調控魚類性腺分化基因的研究進展

鄭 堯王在照陳家長

(1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部長江下游漁業資源環境科學觀測實驗站, 中國水產科學研究院內陸漁業生態環境和資源重點開放實驗室, 無錫 214081; 2. 西北農林科技大學動物科技學院, 陜西省農業分子生物學重點實驗室,楊凌 712100)

調控魚類性腺分化基因的研究進展

鄭 堯1王在照2陳家長1

(1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心, 農業部長江下游漁業資源環境科學觀測實驗站, 中國水產科學研究院內陸漁業生態環境和資源重點開放實驗室, 無錫 214081; 2. 西北農林科技大學動物科技學院, 陜西省農業分子生物學重點實驗室,楊凌 712100)

魚類種類繁多, 其性別決定機制也幾乎涵蓋了所有的動物類型。近幾年來, 隨著分子生物學技術的不斷更新, 關于魚類性別決定機制的研究, 尤其是對調控性腺分化基因的克隆、表達及功能驗證取得了突破性進展。文章從性腺分化、核受體家族、類固醇合成酶類和卵母細胞結構基因 4個方面綜述了調控魚類性腺分化基因的研究進展。

性腺分化; 核受體; 類固醇合成; 性別決定機制; 基因

雌雄異體魚類的性別決定類型主要分為遺傳決定型(Genetic Sex Determination, GSD)和環境決定型(Environment Sex Determination, ESD), 后者以溫度決定型(Temperature Sex Determination, TSD)的研究居多。不同于存在Sry的哺乳動物, 溫度依賴型的爬行類以及存在性別決定 Dmrt1基因的鳥類, 魚類不僅是物種分布度最廣的低等脊椎動物(包含32900種,其中中國有 3862種), 且其性別決定機制也幾乎涵蓋了所有的動物類型[1]。某些魚類具有性染色體或者雌雄特異性的性別決定基因, 也有一些魚類是通過常染色體控制的。水溫、pH、光照、養殖密度、溶氧、鹽度、食物豐度、群體信號和環境內分泌干擾物等都可以在不同程度上影響魚類性別[1]。但也有一些魚類, 如銀鯽Carassius auratus gibelio存在雌核發育和兩性生殖雙重生殖方式[2], 不但增加了性別決定機制研究的復雜性, 也進一步驗證了低等魚類性別決定和性別分化的可塑性。不管怎樣, 外界因素對性腺分化的影響最終可能是通過影響性腺分化相關基因的表達來實現的[3]。

關于魚類性別決定與分化分子機制的研究主要借鑒哺乳動物展開, 研究的主要目的是找尋魚類中雌雄特異基因, 偏好性基因或者為維持內源性激素平衡而調控芳香化酶cyp19a的轉錄因子。目前發現的性別決定基因有青 鳉Oryzias latipes dmrt1bY[4]及Gsdfr[5]、sox3、銀漢魚Odontesthes hatcheri Amhy[6]、河豚Takifugu rubipes amhr2[7]和虹鱒Oncorhynchus mykiss sdY[8]等。目前大多數研究是通過同源克隆方法獲得魚類基因組中的性別決定與分化相關基因,隨后進行功能研究和驗證, 但對起關鍵作用的基因或者染色體區域還不是很清楚。本文從性腺分化、核受體家族、類固醇合成酶類和卵母細胞結構基因四大類對調控魚類性腺分化基因的研究進展進行綜述, 為水產學科魚類的性腺分化機制研究提供基礎性資料。

