草魚呼腸孤病毒衣殼蛋白VP7真核重組質粒的構建及免疫效果評價

郝貴杰 袁雪梅 潘曉藝 徐 洋 姚嘉赟 藺凌云 尹文林 沈錦玉

(浙江省淡水水產研究所, 農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室, 浙江省魚類健康與營養重點實驗室, 湖州 313001)

草魚呼腸孤病毒衣殼蛋白VP7真核重組質粒的構建及免疫效果評價

郝貴杰 袁雪梅 潘曉藝 徐 洋 姚嘉赟 藺凌云 尹文林 沈錦玉

(浙江省淡水水產研究所, 農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室, 浙江省魚類健康與營養重點實驗室, 湖州 313001)

為研究開發草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)基因疫苗, 以編碼其主要衣殼蛋白VP7的序列為靶基因, 克隆構建了真核表達重組質粒 pEGFP-N1-VP7。用脂質體法將其轉染真核細胞COS-1和CIK進行瞬時表達, 熒光顯微鏡觀察及特異性RT-PCR檢測結果表明, 成功轉染并得到了高效表達。大量擴增重組菌, 提取并制備重組質粒pEGFP-N1-VP7, 肌肉注射免疫(20±5) g的健康草魚, 重組質粒按0.5和5 μg分為2 組, 同時設5 μg空載體組及對照組。免疫草魚22d后, 檢測草魚腸、外周血、腎臟、脾臟的呼吸暴發活性及淋巴細胞的增殖反應; 免疫草魚21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后, 分別尾靜脈采血并分離血清, 用雙抗體夾心ELISA方法進行抗體水平的測定。結果表明, 構建的含VP7蛋白的核酸疫苗既可誘導草魚的細胞免疫, 又可誘導特異性體液免疫, 具有明顯的免疫應答作用。按照每尾0.5 μg重組質粒的劑量免疫草魚后35d進行攻毒, 免疫保護率達到67%, 此研究為GCRV基因疫苗的研制提供了實驗資料。

草魚呼腸孤病毒; 衣殼蛋白; 真核表達; 體液免疫; 細胞免疫

草魚(Grass carp, Ctenopharyngodon idellus)是一種草食性魚類, 飼養成本低, 養殖地域廣, 是中國淡水養殖的主要魚類, 其產量占淡水養殖總產量的20%以上, 具有較高的經濟價值[1, 2]。但草魚病毒性出血病的頻頻發生大大降低了其成活率, 對全國草魚養殖產業造成重大威脅, 常引起草魚魚種及成魚的大批死亡,該病已被中國農業部列入二類動物疫病病種名錄[3]。該病的病原為草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV), 是水生呼腸孤病毒(Aquareovirus, ARV)屬中毒力最強的一成員, 也是中國分離鑒定并在國際上首次完成全基因序列分析的的第一株魚類病毒[4—6]。GCRV直徑大小約為75 nm, 無囊膜, 具有雙層衣殼, 在pH3—11之間十分穩定, 對氯仿和乙醚處理不敏感, 其基因組由11條dsRNA組成[7, 8]。其中S10 節段共有909 bp, 僅有一個ORF編碼VP7蛋白, 約34 kD, VP7為病毒的外衣殼蛋白, 具有溶蛋白裂解作用, 在病毒的感染及免疫中起著不可替代的作用[9—11]。Attoui等[12]在2012年第九屆國際病毒分類委員會報告中指出水生呼腸孤病毒屬A-G亞型的劃定主要是根據S10基因及其編碼蛋白VP7的變異水平。近年來, 本實驗室與中國科學院武漢病毒研究所方勤課題組針對草魚出血病開展了一些合作研究, GCRV的VP7蛋白被體外表達并證明具有較好的抗原性, 并且通過制備VP7抗體進行中和實驗, 證明其具有較高的中和活性, 表明 VP7是GCRV主要抗原表位之一[13—16]。因此, 以其為靶蛋白, 研制GCRV的基因疫苗成為可能。

