N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻生長、抗氧化酶及光合系統Ⅱ的影響

劉 瑞 白 芳 冉小飛 楊燕君 楊宋琪 施軍瓊 吳忠興

(西南大學生命科學學院, 三峽庫區生態環境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區植物生態與資源重點實驗室, 重慶 400715)

N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻生長、抗氧化酶及光合系統Ⅱ的影響

劉 瑞 白 芳 冉小飛 楊燕君 楊宋琪 施軍瓊 吳忠興

(西南大學生命科學學院, 三峽庫區生態環境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區植物生態與資源重點實驗室, 重慶 400715)

為探究化感物質對入侵水華藍藻-擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)的影響, 研究對不同濃度(0、0.05、0.10、0.50、1.00和2.00 mg/L)N-苯基-2-萘胺處理下擬柱胞藻的生長、抗氧化酶活性及葉綠素熒光誘導動力學進行了測定。結果表明, 藻葉綠素 a含量隨 N-苯基-2-萘胺濃度升高而顯著降低, 濃度大于0.50 mg/L時, 擬柱胞藻葉綠素a含量顯著低于對照。72h, N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻的EC50為1.02 mg/L。葉綠素熒光誘導動力學參數表明, 濃度小于0.50 mg/L時, 擬柱胞藻的最大光化學效率(φP0)、單位面積上有活性的反應中心(RC/CS0)、以吸收光能為基礎的性能指數(PIABS)及以單位面積為基礎的性能指數(PICS)均顯著高于對照, 而反映2ms時有活性的反應中心的開放程度的ψ0則顯著低于對照組。當N-苯基-2-萘胺濃度大于0.50 mg/L時, 以上參數均呈現相反趨勢。這表明低濃度N-苯基-2-萘胺能提高擬柱胞藻的光合效率, 而在高濃度時, 擬柱胞藻PSⅡ有活性的反應中心減少, 電子傳遞受到阻礙, 光合效率下降。與對照相比, 在濃度高于0.50 mg/L條件下, 擬柱胞藻的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性顯著增加, 表明擬柱胞藻能產生大量的抗氧化酶來減少 N-苯基-2-萘胺的損傷。這些結果表明 N-苯基-2-萘胺可能通過抑制PSⅡ的電子傳遞和減少其有活性的反應中心來影響擬柱胞藻的生長, 也暗示了N-苯基-2-萘胺能作為潛在的抑藻物質來控制擬柱胞藻水華。

光合作用; 擬柱胞藻; 抗氧化體系; 化感物質

近年來, 藍藻水華在許多富營養化湖泊和水庫中頻繁暴發[1, 2]。藍藻水華的暴發, 造成湖泊水質惡化、透明度下降、厭氧程度提高、生物多樣性下降和優勢物種改變, 從而破壞了水體生態系統結構和功能, 對人類健康、生態安全造成巨大的破壞[3]。據統計, 在世界范圍內大約有40個藍藻屬, 其中包括最常見的微囊藻 Microcystis Kützing、魚腥藻Anabaena Bory、束絲藻Aphanizomenon Morren等均可以形成水華[4]。然而, 自1979年澳大利亞北昆士蘭帕門島 148人中毒物質－擬柱胞藻毒素(Cylindrospermopsin)被揭示出來后, 擬柱胞藻(Cylindrospermopsis Seenaya et Subba Raju)的研究才開始引起藻類學者、生態學者和管理部門的關注[5]。

擬柱胞藻屬于藍藻門(Cyanophyta)、念珠藻目(Nostocales)、念珠藻科(Nostocaceae), 以拉氏擬柱胞藻(C. raciborskii)為模式種。由于擬柱胞藻已經由熱帶地區擴張到溫帶地區, 甚至北緯 53°—54°, 因此其被認為是一種入侵的水華藍藻[6]。近年來的研究表明擬柱胞藻不僅已在我國水體分布, 而且呈現出明顯的增加趨勢, 甚至在一些大型水庫、湖泊中已成為優勢種類并產生水華[7, 8]。此外, 擬柱胞藻能夠產生肝毒素以及貝類麻痹毒素等多種毒素[9, 10], 對魚類、牲畜甚至是人類的健康都有巨大的威脅。因此,預防和控制擬柱胞藻水華具有十分重要的意義。