1 性腺分化基因

1.1 DM結構域轉錄因子1 dmrt1

dmrt1(Doublesex and mab-3-related transcription factor, number 1) 果蠅Drosophila melanogaster的doublesex基因和線蟲的mab3基因編碼一種轉錄因子, 該轉錄因子含有一個保守鋅指樣結構的 DNA結合結構域, 稱之為 DM 結構域(DNA-binding domian)。魚類中含有 6個 dmrt家族成員: dmrt1-dmrt5和dmrt2b, 其中dmrt1基因在性別控制、性別分化調節和雄性不育等方面有重要作用, 其拷貝dmrt1bY 是青鳉 兩個屬(Oryzias latipes和O. curvinotus)的性別決定基因[4]。 青 鳉dmrt1bY基因是一個進化上年輕的雄性性別決定基因, 依靠常染色體上dmrt1基因復制、轉移到Y染色體上而形成, 在魚類中不存在普遍性, 而在其他一些近緣物種中只存在不具備雄性決定的dmrt1bY假基因。dmrt1bY基因能誘導遺傳雌性個體(XX)性 反轉為雄性。野生青 鳉種群中約存在 1%性反轉個體(XY雌性), 證實它們中一部分是由攜帶突變的 dmrt1bY基因引起, 另一部分是由于dmrt1bY的低水平表達所致。最近有人證實青 鳉與其近緣種淺紅青 鳉(O. dancena)的性染色體是各自獨立起源的。

目前雄性羅非魚Oreochromis aureus dmo (dmrt1的一個拷貝)、鯽Carassius auratus精巢dmrt3[9]及牙鲆Paralichthys olivaceus dmrt4精巢表達量遠高于卵巢, 以及 dmrt4在雌性奧尼羅非魚 Oreochromis aureus中特異存在[10]。而在斑馬魚 Danio rerio中,已確認有 5個 dmrt基因家族成員的存在, 且有 13個不同亞型在稀有鯽Gobiocypris rarus中被克隆到, 在黃鱔Monopterus albus中發現8個dmrt基因,在刺鰍Mastacembelus aculeatus中發現6個dmrt基因, 在大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus中發現3 個dmrt基因, 在紅鰭東方 鲀Fugu rubripes中發現3個dmrt基因。本課題組在彭澤鯽Carassius auratus var. pengze中發現dmrt1基因的3種不同亞型[11]。這些結果不僅表明 dmrt1在很多魚類中呈現雄性偏好性表達, 即在性腺分化時專一性地在精巢中表達[12],而在卵巢中沒有表達, 同時也從側面說明dmrt家族在魚類中確實存在諸多拷貝?；蚯贸龑嶒炞C實dmrt1對小鼠Mus musculus睪丸分化是必須的, 但對于卵巢的發育不是必須的。也有學者發現 dmrt1在斑馬魚精巢和卵巢發育過程中都有表達, 這可能意味著 dmrt1不只與精巢發育相關, 還與卵巢發育有關, 后在大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus中得到證實。一方面 dmrt1呈現偏好型表達, 另一方面, 利用雄激素誘導 XX尼羅羅非魚幼魚發生性逆轉, 在其性腺中也能檢測到dmrt1的表達, 且雌激素能抑制其表達。已經在黑鯛Sparus macrocephlus[13]、黃鱔、銀漢魚、尼羅羅非魚[14]、石斑魚 Epinephelus coioides、細棘海豬魚Halichoeres bleekeri、鲇Silurus meridionalis、 青 鳉[15]、劍尾魚Xiphophorus helleri、銀鯽[16]和 紅鰭東方 鲀Takifugu rubripes等魚類中開展了 dmrt1基因的克隆和鑒定工作。這些結果都表明 dmrt1對魚類性別決定和精巢的功能維持都起著重要作用, 而其他部分成員對已分化性腺的正常發育和功能維持可能也具有重要作用。

1.2 抗繆勒氏管激素amh

抗繆勒氏管激素(amh, Anti-Müllerian Hormone)是轉化生長因子TGF-β超家族的一員, 不僅在雄性胚胎形成時期起始繆勒氏管的退化, 而且還能夠阻止雌性生殖器官的發生, 且在雄性性別分化中起到重要作用。amh專一性地在性腺中表達, amh主要通過Amh/AmhⅡ通路在性腺分化和發育中發揮作用。2002年Miura等從日本鰻鱺Anguilla japonica中分離出一種精子發生相關物質21(eSR21), 它具有抑制精子形成的作用并被歸類為amh的同源基因。到目前為止, amh的同源基因已在很多魚類中被克隆到,例如日本鰻鱺、牙鲆、虹鱒、斑馬魚、青 鳉、歐鱸Dicentrarchus labrax、羅非魚[17], 和彭澤鯽[18]等, 不僅呈現出保守的表達模式, 且在它們的性別決定調控中具有重要作用。Amh之所以吸引研究者興趣就在于, 只有某些古老的魚類如鱘Acipenser gueldenstaedti才存在繆勒氏管結構, 近代硬骨魚類中不存在此結構。目前關于amh基因及在AmhR-II信號通路中的功能在魚類中的研究還較少, 需要進一步的研究。