基因疫苗(Genetic vaccine)根據其特點被稱為第三代疫苗, 第一代為弱毒、滅活疫苗, 第二代為基因重組的亞單位疫苗。我們平時常說的核酸疫苗(Nucleic acid vaccine)、DNA疫苗(DNA vaccine)也是指基因疫苗, 與傳統疫苗的最大區別是該疫苗是通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白, 從而誘導免疫動物產生對該目標抗原蛋白的免疫應答, 以達到預防和治療疾病的目的。其核心是將編碼某種已知目標抗原蛋白的外源基因克隆到真核表達載體上,將重組的質粒 DNA直接注射到動物體內而實現體內真核表達。與傳統疫苗相比, 基因疫苗具有較多的優勢, 如可與其他免疫原組成多價疫苗、免疫效果好、生產成本低、保護期長和安全性好等優點[17, 18]。目前, 關于魚用基因疫苗的研究與應用主要有鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)、淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)、病毒性出血敗血癥病毒(VHSV)和鮭、鱒的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV)等傳染性病毒病防治的相關報道[19—21]。近年來也有細菌 DNA 疫苗研究的報道[22, 23], 有關草魚出血病基因疫苗的報道較少, 本研究是在前期構建真核重組質粒pCI-VP7的基礎上[25], 再選擇真核表達載體 pEGFP-N1為載體, 構建融合表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和VP7蛋白的真核表達載體,并初步研究該基因疫苗對草魚的免疫效果, 為進一步研制GCRV多價基因疫苗提供數據與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用質粒、細胞株及實驗動物等

真核表達載體pEGFP-N1由浙江大學動物科學學院惠贈, 含 VP7整個編碼區的克隆載體 pMD19-T-VP7由本室構建。CIK細胞由本實驗室(農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室)保存, COS-1細胞由揚州大學獸醫學院惠贈, 分泌草魚IgM單抗的雜交瘤細胞株4D5由本室制備保存, GCRV毒株為本室自行分離保存, 標準參考株 GCRV873, 由長江水產研究所魚病研究室惠贈。健康草魚, 體重(20±5) g,購自湖州浙北新品種繁育公司。

1.2 GCRV VP7基因PCR的擴增

根據真核表達載體pEGFP-N1的多克隆位點序列及目的片段不能帶終止密碼子的特性, 在VP7蛋白編碼區設計了 1對含酶切位點的特異性引物, 上游和下游引物序列為 F1: 5′-CGGAATTC ACCACG ATGCCACTTCAC-3′ (26 bp, 劃線處為EcoRⅠ酶切位點), R1: 5′-CGGGATCC GGATGGCTCCACATGC AA-3′ (26 bp, 劃線處為BamHⅠ酶切位點), 預計產物為830 bp, 以本室構建的克隆載體pMD19-T-VP7重組質粒為模板, 擴增體系按照Ex Taq酶(TaKaRa)推薦的體系進行, 50 μL反應體系中加入10倍稀釋質粒模板DNA 1 μL進行PCR擴增, 反應條件: 95℃預變性 5min; 然后 94℃預變性 50s; 55℃退火 50s; 72℃延伸1min; 共35個循環; 最后72℃延伸10min, 12 ℃ 10min 。取產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.3 重組質粒pEGFP-N1-VP7的構建

將上述PCR產物回收純化, 以EcoR Ⅰ/BamHⅠ分別雙酶切載體pEGFP-N1和回收的PCR產物, 再經過回收純化、連接及轉化, 涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB板上篩選鑒定。陽性克隆擴增后小量提取質粒, 經PCR和酶切鑒定后, 送至南京金斯瑞生物公司測序。

1.4 重組質粒pEGFP-N1-VP7質粒轉染及鑒定

將陽性重組質粒轉染COS-1和CIK細胞, 轉染方法參照文獻[25]進行, 在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

按 RNA提取試劑盒說明書提取轉染 pEGFPN1-VP7 質粒的COS-1和CIK細胞總RNA, RT-PCR檢測轉染質粒的轉錄, 根據重組質粒測序的基因序列, 設計1對能擴增包括重組質粒中VP7和GFP的部分序列的PCR引物, 共約712 bp, F3: 5′-GACCAT CCCACCAAACCG-3′, R3: 5′-CTCGATGCGGTTCA CCAG-3′, 反應體系: cDNA模板1 μL, 10×Ex Taq buffer (內含Mg2+) 5 μL, F3、R3 (100 nmol/L)各1 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL, Ex Taq酶(5U)0.25 μL, 補ddH2O 37.75 μL 至50 μL。反應條件: 94℃預變性5min; 然后94℃變性50s; 48℃退火50s; 72℃延伸1min; 36個循環; 最后72℃延伸10min, 12 ℃ 10min 。產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 核酸疫苗的制備及免疫