藻類水華控制的方法主要包括物理法、化學法以及生物法。前兩種方法比較費時、費錢, 甚至對環境造成二次污染, 因此, 均不被推薦廣泛使用[11, 12]。生物源抑藻物質在抑藻方面的作用相對于前兩種方法具有安全和對水環境生態系統危害小等優點, 已引起各國學者的高度重視[13, 14]。1969 年Fitzgerald[15]發現水生植物的代謝產物可以控制藻類的生長, 水生植物通過化感作用抑制藻類的生長繁殖引起人們的廣泛興趣, 并希望通過對化感物質的研究開發高效專一的除藻劑, 進而為湖泊富營養化的生態治理探索切實可行的方法。

N-苯基-2-萘胺是高等植物鳳眼蓮(Eichhornia crassipes)和小花地不容(Stephania micrantha)等產生的一種次生代謝產物[16, 17]。N-苯基-2-萘胺代謝產物2-萘胺為致癌物質, 但其在人體內代謝為 2-萘胺的轉化率低于 1%[18]。美國政府工業衛生學家會議(ACGIH)指出, N-苯基-2-萘胺本身不被定義為人類致癌物質[19]。而藻類細胞對該化合物的敏感性極高,微劑量就能顯著抑制藻類細胞的生長[20, 21]。

本實驗通過分析不同濃度下 N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻生長, 抗氧化酶及光合系統Ⅱ熒光動力學參數的影響, 旨在探究N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻抑藻機理, 為擬柱胞藻等藍藻水華的預防和治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 藻體培養

擬柱胞藻FACHB-1096由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。藻種擴大培養至對數期,取對數期藻液, 離心后分別接入含不同濃度 N-苯基-2-萘胺(0、0.05、0.10、0.50、1.00和2.00 mg/L)的200 mL MA (pH 8.6)[22]培養基中, 于光照培養箱中培養, 每個濃度設 3個重復。培養條件為: 溫度(25±0.1)℃ , 25 μmol photons /(m2·s)、光暗比為12h︰12h。為避免培養過程中藻體成團, 每天定時搖動錐形瓶幾次。

1.2 葉綠素及EC50測定

取5 mL的藻液, 4000×g離心力下離心10min,去掉上層培養液, 藻體加入 90%的丙酮, 根據Nusch的方法進行提取[23]。采用概率單位法(Probit method), 利用SPSS 16.0 中Probit 程序對擬柱胞藻在N-苯基-2-萘胺暴露72h后的EC50值進行計算[24, 25]。

1.3 葉綠素a熒光動力學曲線

取5 mL藻液暗適應20min, 用便攜式植物效率分析儀(Handy-PEA,英國漢莎公司)測定不同濃度N-苯基-2-萘胺處理后的擬柱胞藻多相葉綠素熒光變化。測定時光化光為3000 μmol quanta/(m2·s), 收集10μs至2s的熒光信號。測定的JIP參數, 參照Strasser 和Strasser[29]的方法選取了表1中參數進行分析。

1.4 抗氧化酶SOD、CAT、GPX活性測定

取30 mL在不同濃度N-苯基-2-萘胺中培養的藻液, 4000×g離心 5min, 棄上清, 下層藻液用蒸餾水洗滌后液氮研磨, 加入4℃預冷的4 mL PBS (PBS的濃度為0.05 mol/L、pH為7.8)緩沖液提取粗酶液。過氧化氫酶(CAT)以及超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定分別參照Choo等[26]和Wu等[27]的方法。谷胱甘肽過氧化物酶 GPX活性采用谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定?？扇苄缘鞍撞捎每捡R斯亮藍法測定[28]。酶活性單位以單位蛋白濃度(U/mg 蛋白)表示。

表1 選取的JIP-測定參數及其意義Tab. 1 The selected JIP test parameters and there meaning

1.5 數據分析

實驗數據處理使用統計軟件SPSS 16.0, 所有數據均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。用LSD (P＜0.05)檢驗處理組與對照組之間的差異, 當P ＜0.05時, 差異顯著, P＜0.01時, 差異極顯著。

2 結果

2.1 葉綠素a含量及EC50值

隨著濃度的增加, 高濃度處理組(＞0.50 mg/L)葉綠素a含量顯著低于對照(圖1)。相比之下, 低濃度處理組(＜0.50 mg/L)葉綠素 a含量顯著上升(P＜0.05)。隨時間變化, 濃度為0.10 mg/L的處理組,葉綠素a含量與對照組相比呈現輕微降低(P＞0.05)。通過SPSS中Probit程序計算, 獲得N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻的72h EC50值為1.02 mg/L。

