千年笛鯛早期發育及視蛋白基因表達規律分析

謝子強 王中鐸 郭昱嵩 劉楚吾

(廣東海洋大學水產學院, 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室, 湛江 524025)

千年笛鯛早期發育及視蛋白基因表達規律分析

謝子強 王中鐸 郭昱嵩 劉楚吾

(廣東海洋大學水產學院, 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室, 湛江 524025)

初步觀察千年笛鯛早期發育各個時期的形態特征, 同時使用實時熒光定量 PCR方法對 4種視蛋白基因在早期發育中的表達規律進行分析。研究觀察到千年笛鯛卵為圓球形, 屬浮性卵, 中心有一明顯的油球。在水溫(24.5±0.5)℃的條件下, 千年笛鯛胚胎發育共經歷6個發育階段18個時期, 從受精卵到孵化一共經歷24h。仔魚經歷12—15d發育為稚魚, 30d—35d發育為幼魚。同時對7個胚胎發育時期和2個仔魚發育時期4種視蛋白(LWS、SWS1、SWS2、RH)基因的表達情況進行檢測, 在下包1/2、胚孔封閉、視囊這3個時期有顯著性表達(P＜0.05), 尤其在胚孔封閉時期, 表達量達到最高。其余時期 4種基因的表達水平顯著下降, 但在2個仔魚時期表達量比孵化期略有增加。結果表明千年笛鯛4種視蛋白基因在早期表達過程中與神經胚的形成有密切的聯系。

千年笛鯛; 早期發育; 視蛋白基因; 實時熒光定量PCR

千年笛鯛(Lutjanus sebae)隸屬鱸形目(Perciformes)笛鯛科(Lutjanidae)笛鯛屬(Lutjanus), 屬于暖水性近岸巖礁魚類, 主要分布于紅海、印度洋和印度尼西亞、中國、菲律賓、澳大利亞海域[1]。千年笛鯛的繁殖周期長、出苗率高、生長迅速、營養豐富、養殖收益高, 近幾年已成為福建、廣東、海南等沿海地區重要的海水養殖品種[2]。研究魚類的繁殖與早期胚胎發育不僅能為許多養殖品種的人工繁育提供理論上的支持, 也是魚類學研究的一個重要基礎。國內外對模式生物斑馬魚(Danio rerio)的早期發育已經進行深入的研究, 并對其進行了詳細的分期和形態學特征描述[2]。而一些重要的海水養殖經濟品種, 如金頭鯛(Sparus aurata)、大西洋鱈(Gadus morhua)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、紅鰭笛鯛(L. erythopterus)等都有相關的早期發育的研究報道[3—7]。千年笛鯛的繁殖與早期發育有其鮮明的特點, 但國內外對其早期發育的報道比較少, 特別是胚胎時期的發育還未見相關的學術報道。

魚類視蛋白基因的研究近幾年來成為人們研究其與環境適應的一個熱點, 但往往都集中在其分子機制和系統進化方面的研究, 對其早期發育中表達差異的研究相對較少。視蛋白(Opsin)是一種由視覺細胞產生的跨膜蛋白, 具有七個跨膜結構域的G蛋白耦聯受體的超家族。生活在水中的魚類由于受水深和水質的影響, 在長期進化的過程中其視蛋白基因比其他的陸生脊椎動物具有更高的分化程度[8]。目前, 國內外對斑馬魚、麗魚(Poecilia reticulata)、太平洋藍鰭金槍魚(Thunnus orientalis)、金魚(Carassius auratus)等魚類視蛋白基因都有較為深入的研究,從分子角度上揭示了其進化與環境適應之間的密切聯系[9—12]。而在這些研究中, 尤以介導明視覺的LWS (長波長敏感性視蛋白Long wavelength wavelength-sensitive)、SWS1(短波長敏感性視蛋白1類家族 Short wavelength- or blue-sensitive pigments)、SWS2 (短波長敏感性視蛋白 2類家族 SWS1-like pigments)視蛋白基因和介導暗視覺的RH (視桿蛋白, Rhodopsin)視蛋白基因研究報道最多。笛鯛屬魚類作為熱帶珊瑚礁地區的魚類因其生長環境特殊、體色艷麗可成為研究視蛋白與海水環境相適應的一個優勢種屬。國內外對笛鯛屬魚類視蛋白的吸收光譜、分子結構以及系統進化都進行了較為深入的研究, 從而探討了笛鯛屬魚類視覺進化與環境適應之間的密切關系[13—15]。在早期發育水平上, 模式生物斑馬魚視覺相關的基因方面已經有較多的研究報道[16—18]。同時, 在日本鰻(Anguilla japonica)、條石鯛 (Oplegnathus fasciatus)、中華鱘(Acipenser sinensis)等一些魚類中也有相關的早期視覺發育的報道[19—21]。

