酸堿度對重組魚腥藻脂肪氧合酶構象與活性的影響

汪曉鳴，朱筱玉，張 充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新

（南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

酸堿度對重組魚腥藻脂肪氧合酶構象與活性的影響

汪曉鳴，朱筱玉，張 充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

以重組表達、純化得到的魚腥藻脂肪氧合酶為研究對象，通過測定魚腥藻脂肪氧合酶在不同緩沖體系中分子構象的變化（主要研究二級結構，螺旋、折疊、轉角和無序結構單元質量分數），分析了魚腥藻脂肪氧合酶分子構象變化與不同緩沖體系之間的關系，探求魚腥藻脂肪氧合酶構象變化與生物酶學特性之間的關系。研究結果表明，該酶的最適反應pH值為9，最穩定pH值為7；發現在不同緩沖體系中，魚腥藻脂肪氧合酶的相對活性變化和螺旋結構、轉角結構、無序結構有密切關系。在pH值為6～9時，酶活性與螺旋結構、轉角結構總體呈正相關，但與折疊結構的質量分數變化呈負相關。最穩定的酶的二級結果是折疊結構、無序結構、螺旋結構和轉角結構，其質量分數均在20%～30%。

脂肪氧合酶；酶活性；二級結構；緩沖溶液

編者按：酶技術與發酵技術是被人類最早應用的生物技術。酶技術在食品加工制造、食品添加劑制造、功能因子提取分離等食品工業重要領域的產品開發、生產技術和檢測技術發展等方面發揮重要作用。本期選擇了酶構象與活性關系、酶催化合成代替化學催化和酶固定化3個重要研究方向的3篇論文，分別研究了以重組表達、純化得到的魚腥藻脂肪氧合酶分子構象變化與不同緩沖體系之間的關系，以及構象變化與生物酶學特性之間的關系；采用表面活性劑膠束溶液提高假絲酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的催化效率；以殼聚糖-戊二醛共價交聯法制備固定化風味蛋白酶及其酶學特性。希望此方面的研究能為相關酶學研究、綠色制備食品添加劑和酶固定化技術等工作提供有益借鑒。（主持人：曹雁平教授）

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）（EC1.13.11. 12）屬于氧化還原酶，是一種單一多肽鏈，含非血紅素鐵的蛋白質，能專一催化具有順，順-戊二烯結構的多不飽和脂肪酸，通過分子內加氧，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化衍生物。它不僅廣泛存在于動、植物細胞中，在藻類、面包酵母、真菌以及氰細菌中均發現有LOX的存在［1-4］。在大豆脂肪氧合酶的初級結構中，能夠觀察到一個區域，該區域富含組氨酸的殘基。通過研究，證明了鐵原子中心活性位點包含有兩種類型的配體:1個外源配體和5個內源配體，內源配體包括3種組氨酸殘基（His 499，His 504，His690），1個Ile839殘基以及1個Asn694，外源配體為水分子［5-7］。

蛋白質的構象與其生物功能有密切的相關性，理論研究表明，酶蛋白分子的空間結構即使發生極其細微的變化，也能夠極大地影響酶蛋白的生物活性，并且酶蛋白的生物活性功能依賴于結構的運動性［8-9］。酶的二級結構多指肽鏈有規則的盤旋折疊所形成的構象，主要包括螺旋、折疊、轉角和無序結構，這些結構主要依靠—NH—，—C==O形成的氫鍵使其結構穩定［10］。圓二色（circular dichroism，CD）光譜法是研究稀溶液中蛋白質結構的一種有效方法，它能靈敏地反映出蛋白質構象的變化。圓二色的產生是由光學活性物質對左右圓偏振光的吸光率的變化引起的，一般手性物質的圓二色性與波長有關，對手性物質按照一定的波長掃描即能得到其CD光譜圖，從圖譜上可以了解其分子及結構上的手性特性。通過肽鍵連接而成的蛋白質是具有特定結構的生物大分子，其圓二色性主要由活性生色基團及折疊結構兩方面圓二色性的總和［11-13］。CD光譜在預測、分析蛋白質結構方面發揮著重要作用。目前，研究LOX酶活與二級結構含量之間相關性的研究較少，關于pH值和溫度對脂肪氧合酶構象的影響尚未見報道。有研究表明，螺旋含量下降，折疊含量增加，與酶的鈍化有相關性。