1.3 叉頭框樣蛋白2 foxl2

叉頭框樣蛋白2 (foxl2, Forkhead transcriptional factor 2)是Forkhead/HNF-3相關轉錄因子家族中的一員, 它參與卵巢分化過程和許多包括細胞分化在內的發育過程。Foxl2通過它的叉頭結構與Ad4BP/SF1的配體結合區域相結合成為異源二聚體,強化和促進 cyp19a1a的轉錄表達[19]。foxl2功能缺失雌性小鼠表現不育, 導致生成睪丸小管和精原細胞的形成, foxl2抑制那些可以啟動sox9表達的調控元件來抑制精巢分化及性反轉。foxl2是顆粒細胞分化和卵巢的維持所必須的, 目前已在虹鱒、尼羅羅非魚、青 鳉、斑馬魚、歐洲鰉 Scaphirhynchus platorynchus、三斑海豬魚Halichoeres trimaculatus[20]、南方鲇Clarias gariepinus[21]、稀有鯽Gobiocypris rarus[22]、黑鯛Acanthopagrus schlegeli[23]、朝鮮石頭魚 Sebastes schlegeli[24]、裸蓋魚 Anoplopoma fimbria[25]、大西洋鮭[26]、暗色頜須Gnathopogon caerulescens[27]和黃鱔Monopterus albus[28]等魚類中開展了基因克隆和鑒定工作, 在各自性腺中的表達量要高于其他組織中的表達量, 且有卵巢中的表達量高于精巢的趨勢。如foxl2基因在南方鲇不僅呈現出性別二態性的表達方式(卵巢遠高于精巢)[29], 還可通過雌性特有方式調控 cyp19a的表達[19]。因此, foxl2已被證明是雌性發育過程中的一個關鍵因子,是目前發現的脊椎動物卵巢決定和分化的一個標志性啟動基因[29]。

1.4 sox基因家族

sox基因家族 (SRY-related HMG box)含有一個SRY樣的HMG盒結構(High mobility group box), 其結構高度保守[30]。目前 sox基因家族已經廣泛地在哺乳類、鳥類、爬行類、昆蟲及魚類中被克隆得到,在雌雄性別個體的基因組中都存在。該基因家族的很多成員被鑒定為轉錄因子, 其表達又具有組織特異性, 且能在不同發育過程均能表達。sox4、sox5、sox6和 sox9基因在雄性中的表達與精子發生相關,其中sox9最為重要。已有研究表明sox9主要在性腺分化時期精巢中表達, 對哺乳動物的睪丸分化具有重要作用, 能使支持細胞的前體細胞分化成有功能的塞托利細胞。與哺乳動物不同, 斑馬魚中存在2 個sox9同源基因: sox9a和sox9b, 可能是硬骨魚類種系發生過程中的一次大規?；蚪M復制導致。斑馬魚 sox9a和 sox9b基因的組織表達圖譜具有差異性, 前者在腦和精巢組織中廣泛表達, 而后者只在卵巢中表達。后來也在黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco、鯉、黃鱔Monopterus albus和河豚等的卵巢中也都同時分離到sox9a和sox9b基因。這說明sox基因家族成員尤其是sox9可能在性腺分化和發育中起重要作用。

