常用類風濕關節炎動物模型研究概況及展望

李艷玲，祁 芳，許 明，艾 坤，楊茜蕓*，劉 梨，張 泓

（1湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

常用類風濕關節炎動物模型研究概況及展望

李艷玲1，祁 芳1，許 明1，艾 坤1，楊茜蕓1*，劉 梨2，張 泓1

（1湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

在類風濕關節炎（RA）的基礎研究領域，構建和應用合適的動物模型是研究該疾病發病機制及治療的基礎，構建復制接近人RA疾病特征的動物模型尤為重要。近年來建立了不少RA動物模型，主要有單純疾病動物模型和病證結合動物模型，但均存在各自的優勢和劣勢，本文對近幾年常用的幾種RA動物模型進行研究，從制備方法、模型特點、發病機制、使用情況等方面對比其優缺點，以期為今后研究更接近人RA疾病特征的動物實驗模型提供參考。

類風濕關節炎；動物模型；優劣勢

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因病機尚未完全清楚的慢性、炎性、多系統性自身免疫性疾病。其臨床特點為對稱性，多個關節慢性炎性持續反復發作，主要病理變化包括滑膜組織增生、血管翳形成及韌帶、骨和軟骨的結構性損傷，最終引起整個關節僵硬導致功能喪失[1]。RA是常見的高致殘率疑難雜病之一，我國RA的患病率為0.32%～0.36%，女性患者約3倍于男性[2]。RA是全世界研究的熱點之一，作為科學的科研實驗設計，建立有效的動物模型是其關鍵[3]，許多專家學者在RA動物實驗研究的過程中已建立多種動物模型，但都有各自的優缺點。本文現從近5年常用的幾種RA動物模型的造模方法、特點、發病機制、使用情況等方面進行研究，對比其優缺點，以期為今后探索更接近人RA疾病特征的動物模型提供參考。

1 單純疾病動物模型

1.1 膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis， CIA)動物模型

CIA模型是Trentham等1977年最先創建的實驗性關節炎模型，并且發現約50%的RA患者血液中存在抗Ⅱ型膠原的自身抗體，提示Ⅱ型膠原可能誘導RA的產生，此后國內外眾多學者采用該模型針對RA的病因機制、藥物篩選及治療等方面進行了大量研究。目前已建立大鼠、小鼠CIA模型。

1.1.1 大鼠CIA模型 制備方法：將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的冰醋酸中，制成2 g/L濃度，然后與完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑二者等體積混合制成乳化劑，使終質量濃度為1 g/L。將乳化后的液體滴在水中后不擴散且成形，視為乳化完全。于大鼠背部與尾根部多點皮內注射膠原乳化劑皮內注射0.2 mL（含200μgⅡ型膠原）乳劑，7 d后加強免疫相等劑量乳劑1次，建立CIA模型[4-5]。

模型特點：初次致敏后，因炎癥作用，尾根注射部形成小潰瘍灶，可在1周內自行結痂愈合。隨后大鼠前后足可出現不同程度的紅斑，再次加強免疫后關節紅腫進一步加重，21 d左右足爪腫脹達高峰，后期大鼠表現為難以負重、活動受限，部分大鼠出現足趾變形，并隨著關節炎的發生發病大鼠毛色開始失去光澤，伴輕微脫毛，體質量增長緩慢，活動減少[6-8]。

發病機制：CIA的產生和發展依賴于自身T細胞和B細胞的激活，去除B細胞或T細胞，動物都不能用Ⅱ型膠原免疫誘發關節炎病變[9]。研究表明，在CⅡ（CIA小鼠膠原）免疫的動物中，T細胞可被自身和異種CⅡ特異性免疫反應激活，從而介導遲發性超敏反應，繼而激活B細胞，分泌炎性細胞因子。膠原抗體可形成的免疫復合物與補體相互作用，啟動炎癥反應。CD4+T細胞是CIA的主要調節因素，分泌細胞因子白介素17（IL-17），產生中性粒細胞及其他促炎因子，與CIA產生關系密切[10]。另外有研究表明，促炎介質腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-1β在誘導CIA大鼠中起重要作用，并隨著CIA大鼠病程進展血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平持續升高[11-12]。