將重組質粒 pEGFP-N1-VP7在含卡那霉素(50 μg/mL )的LB液體培養基中大量擴增, 采用除內毒素質粒提取試劑盒提取質粒 DNA, 并用超微量分光光度計(NanoDrop2000, USA)對核酸濃度進行定量。

草魚在過濾的池塘水中充氧飼育, 水溫(20—22) ℃。試驗共分4個組, 每組35尾, 分別為肌肉注射: (1)注射 PBS對照, (2)注射空載體 pEGFP-N1 (5 μg/尾), (3)注射重組質粒pEGFP-N1-VP7(5 μg/尾), (4)注射重組質粒pEGFP-N1-VP7(0.5 μg/尾), 以上各處理組注射體積均為100 μL/尾。草魚免疫22d后進行解剖, 在無菌條件下取不同組織用于淋巴細胞懸液的制備并測定實驗指標。另外, 在草魚免疫后不同時間進行尾靜脈采血, 4℃冰箱過夜后經低速離心取血清, –20℃保存, 用于血清抗體的檢測。

1.6 受免草魚細胞免疫效果評價

免疫細胞的制備 參照鄭風榮[26]的方法, 分別制備草魚外周血淋巴細胞及草魚脾臟、腸黏膜、腎臟淋巴細胞, 胎盤蘭染色計數, 調細胞濃度為106cells/mL。

淋巴細胞轉化的測定 取 96孔細胞培養板,每孔加入淋巴細胞懸液100 μL, 再加入1 mg/mL的PHA各10 μL, 放入22℃細胞培養箱中, 每24h吹打一次, 48h后每孔加入80 μL MTT(噻唑藍); 繼續培養4h 后, 每孔加入80 μL的DMSO, 570 nm處測吸光值, 并進行統計學分析。*表示免疫組與對照組之間具有顯著性差異(P＜0.05), **表示免疫組與對照組之間具有極顯著性差異(P＜0.01)

呼吸暴發的測定 取96孔酶標板, 每孔加入淋巴細胞懸液100 μL, 分別加入100 μL 1 mg/mL的NBT(四氮唑藍, 10 mmol/L、pH 7.4的PBS 配制), 22 ℃細胞培養箱中孵育1h; 分別加入100 μL無水甲醇, 400 g/min水平離心10min, 棄上清, 用70 %甲醇洗3遍, 每孔加入100 μL、2 mol/L的KOH和140 μL 的DMSO, 620 nm處測吸光值, 并進行統計學分析。1.7 受免草魚體液免疫效果評價

建立評價疫苗效果的 TAS-ELISA方法 用包被液 CBS(pH9.6碳酸鹽緩沖液)將本課題組純化的VP7融合蛋白稀釋到50 μg/mL, 100 μL/孔, 加入96孔酶標板, 4℃冰箱包被過夜, PBST充分洗滌包被板, 每次3—5 min , 洗滌3—4次; 用含8%脫脂奶粉的PBS封閉, 200 μL/孔, 37℃封閉2h, 同上洗滌。將草魚血清分別進行1︰80 稀釋, 每孔加入100 μL, 37℃孵育1h, 同上洗滌。然后每孔加入100 μL 1︰1000稀釋的草魚IgM單抗腹水(本室制備), 37℃孵育1h, 同上洗滌。每孔加入50 μL 1︰2000稀釋的羊抗鼠IgG酶標抗體, 37℃孵育1h, 同上洗滌。用磷酸-檸檬酸緩沖液配制的 OPD底物液進行顯色, 每孔50 μL, 37℃避光顯色10—l5min。2 mol/L 硫酸終止反應, 每孔加50 μL。用Versanmax全波長酶標儀測定 A490值。P/N≥2.1者判為陽性, P/N＜2.1者判為陰性。(P代表TAS-ELISA所測受免草魚血清中抗體的OD值, N代表所測健康草魚的相應血清中抗體的OD值)

受免草魚血清中抗體的測定 每組草魚在免疫21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后,分別尾靜脈采血并分離血清, 每組采 3尾。用前文描述的雙抗體夾心 ELISA(TAS-ELISA)方法進行抗體水平的測定。