本研究對千年笛鯛的早期發育各個階段形態特征進行觀察和描述, 同時結合實時熒光定量PCR的技術手段對千年笛鯛4種主要的視蛋白在早期發育階段的表達規律進行研究, 為笛鯛屬魚類視蛋白和視覺系統研究提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的千年笛鯛的胚胎樣本為 2013年11月采自海南省三亞市蜈支洲島附近海域的人工海水養殖基地。仔魚、稚魚和幼魚采自海南省陵水縣新村鎮海南青利水產繁殖有限公司(魚卵及仔、稚、幼魚均來自同一批親魚的人工繁育后代)。使用尼康YS100顯微鏡和佳能SX170 IS數碼相機對胚胎發育各個時期進行觀察和攝像, 使用 RNA-later (sigma)對每個時期的胚胎進行保存。

1.2 引物設計合成

根據GenBank上所收錄的紅鰭笛鯛的LWS (登錄號: FJ824750)和千年笛鯛RH (登錄號: EU637974)兩種視蛋白基因部分片段cds區序列。SWS1、SWS2 和β-actin序列來自本研究室對紅鰭笛鯛視蛋白基因研究的結果, 使用Beacon Designeer 8.0軟件進行熒光定量引物設計(表1), 由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 各時期樣品總RNA提取和反轉錄

采用TRIzol?Reagent試劑盒(公司)提取各個時期樣品總RNA, 每個時期樣品富集20—30個胚胎,使用 Nanodrop2000核酸定量儀對其濃度和純度進行檢測, 濃度在100—500 ng/μL之間, 純度A260/280為1.8—2.0。凝膠電泳檢測顯示28S和18S條帶清晰可見。采用M-MLV反轉錄酶(Promega公司)將提取的總RNA反轉錄cDNA第一鏈, 每個時期樣品在反轉錄體系中使用1 μL隨機六聚引物和1000 ng總RNA。

1.4 熒光定量引物適用性分析

隨機選取若干個時期cDNA樣品對5對熒光定量引物進行適用性篩選。PCR擴增體系為10.0 μL, 其中PCR Buffer (10×) 1 μL, dNTPs (2 mmol/L) 1 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.15 μL, cDNA模板0.5 μL, 無菌去離子水6.3 μL。反應程序: 95℃預變性30s; 95℃變性5s, 55.4℃退火5s, 72℃延伸10s, 共進行40個循環。PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 實時熒光定量PCR

采用SYBR Green I 熒光實時定量PCR法對各個樣品中的4種視蛋白基因表達量進行檢測, 使用Thermo公司的Master Mix (2×)試劑盒, qPCR反應在Bio-Rad CFX 96實時熒光定量PCR儀進行。qPCR擴增體系為10.0 μL, 其中Master Mix (2×) 5 μL, 正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, nuclease-free water 3.5 μL, cDNA模版0.5μL。反應程序: 50 UDG℃ 預處理2min, 95 ℃預變性10min; 95℃變性15s, 退火溫度30s, 72℃延伸30s并檢測熒光信號, 共進行45個循環;反應結束后進行熔解曲線的制作, 熔解曲線的溫度設為60—95 , ℃ 每隔5s升溫0.5 , ℃ 檢測是否有非特異擴增。先用若干樣品進行溫度梯度篩選, 篩選出5個基因最適的退火溫度(55.4 ), ℃ 再進行定量實驗。每個時期的定量檢測都進行3個不同樣品的平行對照。

1.6 數據統計與分析

根據Bio Rad CFX Manager軟件的定量結果(Ct 值), 以 2–△△Ct法計算各目的基因的相對表達水平[22],試驗數據均以M±SD表示(其中M為平均值, SD為標準差), 使用SPSS 19.0統計軟件對數據進行單因素方差統計分析, 所得數據用Microsft Office Excel 2010軟件作圖。

2 結果

2.1 千年笛鯛早期發育階段

采集的千年笛鯛受精卵是在同一時間受精, 并在相同的孵化條件下進行孵化, 所以顯微鏡下觀察到的所有胚胎發育進程基本同步。千年笛鯛受精卵為浮性卵, 通體透明, 呈球形, 中間有一顆明顯的油球。在水溫(24.5±0.5) , ℃ 鹽度28—33, pH 7.5—8.5的海水中, 千年笛鯛胚胎經歷 24h完成胚胎發育孵化出膜。胚胎與仔稚幼魚時期的劃分主要參考金頭鯛(Sparus aurata)[4]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[6]和紅鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus)[7]3種鱸形目海水魚類的早期發育分期。胚胎發育經歷卵裂、囊胚、原腸、神經胚、器官形成、孵化6個階段共18個時期。出膜后初孵仔魚約2 mm左右, 孵化后 3—5d開口攝食。12—15d后胸鰭、背鰭、臀鰭形成進入稚魚期, 稚魚全長約 4.0—7.0 mm。30—35d以后進入幼魚期, 各鰭發育完整, 軀干部出現三條明顯的“川”字形黑斑, 全長約25—40 mm,與成魚相似。其早期發育進程如表2和圖版Ⅰ所示。