2.2 葉綠素熒光動力學曲線O-J段

在不同濃度 N-苯基-2-萘胺處理后, 低濃度(＜0.50 mg/L)處理組曲線與對照組無明顯差異(P＞0.05, 圖2)。N-苯基-2-萘胺濃度高于0.50 mg/L 時, 曲線發生較大變化, J點幾乎消失, 但各濃度在曲線O點至J點間均未出現明顯拐點。

圖1 N-苯基-2-萘胺濃度對擬柱胞藻葉綠素a含量的影響Fig. 1 Effect of N-phenyl-2-naphthylamine concentration on the Chl. a content of C. raciborskii

2.3 葉綠素熒光動力學參數

結果表明單位面積上有活性的反應中心(RC/ CS0), 最大光化學效率(φP0), 以吸收光能為基礎的性能指數(PIABS)及以單位面積為基礎的性能指數(PICS)表現出相同的趨勢, 即低濃度處理(＜0.50 mg/L)顯著高于對照, 而高濃度時顯著低于對照(P＜0.01, 圖3)。與對照組相比, φP0在0.05、0.10、0.50、1.00 和 2.00 mg/L五個濃度時, 分別是對照組的 1.08、1.05、0.34、0.22和 0.13倍, 而 PIABS與 PICS則分別為1.23、1.08、0.02、0.04、0.01和1.24、1.08、0.02、0.05和0.01倍。反映反應中心捕獲的激子中,用來推動電子傳遞到電子傳遞鏈中超過 QA的其他

圖2 不同濃度N-苯基-2-萘胺處理后擬柱胞藻快速葉綠素熒光曲線O-J段變化Fig. 2 Fast fluorescence transient curves from O to J of C. raciborskii treated with different concentrations of N-phenyl-2-naphthylamine

圖3 不同濃度N-苯基-2-萘胺處理后擬柱胞藻JIP 測定參數的變化(與對照相比百分數)Fig. 3 Changes in the JIP-test parameters expressed as a percentage of the control when C. raciborskii were exposed for 48h to various concentrations of N-phenyl-2-naphthylamine

電子受體的激子占用來推動QA還原激子的比率, 即照光 2ms 時有活性的反應中心的開放程度的參數 ψ0則表現出相反的趨勢, 即低濃度處理時(0.10和0.50 mg/L), ψ0顯著低于對照, 分別降低了 6.19%、71.01%, 而高濃度(1.00和2.00 mg/L)處理組則顯著高于對照, 分別增加了4.26%和6.12% (P＜0.01)。

2.4 抗氧化酶SOD、CAT及GPX活性

與對照相比, SOD和GPX活性隨N-苯基-2-萘胺濃度的升高顯著的上升(P＜0.01), 而 CAT活性只在高濃度的 N-苯基-2-萘胺處理下呈顯著上調(P＜0.01, 圖4)。在2.00 mg/L處理下, CAT、SOD及GPX活性分別為對照的2.78、1.58、2.57倍。

3 討論

先前的研究已經表明, N-苯基-2-萘胺一種對藻類作用極強的化感物質[21, 30—32]。本研究發現隨 N-苯基-2-萘胺濃度的升高, 葉綠素a含量明顯下降(圖1), 這與Qian等[21, 32]研究結果一致, 表明N-苯基-2-萘胺抑制了擬柱胞藻葉綠素的合成。Bj?rkman[33]研究表明葉綠素濃度降低反映了光合反應中心復合體天線色素減少, 說明N-苯基-2萘胺處理后, 擬柱胞藻光合系統可能發生損傷。在 72h, N-苯基-2萘胺處理下, 擬柱胞藻EC50為1.02 mg/L。相比一些已鑒定出的化感物質, 如 β-紫羅蘭酮、蘆竹堿、兒茶酸和鞣花酸, 其EC50值分別為(21.23 ± 1.87) mg/L[34]、2.10 mg/L[35]、5.00和5.10 mg/L[36]。因此, N-苯基-2-萘胺具有較強的抑制能力, 可作為一種潛在的擬柱胞藻水華抑制劑。