1.8 相對免疫保護率測定

按照 1.5中方法進行草魚免疫, 核酸疫苗含量為0.5 μg/尾, 每組免疫30尾, 并設對照組, 注射同樣劑量的PBS。注射免疫后35d, 進行GCRV攻毒,攻毒用毒株為自行分離的江西株 GCRV JX2008(根據前期攻毒實驗及細胞培養測定, Karber氏方法進行計算, 測得其半數致死量為 107.5LD50/mL, 半數組織細胞感染量為109.0TCID50/mL), 腹腔注射劑量為 0.2 mL。28℃左右水溫飼養, 觀察 20d。計算各試驗組和對照組死亡率后, 按下列公式進行計算:

2 結果

2.1 重組質粒pEGFP-N1-VP7的構建與鑒定

將編碼VP7蛋白的目的基因按照1.2及1.3中的方法進行PCR擴增、克隆及篩選鑒定, 獲得陽性重組質粒pEGFP-N1-VP7。按照1.4中方法進行重組質粒的轉染鑒定, 在熒光顯微鏡下觀察到轉染細胞胞核胞質均有綠色熒光, 說明EGFP與VP7融合基因在轉染細胞中能夠成功表達。轉染細胞經RT-PCR鑒定, 具有預期的目的條帶, 而正常細胞對照則無任何條帶, 圖略。

2.2 草魚各組織淋巴細胞的增殖活性

噻唑藍法(MTT法)測定草魚外周血、腸黏膜、脾臟、腎淋巴細胞增殖反應(圖 1), 4種組織的淋巴細胞增殖活性與對照組相比均有顯著性差異, 其中外周血和腸黏膜中的增殖比例明顯高于脾臟和腎,說明該核酸疫苗具有提高特異性 T細胞增殖反應的功能。并且隨劑量的增加有所增強, 但差異不顯著。

2.3 草魚各組織淋巴細胞的呼吸暴發活性

四氮唑藍法(NBT法)測定草魚外周血、腸黏膜、脾臟、腎淋巴細胞呼吸暴發活性(圖2)。4種組織的淋巴細胞呼吸暴發活性與對照組相比均有顯著性差異, 其中外周血和腸黏膜的活性高于脾臟和腎, 說明該核酸疫苗具有提高特異性 T細胞增殖反應的功能。并且隨劑量的增加有所增強, 但差異不顯著。

圖1 草魚肌肉注射重組質粒pEGFP-N1-VP7 22d淋巴細胞增殖反應(n=3)Fig. 1 The lymphocyte proliferation response of the grass carps on Day 22 after the muscle injection of the recombinant plasmid pEGFP-N1-VP7

圖2 草魚肌肉注射pEGFP-N1-VP7 22d后各組織淋巴細胞呼吸暴發活性反應(n=3)Fig. 2 The respiratory burst response of the grass carps on Day 22 after the muscle injection of the recombinant plasmid pEGFP-N1-VP7

2.4 免疫草魚的抗體水平

核酸疫苗免疫接種后不同時間, 草魚血清中抗GCRV抗體的變化(圖3)。從圖中可以看出, 接種核酸疫苗 pEGFP-N1-VP7 21d后, 草魚血清抗GCRV的抗體比對照組有明顯增加, 35d后增加更為顯著,達到最高峰, 但 56d后開始下降, 兩種劑量產生抗體水平沒有明顯差異, 且持續到 98d實驗結束時抗體水平依然高于對照組。

2.5 相對免疫保護率測定

按照 1.8中方法測定核酸疫苗免疫草魚的相對免疫保護率, 結果表明, 核酸疫苗 pEGFP-N1-VP7 以 0.5 μg/尾注射免疫草魚, 其相對免疫保護率為67%, 而對照組為30%, 顯示出較好的免疫效果。

圖3 草魚肌肉注射核酸疫苗pEGFP-N1-VP7不同時間后血清抗體水平(n=3)Fig. 3 The serum antibody level in the grass carp at different time points after the muscle injection of the recombinant plasmid pEGFP-N1-VP7