2.2 四種視蛋白基因在千年笛鯛早期發育的表達情況

使用54—60℃ 11個退火溫度對五對熒光定量引物進行適應性篩選, 結果顯示 5對引物都能特異性擴增出目的條帶, 目的條帶與理論預計相符。通過實時熒光定量 PCR檢測了千年笛鯛四種視蛋白(LWS、SWS1、SWS2、RH)基因在早期發育中9個不同時期(多細胞期、下包1/2期、胚孔封閉期、視囊期、晶體出現期、心臟跳動期、孵化期、1d仔魚、5d仔魚)中的表達情況。分析LWS、SWS1、SWS2、RH和β-actin的熔解曲線, 其分別在76℃、77℃、79℃、78.5℃和 80℃出現單一產物峰。采用 2–△△Ct法對比不同時期基因的表達差異, 首先求出每個樣品的目的基因Ct值和內參基因的Ct值的差值并進行單因素分差分析(表3), 差值的結果能反應出該基因表達水平, 再找出差值最大的時期設為對照組,計算出不同時期之間的相對表達量(圖1)。實驗結果顯示在千年笛鯛早期發育的過程中, 4種視蛋白基因在下包1/2期、胚孔封閉、視囊這3個時期有較為顯著的表達, 尤其在胚孔封閉時期達量最大, 之后表達量顯著降低(P＜0.05), 孵化期表達量最低。孵化出膜后4種基因的表達量比孵化期的表達量略有回升, 尤其在SWS1基因上, 孵化出膜后的表達量較為顯著。

表2 千年笛鯛早期發育過程Tab. 2 The early development of Lutjanus sebae

3 討論

魚類早期發育生物學的研究是魚類種質保護和水產養殖的基礎, 20世紀60年代以后國內外許多學者就對魚類的早期發育生物學進行了廣泛的研究,無論從形態學觀察, 發育階段的時期劃分、早期生活史都積累很多寶貴的經驗和研究報道。隨著分子生物學技術的發展, 越來越多的學者對各種功能基因和早期發育之間的相互關系進行了深入的研究。雖然海洋硬骨魚類胚胎與仔魚發育機制大致相同,但由于其早期發育階段形態復雜[23], 至今在學術界仍對其發育階段的劃分有許多爭論。本研究將千年笛鯛胚胎發育分為卵裂、囊胚、原腸、神經胚、器官形成、孵化6個發育階段, 總共分18個時期, 發育過程與金頭鯛、斜帶石斑魚、紅鰭笛鯛、紫紅笛鯛等鱸形目海水魚類基本相似[4, 6, 7, 24]。千年笛鯛為熱帶、亞熱帶巖礁暖水性魚類, 水溫條件是影響其生長發育的一個重要因素。鐘建興等[25]在對千年笛鯛人工育苗的研究中發現, 當水溫保高于 20℃時其生長迅速, 發育良好, 而水溫在 16—17℃時其攝食量會減半, 當水溫在 13℃時其攝食活動將會停止,活力變弱, 5d后便全部死亡。由此可見千年笛鯛是一種不耐低溫的海水魚類。在千年笛鯛魚卵孵化的過程中, 水溫也是影響孵化時間快慢的一個重要條件。國內有學者對笛鯛屬另外兩個養殖品種紫紅笛鯛和紅鰭笛鯛的胚胎發育過程進行研究。在水溫26—30℃條件下, 紫紅笛鯛和紅鰭笛鯛從受精到孵化只需15—17h[7, 24]。此次觀察時間為 11月份, 水溫只有 24—25 ,℃ 千年笛鯛從受精到孵化需要20—24h左右的時間, 較慢于其他兩種魚。在仔魚、稚魚和幼魚的發育進程方面, 仔魚在孵化后 3—5d開口攝食輪蟲, 在15d左右發育為稚魚, 30d后發育為幼魚。仔稚幼魚在發育時間進程和形態轉變特征上與鐘建興研究結果基本相似。而國內尹紹武等[2]則對仔魚發育進入稚魚期的時間有不同的描述, 其記錄進入稚魚的時間為孵化后 22d。經形態學描述對比發現其報道只是在對稚魚時期劃分上與本研究的劃分不同導致。因此, 對于魚類形態學分類尤其是早期發育時期的劃分仍需進行更深入的研究, 為魚類養殖生產提供更為可靠的理論依據。