圖4 不同濃度N-苯基-2-萘胺處理后擬柱胞藻GPX(A)、SOD(B)、CAT(C)及活性Fig. 4 GPX(A), SOD (B) and CAT(C) activity in C. raciborskii following exposure to different concentrations of N-phenyl-2-naphthylamine for 48h

研究表明, 當 PSⅡ的供體側受到傷害時, 水裂解系統被抑制, 放氧復合體(OEC)受損, 導致經過極短的時間(在J點之前), 葉綠素熒光產量就會上升,出現K點(照光后大約 300 μs處的特征位點), 多相熒光O-J 變為O-K-J[37, 38]。在本研究中, 未出現K 點(圖 2), 說明不同濃度 N-苯基-2-萘胺處理后, 擬柱胞藻PSⅡ供體側均未受到損傷。研究發現, 在正常條件下, 有活性的PSⅡ反應中心將捕獲的光能轉化為激發能, 并將其中的一部分轉化為化學能, 推動碳同化反應, 其余部分耗散掉。然而, 在受到某些脅迫時, 反應中心可能失活, 不能將吸收的光能傳遞給電子傳遞鏈。這種失活的反應中心可能是作為防止電子傳遞受到光損傷的一種保護機制[39]。本研究發現, 單位面積上有活性的反應中心在低濃度N-苯基-2-萘胺處理時(＜0.50 mg/L), 顯著高于對照, 而高濃度時顯著低于對照組(圖 3), 表明高濃度的 N-苯基-2-萘胺導致了擬柱胞藻 PSⅡ反應中心的失活或降解, 也暗示了擬柱胞藻的受體側可能受到了抑制, 進而導致吸收的光能不能被有效地利用。

φP0表征電子傳遞的能量占有活性的反應中心捕獲的能量的比率, 也反映了 PSⅡ最大光化學效率。在高濃度N-苯基-2-萘胺(＞0.50 mg/L)處理下, 擬柱胞藻φP0顯著低于對照(圖3), 這一結論支持了前人關于化感物質能抑制藻類電子傳遞鏈能量傳遞[34], 表明高濃度的 N-苯基-2-萘胺降低了擬柱胞藻 PSⅡ用于電子傳遞的能量。與對照相比, 高濃度N-苯基-2-萘胺處理時, ψo值顯著增加(圖3), 表明光照2 ms時, PSⅡ反應中心的開放程度增加, 即用于電子傳遞的能量與用于 QA還原的能量的比例增加[29, 40]。這表明 N-苯基-2-萘胺可能對擬柱胞藻光合系統 II電子傳遞鏈受體側產生了影響。當濃度高于 0.50 mg/L 時, 擬柱胞藻光合結構遭到損傷, PSⅡ受體側電子傳遞受阻, 光合效率下降, 且有活性的反應中心減少, 最終導致整個細胞光合作用受到強烈的抑制,這與劉彥彥等[41]關于白屈菜紅堿主要影響銅綠微囊藻光合系統反應中心電子供體側電子傳遞的結論不同, 說明不同化感物質對藻類光合系統的影響有所差異。另外, 在低濃度的N-苯基-2-萘胺(＜0.50 mg/L)處理下, 擬柱胞藻 RC/CS0、φP0與對照相比均有顯著上升, 說明低劑量的N-苯基-2-萘胺對擬柱胞藻生長有一定的促進作用, 支持了前人關于化感物質對藻類影響的結果[42—44]。

PIABS及 PICS均在一定程度上反映出脅迫對光合結構的破壞, PIABS與PICS比φP0更加敏感。已有的研究表明高等植物在受到某些脅迫時, 光合機構遭到破壞, PIABS與 PICS會顯著下降[45—47]。本研究發現擬柱胞藻在高濃度 N-苯基-2-萘胺處理下也表現出下降的趨勢(圖3), 表明擬柱胞藻的光合結構受到了極大的破壞, 光合效率大幅度下降。

在N-苯基-2-萘胺處理下, 擬柱胞藻細胞內自由基(ROS)升高, 隨 N-苯基-2-萘胺的濃度增大, 為維持機體平衡, 一系列抗氧化酶如清除過氧化氫的CAT[48], 催化 O2–歧化反應的 SOD以及能夠清除過氧化氫和有機氫過氧化物的 GPX[49]活性均升高(圖4), 這一結論與 Qian等研究結果是一致的[21], 進一步說明 N-苯基-2-萘胺處理導致擬柱胞藻產生了氧化損傷。