1.5 DEAD-box RNA解旋酶vasa

DEAD-box RNA解旋酶(vasa)是一個依賴ATP 的 RNA解旋酶大家族, 該家族是以具有保守的DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)序列來命名的, Vasa蛋白是 DEAD-box蛋白家族的重要成員, 是決定生殖系發育的重要調控因子之一, vasa在果蠅 Drosophila melanogaster中首次報道, 并發現其是腹節形成和生殖細胞發育過程所必需的成分之一。由于該基因僅在大多數物種的生殖細胞中特異表達, 因此已經被作為一種分子標記物來研究原始生殖細胞(Primordial germ cells, PGCs)的起源、遷移、分化及配子發生過程。斑馬魚vasa在PGCs中特異性表達,與其受精卵的早期分化及性腺發育過程有關, 這一結果也在青 鳉上得到驗證[31]。目前已在異育銀鯽、青 鳉、草魚[32]、稀有鯽[33]、歐鱸[34]、大西洋鱈Gadus morhua[35]、羅非魚[36]、舌鰨 Cynoglossus semilaevis[37]和牙鲆Paralichthys olivaceus[38]等魚類中進行了 vasa克隆和鑒定工作, 且胚胎發育早期vasa表達量較為豐富。此外, 研究還發現羅非魚vasa基因在兩性生殖細胞發育過程中的表達存在明顯差異, 表明 vasa不僅與生殖質遷移相關, 還對魚類精、卵子的發生具有調控作用。

1.6 威廉姆斯瘤基因wt1

wt1基因是從Wilms’瘤細胞染色體llp13分離的一種抑癌基因。由于魚類特有的基因組復制, 其具有兩個wt1拷貝(wt1a和wt1b), 它們都有多種不同的選擇性剪接產物, 且從胚胎期開始就在腎臟和性腺中表達(在孵化后5d表現出明顯的性別差異)。Wt1蛋白可能直接調節或通過不同類型、甚至不同的剪切形式在雌雄性腺中分別調節foxl2和dmrt1的表達間接調節cyp19a基因的表達和雌激素的生成。

目前已經從黃鱔[39]、半滑舌鰨[40]等魚類中克隆獲得了wt1基因, wt1在性腺、腎、腸、脾和心臟等組織中都有表達。半滑舌鰨性腺中wt1表達量極顯著高于其他組織中的表達量[40], 黃鱔 wt1在各時期雌性、間性和雄性性腺中的表達量有先升高后降低的表達趨勢[39], 而在半滑舌鰨雄魚中的表達量顯著高于雌魚中的表達量, 雌魚中的表達量顯著高于偽雄魚中的表達量[40]。由此說明wt1可能對性腺的分化過程并不起決定作用[40]。

2 核受體?家族

核受體(Nuclear receptor)超家族成員包含類固醇受體 Steroid receptor、前列腺素受體、甲狀腺素受體、維生素 D3受體、孤寡受體 Orphan receptor以及異生物質受體等, 它們是一類配體依賴性的轉錄因子, 在核受體信號通路中發揮作用。其中類固醇受體包括雌激素受體(Estrogen receptor, ER)、雄激素受體(Androgen receptor, AR)、鹽皮質激素受體、糖皮質激素受體、孕激素受體等, 且其成員在進化上相當保守, 主要有4個不同的結構域: N-末端轉錄激活域, 高保守的 DNA結合域(DNA-binding domain, DBD), 鉸鏈區, 配體結合域(Ligand-binding domain, LBD)[41]。

2.1 雌激素受體Estrogen Receptor

在魚體內, 普遍存在三種雌激素受體(ERα、ERβ1和ERβ2, 分別由esr1、esr2b、esr2a編碼)進行雌激素介導作用, 參與魚類的生殖發育。從人乳腺癌細胞中成功克隆得到第一種雌激素受體 ERα,而魚類第一個ERα是從虹鱒中克隆得到的。隨著研究的深入, ERβ相繼從各種魚中被克隆到, 在對虹鱒的研究中, 后又發現了ERα的一個亞型ERα2。雌激素受體家族蛋白的一級結構從N端到C端依次可分成6個不同的功能結構域A/B、C、D、E和F, 具有轉錄激活或阻遏、核定位、DNA 結合、激素結合等多種功能, 其中, C結構域DBD和E結構域LBD在不同物種之間是很保守的, 具有基因和物種的特異性。目前, 除虹鱒以外, 研究報道的魚類ER已達到 10余種, 如不同品種羅非魚(O. aureus、O. niloticus、O. mossambicus)、斑點叉尾Ictalurus punctatus、金魚、斑馬魚、黑頭軟口鰷 Pimephales promelas 和底 鳉Fundulus heteroclitus等[41]。研究表明, 在大多數魚類中存在3種ER亞型 ERα、ERβ1 和ERβ2; 只在虹鱒Oncorhynchus mykiss、大西洋鮭Salmo salar、藍鰓太陽魚Lepomis macrochirus、鯽C. auratus、 倒刺 鲃Spinibarbus denticulatus等魚類中發現 ERα的亞型(ERα1和ERα2)。

