六味地黃湯水提醇溶部位對2型糖尿病大鼠胰島及腎臟組織形態結構的影響

戴 冰，吳沁璇，肖子曾*，周芳亮，曹璐婷，曾呈茜，范金茹，肖望重，歐陽林旗

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

六味地黃湯水提醇溶部位對2型糖尿病大鼠胰島及腎臟組織形態結構的影響

戴 冰1，吳沁璇2，肖子曾2*，周芳亮2，曹璐婷2，曾呈茜2，范金茹1，肖望重1，歐陽林旗1

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的研究六味地黃湯水提醇溶部位對2型糖尿病大鼠胰島及腎臟的影響。方法采用高糖、高脂飼料喂養4周后，再行腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）且空腹血糖(FBG)≥16．7 mmol/L的大鼠建立2型糖尿病動物模型，將其隨機分為空白組、模型組、羅格列酮組和六味地黃湯水提醇溶部位組，觀察給藥1個月后大鼠空腹血糖（FBG）和大鼠胰島、腎臟組織的形態結構。結果六味地黃湯水提醇溶部位能降低2型糖尿病大鼠FBG值（P<0.01），對其受損的胰島及腎臟有修復作用。結論六味地黃湯水提醇溶部位能夠修復2型糖尿病大鼠的胰島及腎臟，胰島及腎臟是具干預2型糖尿病作用的靶位之一。

六味地黃湯水提醇溶部位；2型糖尿??；胰島；腎臟

2型糖尿?。═2DM）是一種多基因遺傳因素、環境因素綜合作用引起的內分泌代謝性疾病，研究表明，六味地黃湯可以降血糖、血脂，減輕糖尿病大鼠胰島和腎臟的損傷[1]，改善胰島素抵抗[2]（insulin resistance，IR）。六味地黃湯水提醇溶部位為其方水煎液經70%乙醇醇沉處理得到[3]。本課題組前期研究發現該水提醇溶部位可降低T2DM大鼠血糖、胰島素含量，改善IR[4]。但其對2型糖尿病胰島及腎臟是否有修復作用，國內外尚無報道。因此本實驗將研究六味地黃湯水提醇溶部位對T2DM大鼠胰島及腎臟組織形態結構的影響，以進一步明確其作用的靶點。

1 材料

1.1 試驗藥物

六味地黃方（熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g，茯苓9 g），方中藥材由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供；羅格列酮鈉片，太極集團重慶涪陵制藥有限公司，批號：10090198。

1.2 動物

80只SD雄性大鼠，清潔級，體質量 （180～ 200）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號：SCXK（湘）2011-0003)，動物合格證號：4304700293，實驗動物房：湖南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室。

1.3 試劑

枸櫞酸、磷酸氫二鈉 （臺山市化工廠有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司）；多聚甲醛（天津市化學試劑研究所）；無水乙醇（分析純，天津市科密區化學試劑有限公司）。

1.4 儀器

穩豪倍易型（ONETOUCH UltraEasyTM）血糖儀及配套血糖試紙，強生（中國）醫療器材有限公司；JY3002型電子天平 （上海精密科學儀器有限公司）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡 （德國LEICA公司）；Shandon325型石蠟切片機（英國Shandon公司）；DNP-9162型電熱恒溫培養箱 （上海精宏實驗設備有限公司）；MoticB5顯微攝像系統 （麥克奧迪實業集團公司）。

2 方法

2.1 藥物制備[5]

稱取六味地黃方750 g，浸泡30 min，煎煮2次，30 min/次，合并兩次濾液并水浴濃縮，得最終濃度為1.915 g(生藥)/mL的濃縮液。取適量濃縮后的六味地黃湯，用無水乙醇調整至70%作醇沉處理，靜置24 h后真空抽濾，抽濾液經水浴濃縮，水提醇溶部位最終濃度為11.326 g（生藥）/mL。

2.2 高糖高脂飼料配方[6]

普通飼料70%、豬油10%、蔗糖15%、牛膽酸鈉0.5%、膽固醇2.5%、食鹽2%，由湖南中醫藥大學動物部制備。

2.3 2型糖尿病大鼠模型的建立

大鼠適應性喂養1 w，隨機分為正常組(6只)和造模組（74只），分別給予普通飼料和高糖高脂飼料喂養4 w后，所有動物禁食不禁水12 h，造模組大鼠腹腔注射STZ 45 mg/（kg·d），正常組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液，STZ注射72 h（提前10 h禁食不禁水）后，斷尾取血檢測各組大鼠空腹血糖，FBG≥16.7 mmol/L者視為造模成功[6]。

2.4 分組給藥

T2DM造模組大鼠隨機分為模型組13只、羅格列酮組14只0.81 mg/（kg·d）、六味地黃湯水提醇溶部位組14只6.75 g生藥/（kg·d），正常組大鼠為空白組大鼠，連續灌胃給藥30 d，實驗大鼠存活28只?？瞻缀湍Ｐ徒M灌服等體積蒸餾水，給藥劑量按照60 kg成人與200 g大鼠體表面積折算。