綜上所述, 在高濃度N-苯基-2-萘胺處理下, 擬柱胞藻的光合結構遭到損傷, PSⅡ電子傳遞受阻,光合效率下降, 且有活性的反應中心減少, 抑制整個細胞光合作用, 導致了擬柱胞藻生長受到阻礙。研究已經表明 N-苯基-2-萘胺對小鼠的 LD50超過了1000 mg/kg[50], 而本研究及其他研究表明微劑量能顯著抑制藻類細胞的生長[20, 21], 因此, N-苯基-2-萘胺可以作為一個潛在的抑藻物質來控制擬柱胞藻水華。然而, 應用N-苯基-2-萘胺作為抑藻物質仍需大量的野外研究, 特別是N-苯基-2-萘胺劑量及時間效應上仍需大量的工作及數據支撐。

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EFFECT OF N-PHENYL-2-NAPHTHYLAMINE ON THE GROWTH, ANTIOXIDATIVE ENZYME AND PSIN Ⅱ CYLINDROSPERMOPSIS RACIBORSKII

LIU Rui, BAI Fang, RAN Xiao-Fei, YANG Yan-Jun, YANG Song-Qi, SHI Jun-Qiong and WU Zhong-Xing
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region (Ministry of Education), Chongqing Key Laboratory of Plant Ecology and Resources Research in Three Gorges Reservoir Region, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

In this study, we investigated the effects of N-phenyl-2-naphthylamine, a type of allelochemical, on the invasive cyanobacteria Cylindrospermopsis raciborskii. We measured the growth, the activities of antioxidative enzymes, and polyphasic Chl. a fluorescence transients of Cylindrospermopsis raciborskii that was cultured in the presence of N-phenyl-2-naphthylamine at different concentrations (0, 0.05, 0.10, 0.50, 1.00 and 2.00 mg/L). When the concentration of N-phenyl-2-naphthylamine was higher than 0.50 mg/L, the Chl. a content was significantly lower than the control. This indicated that the level of Chl. a could be reduced by the increase in N-phenyl-2-naphthylamine. The EC50of N-phenyl-2-naphthylamine on C. raciborskii was 1.02 mg/L after a 72h exposure. At the concentration lower than 0.50 mg/L, N-phenyl-2-naphthylamine caused a significant increase in a variety of parameters of polyphasic Chl. a fluorescence transients, including the maximum quantum yield of primary photochemistry (φPo), the density of RCs(RC/CSo), the performance index on absorption basis (PIABS), and the performance index on cross section basis (PICS). One exception was ψothat declined in the presence of low concentration of N-phenyl-2-naphthylamine. On the other hand, φPo, RC/CSo, PIABS, PICS, and ψowere all reduced when the concentration of N-phenyl-2-naphthylamine was higher than 0.50 mg/L (eg. 1.00 mg/L and 2.00 mg/L). These data suggested that low dose of N-phenyl-2-naphthylamine might promote the photosynthetic efficiency of C. raciborskii, while high dose could reduce density of RCs and harm the PS Ⅱ and electron transfer, and thus result in the inhibition of photosynthetic efficiency in C. raciborskii. Compared to the control, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX) were all obviously elevated along with the increase in N-phenyl-2-naphthylamine concentration. This implied that C. raciborskii might counter the damage of N-phenyl-2-naphthylamine with enhanced antioxidant enzymatic activities. In conclusion, N-phenyl-2-naphthylamine could inhibit the growth of C. raciborskii by disrupting the electron transfer of PS Ⅱ and lowering the density of RCs, and therefore it could be considered as a potential compound for the control of Cylindrospermopsis blooming.

Photosynthesis; Cylindrospermopsis raciborskii; Antioxidative system; Allelochemical compound

Q948.11

A

1000-3207(2015)04-0774-08

10.7541/2015.101

2014-06-30;

2014-09-18

中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目(XDJK2014D015); 西南大學博士基金(SWU110065); 國家自然科學基金(31170372)資助

劉瑞, (1989—), 男, 湖北建始人; 碩士研究生; 主要從事藻類生態學研究。E-mail: 20081989liurui@163.com

吳忠興(1975— ), 男, 教授; 主要從事藻類生理生態及分子系統學研究。E-mail: wuzhx@swu.edu.cn