋白表達，增加p27蛋白表達[19]，因此，姜黃素通過下調Notch1信號通路相關蛋白表達可能是其抑制結直腸癌細胞增殖并促進凋亡的分子機制；從數據來看，姜黃素對結腸腺癌細胞SW 480細胞和HT29細胞中各蛋白的抑制程度有差異，考慮與細胞表達的Notch1信號強弱不等以及細胞對姜黃素的敏感性差異相關，這也是本課題進一步研究的方向。

圖5 結腸癌細胞HT29經姜黃素處理后HES1、NICD1、HES1蛋白表達相對值比較

圖6 結腸癌細胞SW480細胞經姜黃素處理后Notch1、NICD1、HES1蛋白表達相對值比較

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（本文編輯 楊 瑛）

Study of Curcum in on Down-regulating Notch1 Pathway in Colorectal Cancer Cells

YANG Fang,LIU Shaoqiong*,LI Chunhua,YIN Ling,LIU Ya,XIE Wanying
(The First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo test the expression of Notch1 intracellular domain(NICD1)in human colorectal cancer tissue and to investigate the mechanism of curcumin on the effect of the Notch1 pathway in the human colon cancer cells SW480 and HT29.MethodsThe expression of NICD1 in paraffin section from 40 cases of human colorectal cancer and 31 cases of adjacent tissues were detected by the immunohistochemical method.The relation of NICD1 with human colorectal cancer was determined by comparing the protein expression rate in intestinal mucosal cells of human colorectal cancer and tissues.The protein expressions of NICD,Notch1 and HES-1 in the colon cancer cells SW480 and HT29 which were treated by different concentrations of curcumin(0,7.5,15,30,60μmol/L)at 24 h and 48 h,were tested by western blot assay.ResultsThe expression rate of NICD1 in human colorectal cancer tissues was 100%,and the rate in adjacent tissues was 90.3%,the expression rate in colorectal cancer tissues was more significant than that in the adjacent tissues (P<0.05).The Weston blot result showed that curcumin could down-regulate the expressions of NICD1,Notch1 and HES-1 in SW480及HT29 cells with a time-dose independence.ConclusionOver-expression of NICD1 protein in colorectal tissues may be related with the development and progression of cancer.The position of positive expression could be associated with pathological stage of cancer tissues.Curcumin inhibiting proliferation of the colorectal cancer cells may relied on down-regulating Notch1 pathway.

curcumin;Notch1 pathway;NICD;colorectal cancer;SW480;HT29

R285.6；R735.3+7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.003

2014－10－12

湖南省自然科學基金項目（11JJ6083）。

楊 芳，女，在讀碩士研究生。

*劉少瓊，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail：liushaoqiong861224@163.com。