3 討論

自20世紀70年代以來, 草魚出血病一直影響我國淡水養殖業的健康發展, 因此有關該病的病原及其防治技術方面的研究多次被列為國家科技攻關項目, 也曾獲得過國家科技進步一等獎。多年來, 許多科學家致力于該病毒的研究, 全國各地相繼應用組織漿滅活疫苗和細胞滅活疫苗進行免疫防治, 使得出血病在一定程度上得到了控制。但組織漿滅活疫苗需大量魚體擴增病毒, 費時費力, 并存在擴散病毒的危險。細胞滅活疫苗的制備也需大量培養病毒, 成本很高, 并要求嚴格的檢測手段以防止滅活不完全帶來的致病風險, 這些疫苗本身的缺點限制了疫苗的推廣與應用。近年來, 細胞弱毒疫苗也得到了廣泛的應用, 并取得了較好的免疫效果, 但也存在毒力返強的風險, 而且毒株的變異會對疫苗的效果產生影響。所以以現代分子生物學和基因工程為基礎, 研制一種安全、高效的單價或多價的基因疫苗為控制草魚出血病帶來了新的探索和希望。

DNA疫苗因其具有的特點和優勢得到越來越多的研究與探索, 其在魚類的應用已有成功報道[27, 28], 2005年, 虹鱒(IHNV)的DNA疫苗就是世界上拿到使用許可證書的兩種 DNA疫苗的一種[29]。目前GCRV基因疫苗的研究僅見徐詩英等[24]的報道, 其將VP7基因克隆至轉移載體pFastBzcTMDualz中, 獲得了較好的免疫保護, 但其使用劑量較高, 可能與載體的表達水平有關。本課題組在前期構建pCI-VP7 的基礎上[25], 進一步探討編碼GCRV外衣殼蛋白 VP7基因成為基因疫苗新材料的可能性, 選擇 pEGFP-N1作為真核表達的載體, 其含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記基因, 因此可在動物細胞中表達含EGFP的融合蛋白, GFP是一種生物發光物質, 其熒光強弱取決于蛋白的含量, GFP分子量小,不影響外源蛋白的構象和功能, 并且在活細胞內長時間存在, 有利于真核重組質粒的鑒定及構建多價核酸疫苗。本研究成功構建了pEGFP-N1-VP7真核表達載體, 熒光顯微鏡下觀察結果顯示, 在大部分轉染后的COS-1細胞和CIK細胞可觀察到綠色熒光,進一步表明構建的重組質粒已成功轉染到細胞中,并可以在其中自行高效表達。本研究前期為了比較所構建的兩種重組質粒的免疫效果, 將兩者以同樣的劑量和途徑免疫Balb/C小鼠3次后, ELISA測定其產生的抗GCRV特異性抗體, 結果表明核酸疫苗pCI-VP7及 pEGFP-N1-VP7均能在小鼠體內成功表達, 并誘導產生特異性 GCRV抗體, 最高效價分別達1︰160和到1︰320, 表明pEGFP-N1-VP7比pCIVP7表達VP7抗原的水平更高一些, 所以本研究選擇pEGFP-N1-VP7進行草魚免疫來進一步研究其免疫效果。

研究表明, DNA疫苗可以同時引起機體的細胞免疫和體液免疫反應, 而且常以細胞免疫為主。為了進一步研究核酸疫苗誘導草魚產生免疫應答的機制, 本研究經背鰭基部肌肉免疫草魚, 從細胞免疫和體液免疫兩個方面進行評價。齊鵬等[30]用噻唑藍法(MTT法)檢測了豬口蹄疫合成肽疫苗可引起特異性T淋巴細胞免疫應答。楊馥如等[31]通過檢測小鼠細胞因子如IFN-γ等產生的水平來評價H1亞型流感DNA疫苗誘導細胞免疫的水平。因為目前沒有商品化檢測魚類細胞因子的試劑盒, 本研究通過噻唑藍法(MTT法)檢測了草魚外周血、腸黏膜、脾臟和腎的淋巴細胞增殖反應, 用四氮唑藍法(NBT法)測定了各組織淋巴細胞的呼吸暴發活性, 結果顯示: 受免草魚在免疫后 22d, 各免疫相關組織的淋巴細胞增殖和呼吸暴發活性均顯著高于對照組, 且隨免疫劑量的增加而提高, 但差異不顯著。本研究應用本人之前制備的草魚IgM單克隆抗體[32], 建立了雙抗體夾心ELISA法檢測抗GCRV抗體IgM的方法, 用該方法檢測草魚進行基因免疫后不同時間的血清抗體, 結果表明, 接種21d后, 兩種不同劑量的核酸疫苗抗GCRV抗體均有明顯增加, 35d后達到最高峰, 但56d后開始下降, 直到98d還維持在明顯高于對照組的抗體水平, 兩種劑量產生抗體水平沒有明顯差異。免疫保護率實驗表明其相對保護率為 67%,對照組為30%, 這是因為目前該基因型的GCRV沒有強毒株(目前流行的另一基因型毒力較強), 對照攻毒組也無法達到100%的死亡。從免疫保護率結果可以看出, 該疫苗還需要進一步優化, 如可通過構建多價疫苗(包括選擇同基因型不同的抗原或不同基因型的保護性抗原作為靶抗原), 與分子佐劑聯合使用及采用在生物體內可降解的高分子聚合物作為載體遞送DNA疫苗[33], 來提高DNA疫苗的免疫效果。本研究為進一步開發草魚出血病DNA疫苗奠定了重要基礎。