1.1.2 小鼠CIA模型 制備方法：將CⅡ 4 mg/mL溶于0.05 mol/L冰醋酸中，與完全弗氏佐劑CFA等體積完全混合乳化，使終質量濃度為1 g/L，小鼠尾根部皮內注射50μL混合溶液，首次免疫后3周行第2次免疫，方法同第1次(佐劑換為弗氏不完全佐劑)，于小鼠尾根部皮下注射50μL混合溶液，進行加強免疫[13-14]。

模型特點：開始出現關節腫脹是在致敏后第29～32天，兩后足最先受累，進而逐漸累及前足和尾部，第36～45天足腫脹達最高峰，然后逐漸減輕。小鼠毛色、精神狀態、糞便和體質量等在21 d前無顯著變化，21 d后小鼠毛色開始失去光澤，輕微脫毛，體質量增長減慢甚至減輕，部分小鼠足趾關節、尾部出現化膿潰爛，但鼻、耳腫脹不明顯[15-17]。

發病機制：CIA小鼠病理進程中，B淋巴細胞和作為軟骨組成成分的Ⅱ型膠原是CIA發生的關鍵，說明CIA是免疫性炎癥。T淋巴細胞促進膠原特異性B淋巴細胞活化，誘導免疫的發生[18-19]，特異性膠原抗體與膠原蛋白結合，在關節部位形成復合物，激活補體。另外粒細胞、T淋巴細胞和單核細胞募集到關節部位，導致免疫反應進一步激發，產生大量細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-32介導免疫介質，破壞骨和軟骨[20-22]。

1.2 佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）動物模型

AA模型又稱弗氏佐劑關節炎，是由細菌學家Freund創立，是RA動物模型創建的基本方法。

造模方法：將熱滅活的結核分枝桿菌與礦物油研磨混勻，根據實驗需要配制成所需濃度，一次性經尾根部皮下注射或足跖皮下注射CFA 0.1 mL致炎如果腫脹不明顯，可考慮加強免疫1次[23-24］。

模型特點：于致炎后9～12 d左右開始出現足趾關節出現不同程度的紅腫，21 d左右達到高峰，表現為前后足腫脹，且進行性加重，行動不便，足趾皮膚發紅發亮，炎癥高峰期持續3～5 d，隨后有自愈傾向，發病過程中部分大鼠趾關節有化膿潰爛情況，耳和尾部出現“關節炎”小結，體溫身高，進食減少，體質量下降[25-26]。

發病機制：AA的發病原理主要是分子模擬理論。BCG來源的結核分枝桿菌熱休克蛋白65（HSP65），與關節滑膜上自身抗原HSP60結構相似，有高度相似的保守序列，同一株T細胞克隆可識別兩者。從而在結核分枝桿菌不斷刺激下，引起機體自身的免疫反應[27-28]。

1.3 CIA與AA動物模型的使用情況

通過對CNKI數據庫的查詢，近五年使用CIA造模約521篇，逐年有增長趨勢，但幅度不大；而AA近五年有534篇，每年使用情況相差不大。見表1。

表1 近5年CIA與AA動物模型使用文獻統計（篇）

同時，還有許多其他單純型RA動物模型，如軟骨低聚體基質蛋白、卵蛋白、佐劑角叉菜膠誘導的關節炎等。但是這些模型一般用于特定的研究，因此每年使用情況不多，與CIA、AA比較差距很大?？梢钥闯鯟IA與AA目前仍然是最重要且發展較成熟的兩種RA動物模型復制方法。

1.4 CIA與AA的優缺點

1.4.1 CIA的優缺點 CIA的關節炎發病率比AA高，且CIA模型臨床癥狀、病理學更接近人RA[29]。不僅具有R A的急性病變外，還有一定的慢性病變特征，且操作方便簡單，是目前國際上公認的RA相關研究的最佳動物模型[30]。然而它也有自身限制，不能描述病情的加重與緩解。目前大小鼠CIA模型制作沒有一個規范統一的標準，如免疫劑量、免疫部位，是否加強免疫，何時加強免疫等都沒有統一規定，大多都是根據實驗的需要選擇。另外，國外進口CⅡ價格昂貴，而國內尚無批量生產。這些都說明CIA模型的局限性。