2.2 雄激素受體Androgen Receptor

雄激素在組織和細胞發揮作用首先要和靶細胞膜上或核內的AR結合, 由AR介導, 通過不同的途徑將信號傳入細胞內從而產生一系列生物學效應。雄激素介導的AR信號途徑對雄性胚胎發育、雄性性成熟及雄激素依賴性靶組織的分化發育是必需的。AR同樣是一種配體依賴型的轉錄因子,不僅在結構和功能上高度相似, 而且可作為一種調節蛋白。脊椎動物AR發現存在2種亞型, 稱為ARα和ARβ, 最早的報道見于非洲爪蟾。在魚類已發現存在兩種亞型的并不多, 已有報道在硬骨魚類中虹鱒、日本鰻鱺、食蚊魚Gambusia affinis等魚發現了亞型, 而在鯽、彭澤鯽等中只存在一種亞型[42]。

2.3 X染色體上劑量敏感性反轉和先天性腎上腺發育不全決定區基因1 dax1

X染色體上劑量敏感性反轉和先天性腎上腺發育不全決定區基因1 [dax1, dosage sensitive sex-reversal (DSS), adrenal hypoplasia congenital (AHC) critical region on the X-chromosome, gene 1]是位于X染色體上劑量敏感性反轉決定區上的一個候選基因, 又稱為nr0b1 (Nuclear receptor subfamily 0, group B, member 1), 是孤核受體超家族(Orphan nuclear receptor)中的一員。人Xp21染色體上 dax1基因重復可導致劑量敏感性的性反轉綜合癥 DSS, 產生由雄性向雌性的性反轉現象, 并在小鼠上得到證實,且可以調控許多類固醇合成相關酶類的產生。此外, dax1基因突變還會引起先天性腎上腺皮質發育不全AHC現象, 后來在其他哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類中也都發現了該基因。之前的研究表明, Dax1可以作為一種轉錄抑制子與雌或雄激素受體參與調節性腺和腎上腺中的類固醇合成能力和發育過程。dax1在魚類中表達與哺乳動物相似, 在成魚的多數組織中都有表達。魚類dax1基因結構中較為保守且在多種魚類的性別決定時期都已被檢測到,如處于精巢發育中虹鱒、羅非魚等。目前已在羅非魚、斑馬魚、狼鱸和青 鳉等硬骨魚類上進行了dax1基因的相關研究[18, 43, 44], 但dax1的作用機制還不是很清楚。

2.4 類固醇調控因子1 sf1

類固醇調控因子1 (sf1, steroidogenic factor-1), 即ftz-f1基因, 屬于核受體超家族成員, 最早在控制果蠅體節分化基因fushi-tarazu中被發現[45]。相繼克隆得到的 sf1同源基因命名為不同的名字, 包括腎上腺4結合蛋白(Adrenal4-binding protein, ad4bp)和肝臟受體激素1基因(Liver receptor homorne-1, lrh1)等。后來被歸為 nr5a基因亞家族, 含有兩個 ftz-f1家族成員(nr5a1與nr5a2)。nr5a1包括與類固醇的合成 sf1相關基因, 參與性腺分化期間的精巢決定途徑[46]。nr5a2基因在肝臟、胰腺和腸中進行表達, 參與調節與雌激素結合的 α-胎球蛋白[47], 可能主要參與膽固醇代謝過程而不是類固醇的合成和性別決定過程。硬骨魚類Ad4BP/sf1可以通過與cyp19a基因啟動子部分結合, 調控芳香化酶基因的表達, 進而調節性激素的生成[48]。在稀有鯽、尼羅羅非魚和海鱸等cyp19a1a的啟動子區域, 預測到了sf1的結合位點[43, 49, 50], sf1同時也是amh基因的轉錄調節因子, 提示該基因與性別分化和雄性生殖系統的發育相關聯。