[1] Ge X P. Current state and construction of the industry technology system on conventional freshwater fish [J]. China Fisheries, 2010, (5): 5—9 [戈賢平. 我國大宗淡水魚養殖現狀及產業技術體系建設. 中國水產, 2010, (5): 5—9]

[2] Wang F H, Li A X. Advances in research of hemorrhage of grass carp [J]. South China Fisheries Science, 2006, 2(3): 66—71 [王方華, 李安興. 草魚病毒性出血病研究進展.南方水產, 2006, 2(3): 66—71]

[3] Chen A P, Jiang Y L, Qian D, et al. Hemorragic disease of grass carp [J]. China Fisheries, 2010, 11(2): 34—35 [陳愛平,江育林, 錢冬, 等. 草魚出血病. 中國水產, 2010, 11(2): 34—35]

[4] Chen W W, Wang Q, Liu Y K, et al. Isolation and identification of new GCRV strain and primary study on its immunogenicity [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(5): 790—795 [曾偉偉, 王慶, 劉永奎, 等. 一株草魚呼腸孤病毒弱毒株的分離、鑒定及免疫原性初步分析. 水生生物學報, 2011, 35(5): 790—795]

[5] Rangel A A, Rockemann D D, Hetrick F M, et al. Identification of grass carp haemorrhage virus as a new genogroup of aquareovirus [J]. Journal of General Virology, 1999, 80: 2399—2402

[6] Winton J R, Lannan C N, Fryer J L, et al. Morphological and biochemical properties of four members of a novel group of reoviruses isolated from aquatic animals [J]. Journal of General Virology, 1987, 68(2): 353—356

[7] Ke L H, Fang Q, Cai Y Q. Characteristics of a novel isolate of grass carp hemorrhagic virus [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 1990, 14(2): 153—159 [柯麗華, 方勤, 蔡宜權. 一株新的草魚出血病病毒分離物的特性. 水生生物學報, 1990, 14(2): 153—159]

[8] Fang Q, Attoui H．Francois J, et al. Sequence of genome segments1, 2 and 3 of the grass carp reovirus (genus aquareovirus, family reoviridae) [J]. Biochemical andBiofisical Research Communications, 2000, 274(3): 762—766

[9] Qiu T, Lu R H, Zhang J, et al. Compete nucleotide sequence of the S10 genome segment of grass carp reovirus (GCHV) [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2001, 44(1): 69—74

[10] Fang Q, Shah S, Liang Y, et al. 3D Reconstruction and capsid protein characterization of grass carp reovirus[J]. Science in China Series C, 2005, 48: 593—600

[11] Fang Q, Seng E K, Ding Q Q. Characterization of infectious particles of grass carp reovirus by treatment with proteases [J]. Archives of Virology, 2008, 153: 675—682

[12] Attoui H, Mertens P P C, Becnel J, et al. Family reoviridae. In Virus Tsxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Vireses [M]. Edited by King A M Q, M J Adams, E B Carstens, et al. London: Academic Press. 2012, 541—637.