1.4.2 AA的優缺點 此方法建立較早，簡單易行、耗費少，其病理表現也類似于人RA，是目前最經典應用最廣泛的RA模型復制方法。但該模型發病快、病程單一，缺乏慢性病理過程且在免疫學特征及病理生理學方面與人類RA存在一定的差異，病變具有一定自限性。另外，AA存在發病程度不均勻、模型復制率偏低等問題，影響實驗的進程。

2 病證結合動物模型

在中醫藥研究領域，近年來，根據RA臨床特征，許多學者在CIA、AA基礎上，結合西醫的病和中醫的證，創建了病證結合的RA模型。目前，常見的有風寒濕痹癥模型、風濕熱痹癥模型和腎虛痹癥模型。

2.1 AA、CIA模型基礎上的風寒濕刺激模型

姜輝等[31]在SD大鼠右后足趾皮內注射CFA 0.1 mL，并在造模當天，將大鼠置于深為2 cm，溫度為5～7℃的冷水中，同時伴以4級風力，每天1次，每次20 min，連續14 d。鎮蘭芳等[32]從大鼠首次注射CⅡ開始，每天在人工氣候箱內[溫度：（6±2）℃，相對濕度：（90±4）%，風力3級]，接受風寒濕刺激1次，每次持續刺激4 h，連續30 d。

模型特點：本模型的制備，是在CIA、AA制備的基礎上，通過中醫風寒濕的外因刺激而建立。體現了中醫風寒濕痹證的發病病因及病理特點。但是目前在外界氣候環境、刺激時間及頻率等條件上尚無統一規范的標準。

發病機制：風、寒、濕可加重局部炎癥浸潤的程度，它們能嚴重影響ESR、IL-17、CD44、AHR、Fas、FasL等的表達，并能加重滑膜細胞的增生。提示中醫痹證病因學說包含氣候條件和感染因素等。

2.2 AA、CIA模型基礎上的風濕熱刺激模型

高慧琴等[33]以Wistar大鼠為對象建立AA模型，并將大鼠置于深為2 cm，溫度36～38℃熱水中，同時在37℃水浴恒溫熱蒸汽條件下熏蒸，伴以3檔風力，每天1次，每次20 min，連續14 d。上述鎮蘭芳等[32]在接受首次CIA免疫的當天開始，每天在人工氣候箱內 [相對濕度：（90±4）%，溫度：（33± 2）℃，風力3級]接受風濕熱刺激1次，且持續刺激4 h，連續30 d。

模型特點：本模型在AA或CIA的基礎上，采用中醫風濕熱的外因刺激誘導模型，比單純AA或CIA模型有炎癥周期長、模型穩定的特點，但單純的風濕熱外界刺激因素結合CIA、AA建立的模型，不能完全體現臨床風濕熱痹癥多為風寒濕證日久轉化而來的特點。

發病機制：持續高溫一方面可使血管擴張、血管滲透性增大，導致膠體滲出增多；另一方面引起機體應激反應，致使免疫系統的變化。另外有研究表明，風熱濕等外邪能加重CD44的表達，提示CD44可能參與了CIA的發生[32]。

2.3 腎虛痹證模型

根據臨床中醫認為腎虛為RA發生的根本原因；同時結合現代醫學認為男性雄激素下降而雌激素升高，女性雌激素減少或者卵巢功能低下皆為腎虛的表現建立腎虛CIA模型。方法1[34-35]：摘除大鼠雙側卵巢或睪丸及其附近的脂肪組織，28 d后于尾根部皮下注射200μg經不完全弗氏佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原，此后第7天再次尾根部同法注射100μg CⅡ作為加強免疫；方法2：予羥基脲375 mg/(kg·d)連續灌胃17 d后，依上述方法建立CIA模型，最終復制成腎虛CIA模型。