2.5 指標檢測

2.5.1 2型糖尿病大鼠模型不同時間的FBG檢測 分別于給藥10、20、30 d后取空白組與模型組大鼠禁食10 h，斷尾取血檢測其FBG。

2.5.2 各組大鼠造模后給藥30 d的體質量檢測分別于給藥10、20、30 d后取各組大鼠，檢測其體質量。

2.5.3 給藥30 d后大鼠FBG檢測 給藥30 d后，分別取各組存活大鼠禁食10 h，斷尾取血檢測FBG。

2.5.4 HE染色觀察各組大鼠胰島及腎臟組織形態結構的病理改變 上述檢測完成后，各組大鼠再按0.35 g/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉，解剖，迅速剪取大鼠胰腺、腎臟組織，4%多聚甲醛固定。上述采集的大鼠胰腺及肝臟組織常規脫水、透明、石蠟包埋、切片、烘烤、脫蠟、復水、HE染色及封片，顯微鏡下觀察其形態及其組織結構，確定胰島的位置，比較相同視野下大鼠胰島及胰島β細胞的變化。

2.6 統計學分析

3 結果

3.1 2型糖尿病大鼠模型30 d的FBG變化

模型組與空白組比較，模型組大鼠第10、20、30天的FBG均明顯高于空白組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），提示該模型的血糖穩定性良好。如圖1所示。

3.2 各組大鼠造模后給藥30 d的體質量變化

模型組大鼠與空白組比較，模型組大鼠第10、20、30天的體質量均明顯低于空白對照組，差異有顯著性統計學意義（P＜0.01），體質量呈下降趨勢，提示T2DM大鼠體瘦虛弱。六味地黃湯的提醇溶部位及羅格列酮組能改善模型組大鼠體質量，但與其比較差異無顯著統計學意義（P＞0.05），提示六味地黃湯水提醇溶部位及羅格列酮改善T2DM大鼠體質量效果不明顯。如圖2所示。

圖1 2型糖尿病模型大鼠30 d的FBG變化(±s)

圖2 各組大鼠給藥30 d體質量的變化(±s)

3.3 六味地黃湯水提醇溶部位對2型糖尿病大鼠FBG的影響

給藥1個月后，模型組大鼠與空白組比較，FBG≥16.7 mmol/L，差異有顯著統計學意義 （P＜0.01），提示模型組模型穩定；六味地黃湯水提醇溶部位組與模型組比較，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），提示六味地黃湯水提醇溶部位可以降低2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的空腹血糖；羅格列酮組與模型組比較，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），提示對照藥物能夠改善2型糖尿病大鼠血糖；六味地黃湯水提醇溶部位組與羅格列酮組無顯著性差異，提示六味地黃湯水提醇溶部位降血糖作用與對照藥物相當。如表1所示。

3.4 六味地黃湯水提醇溶部位對2型糖尿病大鼠胰島組織形態結構的影響

空白組大鼠胰島形態結構完整、規則，輪廓界限清楚；組織切片可見胰島細胞排列整齊，胞漿飽滿，其中的胰島β細胞核呈規則卵圓形，核仁清晰，染色均勻。模型組大鼠胰島形態結構紊亂，形狀不規則，萎縮嚴重；胰島細胞空泡變性，排列紊亂，細胞胞漿缺失、塌陷嚴重，胰島β細胞細胞核形狀不規則，核周間隙擴張，數目減少，出現凋亡早期狀態。六味地黃湯水提醇溶部位組可改善胰島結構及其細胞紊亂的受損情況，使其形狀相對清晰可見，無明顯萎縮，β細胞數量增多、細胞胞漿豐富。提示2型糖尿病大鼠胰島組織形態結構受損，六味地黃湯水提醇溶部位可改善模型大鼠受損的胰島，其藥效與羅格列酮作用相似。如封三彩圖圖3所示。

表1 給藥后各組大鼠FBG值比較 （±s）

表1 給藥后各組大鼠FBG值比較 （±s）

注：與空白組比較**P＜0.01；與模型組比較##P<0.01。

組別空白組模型組羅格列酮組六味地黃湯水提醇溶部位組n 6 8 8 6劑量g/（kg·d)——8.1×10-46.75給藥30 d后FBG (mmol/L) 5.77±0.15 22.00±0.98** 11.98±0.79**##10.33±1.25**##