[13] Zhang L L, Shen J Y, Fang Q, et al. High level expression of grass carp reovirus VP7 protein in prokaryotic cells [J]. Virologica Sinica, 2008, 23(1): 51—56

[14] Shao L, Sun X, Fang Q. Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E. coli are capable of neutralizing viral infectivity [J]. Virology Journal, 2011, 8: 347

[15] Xu Y, Hao G J, Shen J Y, et al. Isolation and identification of two Grass carp Reovrus strains in Jiangxi Province [J]. Freshwater Fisheries, 2010, 40(3): 54—59 [徐洋, 郝貴杰,沈錦玉,等. 兩株草魚呼腸孤病毒江西株的分離與鑒定.淡水漁業, 2010, 40(3): 54—59]

[16] Hao G J, Shen J Y, Pan X Y, et al. Isolation and identification of a strain of Grass carp reovirus in Huzhou [J]. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(1): 47—52 [郝貴杰,沈錦玉, 潘曉藝, 等. 草魚呼腸孤病毒湖州分離株的分離及鑒定. 漁業科學進展, 2011, 32(1): 47—52]

[17] Wang K. Animal nucleic acid vaccine research status and prospects for development [J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2010, 37(8): 186—188 [王凱. 動物核酸疫苗研究現狀及發展前景. 中國畜牧獸醫, 2010, 37(8): 186—188]

[18] Hao G J, Shen J Y, Pan X Y. The current development of nucleic acid vaccine and its application in fish [J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2007, 2(2): 142—148 [郝貴杰,沈錦玉, 潘曉藝. 核酸疫苗的研究進展及其在魚類免疫中的應用. 大連水產學院學報, 2007, 2(2): 142—148]

[19] Zheng F R, Sun X Q, Liu H Z, et al. Study on the distribution and expression of a DNA vaccine against lymphocystis disease virus in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) [J]. Aquaculture, 2006, 261: 1128—1134

[20] Lorenzen N, Lorenzen E, Einer—Jensen K, et al. DNA vaccines as a tool for analyzing the protective immune response against rhabdoviruses in rainbow trout [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2002, 12(5): 439—453

[21] Utke K, Kock H, Schuetze H, et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus [J]. Develomental and Comparative Immunology, 2008, 32: 239—252

[22] Chen Z H, Lin T L, Xia C. Current development in the studies of fish DNA vaccines [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2003, 27(6): 648—653 [陳振海, 林天龍, 夏春. 魚類DNA疫苗研究的新進展. 水生生物學報, 2003, 27(6): 648—653]

[23] Sun Y, Hu Y H, Liu C S, et al. Construction and analysis of an experimental Streptococcus iniae DNA vaccine [J]. Vaccine, 2010, 28(23): 3905—3912

[24] Hao G J, Pan X Y, Yao J Y, et al. Construction and identification of recombinant eukaryotic expression vector pCI-VP7 containing GCRV VP7 gene [J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(5): 807—813 [郝貴杰, 潘曉藝,姚嘉赟 , 等. 草魚呼腸孤病毒衣殼蛋白VP7基因真核表達載體 pCI-VP7的構建及鑒定, 水產學報, 2010, 34(5): 807—813]

[25] Zheng F R. The research about protective efficiency and safety of DNA vaccine against Lymphocystis disease virus (LCDV) [D]. Thesis for Doctor of Science. Ocean University of China, Qingdao. 2006 [鄭風榮. 淋巴囊腫病毒核酸疫苗的免疫效果評價及安全性研究, 博士學位論文, 中國海洋大學, 青島. 2006]

[26] Tonheim T C, D, Dalmo R A, Bgwald J, et al. Specific uptake of plasmid DNA without reporter gene expression in Atlantic salmon (Salmo salar L.) kidney after intramuscular administration [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 24(1): 90—101

[27] Tian J Y, Sun X Q, Chen X G. Formation and oral administration of alginate microspheres loaded with pDNA coding for lymphocystis disease virus (LCDV) to Japanese flounder [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2008, 24: 592—599

[28] Lorenzen N, Lapatra S E. DNA vaccines for aquaculture fish [J]. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootic), 2005, 24: 201—203

[29] Qi P, Xiao J, Wang N, et al. Cellullar immunologic response of immunized Swine following Synthetical peptide vaccine by MTT assay [J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2011, 4(2): 13—15 [齊鵬, 肖進, 王楠, 等. MTT法評價豬口蹄疫合成肽疫苗的細胞免疫應答. 中國獸藥雜志, 2011, 4(2): 13—15]