表3 千年笛鯛4種視蛋白早期發育表達水平Tab. 3 The expression of four opsin genes in the early development of L. sebae

圖1 四種視蛋白基因在千年笛鯛不同發育時期的表達水平Fig. 1 The expression of four opsin genes at different development stage of L. sebae

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德國殖民者以膠澳總督府為核心建設城市行政中心，設計“三支道”[注]三支道：Spiro Kostof將以3條街道為一組形成的放射狀道路稱為三支道系統.中央的那條是軸線，旁邊兩條支道與它的關系是均等或近乎均等對稱狀，同時總有一個廣場作為這3條路的空間起源.青島行政中心“三支道”以青島路為軸線，日照路和莒縣路屬支道. 壯麗風格城市形態.總督府建筑、葉什克紀念碑和琴島燈塔組成了這一區域的對景.幾何對稱構圖和精致的城市軸線極盡奢華地宣揚統治的權威[5](圖2).

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PRELIMINARY STUDIES ON THE EARLY DEVELOPMENT AND THE EXPRESSION PATTERN OF OPSIN GENES OF EMPEROR RED SNAPPER(LUTJANUS SEBAE)

XIE Zi-Qiang, WANG Zhong-Duo, GUO Yu-Song and LIU Chu-Wu
(Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes, Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025, China)

In this study, we observed the morphological characteristics and used qRT-PCR to analyze the expression pattern of four opsin genes during the early development of Emperor red snapper. The eggs of Emperor red snapper were a type of buoyancy that had spherical shape and one oil globule. Fertilized eggs hatched in 24 hours at the temperature of (24.5±0.5)℃, and there were 6 phases and 18 stages in the development of the embryo. After 12—15 days, the larvae developed into juvenile. After 30—35 days, the juvenile developed into young fish. We detected the expression of four opsin genes (LWS, SWS1, SWS2 and RH) at 7 embryo stages and 2 larvae stages. All four genes were markedly expressed at the 1/2 epiboly stage, the closure of blastopore stage and the optic capsule stage (P＜0.05). The expression level of the four genes was the highest at the closure of blastopore stage. At other stages the expression was largely decreased. However, the expression was slightly increased at 2 larvae stages compared to the hatching stage. Our results suggested that the expression of the four opsin genes in the early development was closely associated with the formation of the neural embryo of Emperor red snapper.

Lutjanus sebae; Early development; Opsin genes; qRT-PCR

Q344+.1

A

1000-3207(2015)04-0758-08

圖版Ⅰ 千年笛鯛個體發育過程
Plate Ⅰ The early development of Lutjanus sebae

1. 胚盤隆起期; 2. 2細胞期; 3. 4細胞期; 4. 8細胞期; 5. 多細胞期; 6. 桑葚胚期; 7. 高囊胚期; 8. 低囊胚期; 9. 下包1/4期; 10. 下包1/2 期; 11. 下包3/4期; 12. 胚孔封閉期; 13. 視囊形成期; 14. 晶體出現期; 15. 心臟形成期; 16. 心臟跳動期; 17. 孵化期; 18. 初孵化仔魚; 19. 2d仔魚; 20. 15d稚魚; 21. 35d幼魚; 22. 65d幼魚
1. Blastodisc formation; 2. 2-cell stage; 3. 4-cell stage; 4. 8-cell stage; 5. Multi-cell stage; 6. Morul stage; 7. High blastula stage; 8. Low blastula stage; 9. 1/4 epiboly stage; 10. 1/2 epiboly stage; 11. 3/4 epiboly stage; 12. Closure of blastopore stage; 13. Optic capsule stage; 14. Eye lens formed stage; 15. Heart stage; 16. Heart-beating stage; 17. Hatching stage; 18. Newly hatched larvae; 19. 2d Larva after hatching; 20. 15d Juvenile; 21. 35d Young fish; 22. 65d Young fish

10.7541/2015.99

2014-10-14;

2015-04-12

國家自然科學基金青年基金(31101904); 廣東省高等學校優秀青年教師培養計劃項目(Yq2013091)資助

謝子強(1987—), 男, 廣東汕頭人; 碩士研究生; 研究方向為海洋生物學。E-mail: xieziqiang1987@163.com

郭昱嵩(1980—), 女, 湖南郴州人; 副教授; 研究方向為海洋生物學。E-mail: gysrabbit@163.com