3 類固醇合成酶類基因

3.1 芳香化酶基因Aromatase

芳香化酶基因 cyp19a1對于脊椎動物的性腺分化和發育起到重要作用[1, 51], 其編碼的芳香化酶Aromatase屬細胞色素P450家族成員, 是雌性激素生物合成過程中的限速酶, 催化某些雄激素(如睪酮和雄烯二酮)轉化為雌激素。除鰻鱺外, 硬骨魚類芳香化酶基因的兩個亞型, 分為主要在性腺中表達的cyp19a1a和主要在腦中表達的cyp19a1b, 它們不僅具有獨特的功能, 且其表達特異受到不同調節因子的影響。芳香化酶基因cyp19a1a已經在許多種硬骨魚中被分離得到[52], 并在卵巢發育過程中有重要作用, 被認為是魚類卵巢分化一個可信的早期生物標志物[51]。目前cyp19a1a 鳉已在青 、狼鱸、羅非魚、斑馬魚、稀有鯽[49]和石斑魚等魚類中被發現。有證據表明cyp19a1a基因只在卵巢中表達, 而在精巢中基本上沒有表達, 且 cyp19a1表達水平及活性與雌激素的合成緊密相連。

3.2 其他細胞色素P450酶類

游離膽固醇需經線粒體外膜轉運至內膜, 在細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶(cyp11a1, Cytochrome P450-mediated side-chain cleavage enzyme)的作用下發生羥化和側鏈裂解。目 前此基因在青 鳉[53]、pejerrey[54]、斑馬魚、大西洋鮭、?？?、黃貂魚、日本鰻鱺和稀有鯽[55]等魚類上獲得了克隆, 且在性腺(尤其是精巢)中的表達量較高, 發現 cyp11a2基因在斑馬魚類固醇合成起始和維持中發揮重要作用[56]。Cyp11a1催化孕酮成孕烯醇酮, 孕酮經過 17α羥化酶/17,20碳鏈裂解酶P450c17 (cyp17a1, 17α-hydroxylase/17,20-lyase 1)的催化作用, 被催化成為雄烯二酮[57]。cyp17a1是一種微粒體細胞色素P450酶, 具有兩種催化功能, 即 17α,β-羥化酶和 17,20-裂解酶的活性, 在皮質醇和性激素的生物合成中起著重要作用。目前已經在韓國石頭魚[58]、牙鲆[59]、條斑星鰈[60]、半滑舌鰨[61]、 青 鳉和羅非魚[43]等魚類上獲得了克隆且在精巢中表達量較高, 且跟性腺組織的甲基化模式相關[59, 62]。余紅仕研究發現, 黃鱔cyp17a1除在腦中有少量表達外, 在其他組織中沒有表達,表明該基因與性別發育相關。該基因在雌雄黃鱔中都表達, 而在間性表達量較低, 說明該基因不是雄性發育或是雌性發育特異的基因, 而是性腺發育所必需且功能不同的基因。

3.3 羥基類固醇脫氫酶

3β羥基類固醇脫氫酶(3βHSD, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 由3bhsd編碼) 屬于膜結合蛋白,參與激素生成組織中固醇類激素第 3位酮基(3-keto group)與羥基(Hydroxy group)之間的相互轉換, 因具有較多亞型在不同組織中表達也有所差異, 雄激素能抑制腎上腺皮質細胞和睪丸間質細胞3bhsd表達。目前已經在斑馬魚、黃貂魚、羅非魚[43]鳉、青 和稀有鯽[55]等上獲得了克隆。11β羥基類固醇脫氫酶(11βHSD, 11β-hydroxysteroid dehydrogenase, 由11bhsd編碼)為糖皮質激素的代謝酶, 它催化糖皮質激素C11位的酮基與羥基之間的氧化還原反應, 目前在稀有鯽[63]、斑馬魚[64]、pejerrey[65]、南方鲇[66]等上獲得了克隆。11βHSD是決定鹽皮質激素受體特異性的關鍵因素, 并與遺傳性表觀鹽皮質激素增多癥(Apparent mineralocortieoid excess, AME)有關, 該酶分為11βHSD1和11βHSD2兩型, 調節組織中的皮質醇濃度, 進而調節糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體的激活, 起到控制血壓及水、電解質平衡的作用。