[30] Yang F R, Yu H, Wang B, et al. Construction of a universal vaccine against H1 subtype influenza viruses and its protective efficacy in mice [J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2013, 44(2): 240—249 [楊馥如, 于海, 王斌, 等. H1 亞型流感病毒通用疫苗的構建及其對小鼠免疫保護效力研究. 畜牧獸醫學報, 2013, 44(2): 240—249]

[31] Hao G J, Shen J Y, Xu Y, et al. Production andcharacterization of monoclonal antibodies against grass carp immunoglobulin [J]. China Journal Cell Molecular Immunology, 2009, 25(9): 808—810 [郝貴杰, 沈錦玉, 徐洋, 等. 草魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其特性鑒定.細胞與分子免疫學雜志, 2009, 25(9): 808—810]

[32] Zhang H, Wang G L, Han X Y, et al. Preparation and immunogenicity of ploy (Lactide-Co-Glycolide) microparticles DNA vaccine against Porcine Reproductive and Respiratory syndrome [J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2013, 44(7): 1117—1123 [張輝, 王光利, 韓秀英, 等. PRRS 聚乳酸乙醇酸微粒DNA疫苗的制備及其免疫原性. 畜牧獸醫學報, 2013, 44(7): 1117—1123]

THE CONSTRUCTION OF PEGFP-N1-VP7 CONTAINING GCRV VP7 GENE AND STUDIES ON ITS IMMUNE EFFICACY

HAO Gui-Jie, Yuan Xue-Mei, PAN Xiao-Yi, XU Yang, YAO Jia-Yun, LIN Ling-Yun,
YIN Wen-Lin and SHEN Jin-Yu
(Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture, Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province, Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China)

In this study, to research and development the gene vaccine for Grass carp reovirus (Grass carp reovirus, GCRV), the recombinant plasmid pEGFP-N1-VP7 which carried the gene of the major capsid protein VP7 of GCRV was constructed and identified. Then the recombinant plasmid was transfected into COS-1 and CIK cells with lipofectamine 2000, and the fluorescence microscope and RT-PCR were used to detect the transient expression. The results showed that the 830 bp fragment of VP7 gene was successfully transfected and expressed in COS-1 and CIK cells. To evaluate the immune efficacy of the DNA vaccine, the plasmids were extracted and purified from the mass culture of the recombinant bacteria containing the recombinant plasmid pEGFP-N1-VP7. Vaccine was diluted into 0.5 μg/100 μL and 5 μg/100 μL with PBS. Immune experiment was divided into four groups that are 0.5 μg group, 5 μg group, empty plasmid group and PBS control group. They were injected intramuscularly grass carp which weighs (20±5) g. Lymphocytes from different tissues and organs, such as the peripheral blood, the mesentery, the spleen and the kidney, were collected on Day 22 after the vaccination. The respiratory burst function was measured with NBT and the lymphocyte proliferation assay was conducted with MTT. The lymphocyte function of grass carps was up-regulated after the immunization with the DNA vaccine. In addition, the blood samples were also collected on Day 21, 28, 35, 42, 56, 70, 84 and 98 after the immunization. The specific antibody against VP7 in the sera of grass carps was detected with the triple antibody sandwich ELISA. These results demonstrated that the DNA vaccine could evoke both the cellular and the humoral immune response. The grass carps were immunized with 0.5 μg recombinant plasmids per tail, and the protection rate could reach 67%. Our study provided fundamental information on the research of the gene vaccine of GCRV.

Grass carp reovirus; Major capsid protein; Eukaryotic expression; Humoral immunity; Cellular immunity

S942.1

A

1000-3207(2015)04-0751-07

10.7541/2015.98

2014-08-12;

2014-12-16

浙江省科技廳重大科技專項重點農業項目(2012C12009-4); 湖州市科技攻關計劃項目(2011GG11); 浙江省公益技術研究農業項目(2012C22046)資助

郝貴杰(1979—), 女, 安徽六安人; 碩士; 主要從事水生動物病害及免疫學研究。E-mail: melissa511@sina.com

沈錦玉(1963—), 女, 浙江湖州人; 研究員; E-mail: sjinyu@126.com