3.5 六味地黃湯水提醇溶部位對2型糖尿病大鼠腎臟組織形態結構的影響

空白組大鼠腎臟形態結構清晰、規則；組織切片可見皮質腎小球、腎小管排列規則，腎小球、腎小囊體積、囊腔腔隙正常，腎小管上皮細胞結構正常；模型組大鼠形態結構模糊，形狀不規則；腎小球體積增大，球囊腔窄小，毛細血管球基膜增厚；腎小管擴張且部分管腔內蛋白管型，出現早期的腎功能衰退；其上皮細胞肥大且部分片狀壞死伴間質炎癥細胞浸潤。六味地黃湯水提醇溶部位組能改善腎臟結構模糊，形狀不規則的狀況，使其腎小球體積縮小，囊腔腔隙增大，腎小管上皮細胞結構正常，其水腫、壞死及間質炎癥細胞浸潤程度減輕，管腔內蛋白管型減少，提示2型糖尿病大鼠腎臟組織形態結構受損，六味地黃湯水提醇溶部位可改善模型大鼠受損腎臟的組織形態結構，其藥效與羅格列酮作用相當。如封三彩圖圖4所示。

4 討論

2型糖尿病約占糖尿病患者總數的85%～90%，其發生、發展的過程中，胰島的形態及其組織結構都會出現相應的受損情況,這將會導致胰島功能障礙，如胰島萎縮、空泡變性，胰島β細胞數目減少等[7]。同時該病早期會發生腎小球肥大、腎小管內皮細胞肥大和基底膜增厚等病理性損傷[8]，而其占2型糖尿病腎病發病率的10%～20%，糖尿病患者死于腎衰竭的就有5%～10%[9]，因此，保護胰島及腎臟對于治療2型糖尿病有著重要的意義。

目前用于2型糖尿病研究的動物模型，多采用高脂喂養加小劑量STZ或四氧嘧啶的方法建立2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，且STZ采用尾靜脈注射或腹腔注射，預實驗中發現參照大部分文獻腹腔注射30[10]、35[11]mg／kg STZ誘導的2型糖尿病大鼠成模率較低，穩定性較差，成模大鼠血糖在一定時間內下降，故本實驗參照預實驗結果給予大鼠腹腔注射STZ 45 mg／kg的劑量，模型組大鼠成模后血糖(20.39±2.75)mmol／L，繼續高脂喂養一個月后血糖(22.00±2.76)mmol／L，模型穩定。同時實驗中發現大鼠死亡率較高，這可能與成模后分籠喂養時 （4只/籠）大鼠間打斗、拒食高脂飼料，以及藥物對模型大鼠體質量的改善不明顯，導致大鼠體瘦虛弱有關。

本研究還發現六味地黃湯水提醇溶部位能明顯降低2型糖尿病大鼠血糖，并使其胰島的空泡變性、萎縮和胰島β細胞數目減少以及腎小球肥大、腎小管上皮細胞肥大、基底膜增厚等一系列損傷明顯減輕。表明六味地黃湯水提醇溶部位能夠改善2型糖尿病大鼠受損胰島及腎臟的組織形態結構，對胰島及腎臟起到一定的修復作用。然該水提醇溶部位的修復作用機制及其藥效成分有待進一步研究。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Liuwei Dihuang Decoction Alcohol Precipitation Extract on Pancreas and K idney of Type 2 Diabetic Rats

DAI Bing1,WU Qinxuan2,XIAO Zizeng2*,ZHOU Fangliang2,CAO Luting2,ZENG Chengxi2,FAN Jinru1,XIAO Wangzhong1, OUYANG Linqi1
（1.The first Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo study the effects of Liuwei Dihuang decoction alcohol precipitation extract on pancreas and kidney of type 2 diabetic rats.MethodsAfter feeding high sugar and fat diet for four weeks,the rats were intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)with FBG≥16.7 mmol/L to establish type 2 diabetic models.All rats adaptive feeding one week,then randomly divided into control group and model group.Then the model rats were random ly divided into blank group,model group,rosiglitazone group and Liuwei Dihuang group.The fasting blood glucose(FBG),and morphological structure of the pancreas islet and kidney in rats with given medicine for one month,were observed.ResultsLiuweidihuang Decoction alcohol precipitation extract could decrease the level of FBG (P<0.01)，and showed repair effects on damaged pancreas islet and kidney.ConclusionLiuweidihuang Decoction alcohol precipitation extract can repair the pathology damage of pancreas islet and kidney in type 2 diabetic rats，pancreas islet and kidney were one of the targets of its intervention.

Liuwei Dihuang decoction alcohol precipitation extraction;type 2 diabetes mellitus;pancreas islet;Kidney

R285.5；R587.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.006

2014－10－29

湖南省自然科學基金項目（13JJ3096）；湖南省科學技術廳科技計劃一般項目（2010FJ4091）；湖南省高校創新平臺開放基金項目（11K046）；湖南省中醫藥管理局項目（201460）；長沙市科技局項目（K1106040-31）。

戴 冰，女，主任藥師，教授，主要從事中藥藥理學及藥效物質基礎研究。

*肖子曾，男，教授，E-mail：xiaozz573@126.com。