雄烯二酮在 17β羥化類固醇脫氫酶(17β-HSD, 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, 由17bhsd編碼)的作用下被催化成了 T, 在雌魚體內, 睪酮被芳香化酶芳香化成了雌激素 E2[67], 在精巢中, 睪酮被11β 羥 化 酶 (cyp11b1, P45011β-hydroxylase)和11β-HSD催化成雄魚特有的 11-KT[68], 最后合成可以被利用的 E2和 11-KT等激素。雌素酮(Estrone) 和E2的互相轉化時需要17β-HSD催化。17bhsd能在雌雄虹鱒魚的中特異性表達, 且在不同時期肝臟中的表達出現差異[69]。20β羥化類固醇脫氫酶(20βHSD)是卵巢中卵細胞成熟的催化酶, 主要作用是催化17α-羥基孕酮轉化成17α,20β-雙羥孕酮(17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one)[70], 此激素誘導卵母細胞生發泡破裂進而促進排卵。作為一種在糖(腎上腺)皮質激素代謝中發揮特殊功能的新基因[71],在斑馬魚應激代謝中發揮重要功能[72]。這些類固醇代謝酶類基因目前已在其他魚類物種中被相繼克隆,研究這些基因在性腺分化中的功能將成為未來一段時期研究的熱點。

4 卵母細胞結構基因

4.1 組蛋白H3伴侶蛋白hira

在彩鯽[73, 74]、銀鯽[73—75]和紅鯽[76]等雌核發育鯽屬的研究中, 組蛋白H3伴侶蛋白hira在精核解凝和胚胎發育中發揮重要作用。研究發現母源性組蛋白H2a的變體H2aflo和乙?；M蛋白H4可能是導致異源精核在銀鯽卵細胞中不能解除濃縮狀態的原因[75, 77], 利用Morpholino敲除證明hira對斑馬魚發育必不可少[77]。

4.2 卵黃原蛋白vitellogenin

卵黃原蛋白(Vtg, vitellogenin)即卵黃蛋白的前體, 是一種大分子量的磷酸酯糖蛋白。E2刺激下Vtg能在肝臟中合成, 通過血液運輸, 最后被運送到卵巢中作為胚胎發育的營養源。魚類生殖細胞發育成熟間接受外源或者內源的促性腺激素的促進作用,主要是直接通過類固醇激素來實現的。比如在雌魚的卵黃形成期, 垂體分泌促性腺激素作用于卵巢濾泡, 在濾泡膜細胞層合成雄烯二酮, 雄烯二酮再轉化為可芳香化的雄激素。睪酮再擴散到濾泡顆粒細胞層, 在芳香化酶的作用下轉化為E2隨即從卵巢中釋放出來, 刺激肝胰臟合成和釋放 Vtg。最后 Vtg在促性腺激素作用下進入發育的卵母細胞形成卵黃顆粒。在魚類中, 一般認為Vtg是雌魚的特異蛋白,但是雄魚的肝臟中也有vtg基因的存在, 因此, 雌二醇、乙炔雌二醇和雌酮等雌激素可以誘導雄魚肝臟合成Vtg并且發揮作用。

4.3 透明帶蛋白zona pellucida

透明帶蛋白(ZP, Zona pellucida)主要在頂體反應等與生殖相關的生命活動中發揮作用, 包含4種亞型: ZP1(ZPB)、ZP2(ZPA)、ZP3(ZPC)和 ZPX。在硬骨魚類中, 對zpb和zpc基因及其功能的研究相對較多。一般說來, 卵母細胞能夠合成 ZP蛋白, 且在體內無卵母細胞存在時, 機體也能夠合成ZP蛋白。在硬骨魚中, ZP蛋白主要在肝臟和卵巢中合成, 其表達模式分為卵巢特異性表達、肝臟特異性表達或在卵巢和肝臟組織中共同表達。雌激素能夠調控青 鳉肝臟中 ZP蛋白的合成; 斑馬魚卵巢 ZP蛋白表達則較為靈活,受雌激素的調控影響較小。zp表達與卵細胞的發生有重要的關系, 青鳉 中卵巢特異性表達的 zp在卵細胞直徑達到45 μm時就可檢測到表達; 鯉zpb的表達在卵黃囊泡階段就有較高水平的表達。雄性青 鳉肝臟特異性表達的 zp基因在正常情況下幾乎不表達, 當受到雌激素影響時, ZP蛋白會被誘導有較高的表達。