Casey等［14］提出重組脂肪氧合酶將成為食品加工領域研究中的前沿。然而，至今為止，還未曾有高效表達脂肪氧合酶的報道。Zhang等［15］通過從魚腥藻中獲得LOX基因，并在B.subtilis中表達，獲得了高活性的重組LOX。在面團中加入LOX后巰基減少，增加了谷朊蛋白大分子的含量和促進了谷朊蛋白間二硫鍵的形成，因而使面團的筋力提高。

本研究以重組表達、純化得到的魚腥藻脂肪氧合酶（Anabaena Sp.Lipoxygenase，ana-rLOX）為研究對象，通過測定ana-rLOX在不同緩沖體系中，螺旋、折疊、轉角和無序結構等分子構象的變化，分析ana-rLOX分子構象變化與不同緩沖體系之間的關系，探求ana-rLOX構象變化與生物酶學特性的關系，期望從分子構象的變化解釋酶學特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

亞油酸（LA）和高純度-［4-吡啶基-1-氧］-N-叔丁基氮酮，均購自西格瑪公司（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MA，USA）；ana-rLOX，本實驗室重組、發酵、表達和純化。

1.2 實驗儀器

J-810型圓二色光譜儀（CD），日本Jasco公司；2450型分光光度計，日本Shimadzu公司；EMX型電子自旋共振波譜儀，德國Bruker公司；LightCycler?480系統，瑞士Roche公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ana-rLOX酶活的測定

ana-rLOX活力的測定按Axelrod等［16］方法進行，利用分光光度計測定亞油酸在脂肪氧合酶催化下形成的共軛二烯產物，在234 nm波長下吸光值的變化。1個活性單位（U）的酶定義為在25℃條件下每1 min產生1 μmol的共軛雙鍵所需要的酶量。

1.3.2 ana-rLOX酶學性質研究

1）ana-rLOX最適反應pH值的確定。分別用pH值為4，5，6，7，8，9，10（0.05 mol/L PBS緩沖液以及Tris-HCl緩沖液）的緩沖液將酶液稀釋10倍，加入底物亞油酸，在25℃條件下，測定ana-rLOX在不同pH值條件下的酶活性，重復3次。

2）ana-rLOX的pH值穩定性分析。將anarLOX液的pH值調至6，7，8，9，10，4℃下放置5 h后，于pH值為9.0、25℃條件下測定ana-rLOX的酶活，重復3次。

1.3.3 CD光譜測定

采用圓二色光譜儀測定樣品，質量濃度為0.15 g/L，每次進樣量為400 μL，室溫25℃，掃描范圍為190～250 nm，分辨率為0.1 nm，掃描速度為100 nm/min，響應度為0.5 s，CD靈敏度為0.01×10-3，光譜帶寬為1.0 nm，所有CD數據均經過3次掃描，取平均值。

1.3.4 ESR法測定不同緩沖體系中ana-rLOX產生的自由基

取60 μL待測樣置于電子自旋共振波譜儀，ESR儀諧振腔，ESR測定條件中心磁場，0.347 6 T；微波功率，5 mW；微波頻率，9.7 GHz；調制頻率，100 kHz；調制幅度，2.00 G；溫度，室溫；掃描時間，60 s。

1.3.5 不同緩沖體系中ana-rLOX的高分辨率熔解分析

在96孔板中，將不同緩沖體系的ana-rLOX與羅氏染料混合，采用LightCycler?480系統進行熔解曲線分析，得到熔解溫度Tm。

1.3.6 不同緩沖體系對ana-rLOX構象的影響實驗

采用圓二色譜法，分別用pH值為4，5，6，7，8，9，10（0.05 mol/L PBS緩沖液以及Tris-HCl緩沖液）的緩沖液將酶液稀釋10倍，加入相對應pH值的底物，在25℃下，測定ana-rLOX在不同pH值條件下的二級結構的變化。