模型特點：此模型是在中醫痹證發病的內因學說基礎上建立，與單純的CIA模型相比，關節腫脹程度高，滑膜組織炎癥加重，軟骨損傷及骨的破壞均更為嚴重。此模型血清雌二醇水平下調，而血清Ca和TNF-α的含量則顯著增加。

發病機制：腎虛使類風濕性關節炎發病率提高，不同的腎虛模型主要通過免疫系統 (包括體液和細胞免疫)、內分泌系統(如性腺激素、腎上腺素)、骨代謝(如血清Ca等)來共同影響RA的病理變化。2.4 病證結合動物模型的使用情況

通過對CNKI數據庫的查詢，在中醫藥研究領域，近五年風濕熱、風寒濕、腎虛痹癥動物模型使用情況逐年增加，另外，還有一些其他病癥結合RA動物模型，如脾虛痹證模型、氣虛血瘀模型等，但是這些模型一般根據實驗研究需要采用，因此每年使用情況不多。在中醫藥科研工作中，病癥結合模型是關鍵，是廣大科研工作者值得深思和探索的問題之一。

3 問題與展望

單純疾病RA動物模型，特別是AA與CIA模型建立比較早，發展比較成熟，在臨床表現、實驗室指標和病理機制上，可通過具體數據、檢測指標、切片等體現，且在臨床表現、病理、免疫上與人RA在有著相似或相近的特點，客觀性較強，是最常用的經典模型，也是RA實驗研究的重要手段，但依然不能完全反應所有人RA的所有臨床特點，且其模型制備方法和條件缺乏相對統一規范的標準，存在一些缺陷。另外，在中醫藥研究領域，這種模型復制方法無明顯的臨床病因學基礎，完全偏離了傳統的臨床辨證方式，未能反映出中醫辨證論治的特色。所以，探索一種經濟方便、科學全面，與人RA特點更接近的動物模型仍是今后自身免疫性關節炎模型研究的方向所在。

病證結合動物模型，是在單純疾病動物模型過程中融入中醫病因因素，建立所需的模型，運用了中醫病因學說，也符合現代醫學RA病理特點，體現了中醫辨證論治的特色，但此類模型存在的問題是，西醫的“病”與中醫“病”是兩個截然不同的概念。另外，人為施加的干預因素可能改變原有的動物模型，此類模型的穩定性、可靠性值得質疑。目前病因造模缺乏明確的判定標準，都是在多種干預因素之間沒有邏輯關系的情況下，強行疊加到一起，即“病+證”的“1+1”的模式，不滿足辨證論治是中醫對疾病的診斷和分類的這一基本原則，偏離了客觀性、科學性。為了獲得更好的能模擬臨床RA病人的病證結合動物模型，需要充分考慮中醫病因學說，注重中醫臨床癥狀學和辨證論治，還需動態評價證候屬性，來探尋一種具有中醫臨床辨證特點的RA病證結合實驗動物模型。

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（本文編輯 匡靜之）

General Situation and Prospect of the Commonly Used Rheumatoid Arthritis Animal M odels

LI Yanling1,QI Fang1,XU Ming1,AI Kun1,YANG Qianyun1*,LIU Li2,ZHANG Hong1
（1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

In the field of rheumatoid arthritis(RA)research，establishing and applying appropriate animal models are the study foundation of the pathogenesis and treatment for this disease.Moreover,constructing an RA animal model that similar to the human disease characteristics is particularly important.In recent years,numerous RA animal models including single disease models and integrated disease and syndrome models were built,all of them show advantages and disadvantages. This paper reviews these RA animal models on its advantages and disadvantages with the preparation methods,model features, pathogenesis and applying,and provides a reference for future exploration of RA animal model with more similar to human disease characteristics.

rheumatoid arthritis;animal models;advantages and disadvantages

R684.3；R24

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.020

2014－11－14

國家自然科學青年基金(81303048)；湖南省科技廳科技計劃一般項目(2014SK3046)；湖南省教育廳科學研究項目(14C0854)。

李艷玲，女，在讀碩士研究生，研究方向：經脈與臟腑相關規律及機制研究。

*楊茜蕓，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail：5787162@qq.com。