5 展望

雖魚類性別決定機制復雜, 參與性別決定的基因很多, 基因表達又受多因素調控, dmrt1基因往往處于級聯反應的上游, 但 dmrt1新成員的發現及如何通過實驗驗證其功能？類固醇合成途徑在雄激素向雌激素轉化途徑及魚類特有雄激素11-KT合成中發揮重要作用, 部分性腺分化基因、胰島素樣生長因子[42]也都能調控類固醇合成酶類基因的表達,但怎么調控？核受體是一類配體依賴性轉錄因子超家族, 與機體的生長發育、細胞分化等眾多生理、代謝過程息息相關, 但孤兒核受體是否也存在相應配體以及它們的轉錄活性是否也受可逆結合配體的調節？當前更加急迫的是, 工業生產(造紙、鋼鐵等行業)、畜禽規?；B殖、農藥大量使用等帶來的污水, 以及人類生活污水的肆意排放, 造成水體中存在大量有毒有害的內分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals, EDCs)。EDCs不僅會影響魚類的生殖發育, 也能通過魚體富集被食用最終對人體造成傷害,在水產品質量安全方面存在潛在的隱患。本課題組以稀有鯽[22, 48, 54, 63]和雌核發育物種彭澤鯽[11, 18, 41, 78]為研究對象對調控性腺分化基因進行了克隆, 并從基因表達層面證實這些基因的表達易收到 EDCs的影響[78], 并發現試驗動物體內激素水平發生紊亂,魚類的生殖細胞受到不同程度的抑制[63]。當然, EDCs在體內可通過葡糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT) 和磺酸基轉移酶(Sulfotransferase enzymes, SULT)來進行代謝和轉運, 但找到調控網絡中的關鍵節點分子尚需時日。從居民消費水產品的質量安全方面來看, 海、淡水主要養殖水產品, 地域性及進出口水產品品種的安全管控體系亟待建立和完善。因此, 對水產養殖全過程中風險危害因子的排查, 水體中有毒有害物質的檢測及其對魚類生殖毒害的分子生物學機制研究, EDCs在魚體內的殘留及消除規律、次生代謝產物的檢測以及探究有毒有害物質的降解途徑將變得十分有意義。因此, 隨著基因編輯[79]、測序技術和基因組學研究的推進,利用好這些技術將有利于破譯轉錄因子、輔激活和抑制因子、DNA等之間形成的復雜調控網絡, 加速研究進程。

表1 部分調控魚類性腺分化基因及功能匯總表Tab. 1 Summary on some genes and their functions in the sex differentiation

續表

續表

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PROGRESSES ON THE STUDY OF SEX DIFFERENTIATION GENES IN FISH

ZHENG Yao1, WANG Zai-Zhao2and CHEN Jia-Zhang1
(1. Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources and Environment in the Lower Reaches of the Changjiang River, Ministry of Agriculture; Key Open Laboratory of Ecological Environment and Resources of Inland Fisheries, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China; 2. Shaanxi Key Laboratory of Molecular
Biology for Agriculture, College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Due to the high diversity in fish species, their sex-determination mechanisms can be identified in almost all animals. Thanks to the advanced molecular biology techniques, there have been ground-breaking findings on the mechanisms of sex determination in fish, especially on the sex-differentiation genes in terms of the cloning, expression and the verification of their functions. In this article we reviewed the recent progress on the research of the sex-differentiation genes, the family of nuclear receptors, the steroidogenic enzyme-encoding genes, and the oocyte structure-related genes.

Sex-differentiation; Nuclear receptor; Steroidogenesis; Mechanism of sex determination; Gene

Q344+.2

A

1000-3207(2015)04-0798-13

10.7541/2015.105

2014-09-29;

2015-03-02

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-49); 國家科技支撐計劃(2015BAD13B03)資助

鄭堯(1986—), 男, 安徽太湖人; 助理研究員; 主要從事水產品質量安全監測方面工作。E-mail: zhengy@ffrc.cn

陳家長, E-mail: chenjz@ffrc.cn