1.3.7 實驗設計與數據處理

實驗結果使用SAS軟件進行方差和顯著性分析（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 ana-rLOX的最適反應pH值及pH值穩定性分析

將酶置于不同pH值的緩沖液體系中，其余條件不變，測定ana-rLOX的活性，結果如圖1。由圖1可見，當pH值在4～10時，ana-rLOX的酶活力呈先上升后下降的趨勢；當pH值大于9以后，酶活力急劇下降，當pH值為10時，酶活力相對于pH值為9時，降至5%；當pH值為7～9時，酶活力迅速升高。當pH值為9時，酶活達到最大值5.59×104U/mL，因此該酶的最適反應pH值為9。

圖1 ana-rLOX最適反應pH值Fig 1 Effect of pH on activity of ana-rLOX

將ana-rLOX置于不同pH值的緩沖體系中，4℃放置5 h后測定剩余酶活力，以未經處理的酶活力為100%，結果如圖2。圖2結果顯示，ana-rLOX在pH值為7～8的范圍內比較穩定，剩余的相對酶活均在75%以上；當pH值低于7或大于8時，剩余酶活呈顯著降低趨勢。當pH值為9時，剩余的相對酶活降至18.77%；當pH值為6時，剩余的相對酶活降至6。說明該酶對pH值小于7的酸或者pH值大于9的強堿比較敏感。雖然酶的最適反應pH值為9，但當酶在pH值為9的緩沖體系中，其狀態并不穩定，酶活降至18.77%，說明pH值為9時，ana-rLOX的結構適合酶與底物的反應最大化，但并不適合酶的保存。

圖2 ana-rLOX pH值穩定性Fig.2 Effect of pH on activity stability of ana-rLOX

2.2 不同緩沖體系中ana-rLOX產生的自由基

電子自旋共振（ESR）法是唯一可以直接測定自由基的方法，本實驗通過對ana-rLOX在不同緩沖體系中酶促反應的監測，觀察酶促反應自由基產生量的差異，為確定ana-rLOX的最適反應pH值提供理論依據。自由基產生量的多少表現在波譜上為信號強弱，即峰高；圖3顯示了ana-rLOX在不同緩沖體系中酶促反應的ESR譜。當ana-rLOX在pH值7、pH值10的緩沖體系中時，并未檢測到明顯的自由基信號；采用分光光度法檢測酶活時，在pH值7和pH值10的緩沖體系中是有酶活體現的，但是酶活較低。分析原因，可能是由于其酶促反應產生的自由基的量低于ESR檢測限，因此沒有被體現出來。當ana-rLOX在pH值8緩沖體系中時，能明顯檢測到自由基信號；當ana-rLOX在pH值9緩沖體系中時，自由基信號非常強；這一趨勢與用分光光度法檢測的ana-rLOX的酶活變化趨勢相一致，因此，anarLOX的最適反應pH值為9。

2.3 不同緩沖體系中ana-rLOX的熔解分析

在一定條件下，蛋白質的穩定性可以用蛋白質熔解的方法來測定，蛋白質的穩定性與蛋白質的熔解溫度Tm值相關。改變蛋白質的測試條件，其Tm值將會隨之改變，從而反映出蛋白質穩定性的變化；蛋白質的熔解溫度Tm值越高說明蛋白質的穩定性越好。圖4顯示了ana-rLOX在不同緩沖液體系中的熔解曲線和熔解溫度，可以觀察到隨著pH值的升高，ana-rLOX的熔解溫度呈先上升后下降的趨勢。當pH值為7時，熔解溫度最高，為58℃，說明在pH值為7時，ana-rLOX的穩定性最好。這個結果與用分光光度法測得的ana-rLOX的pH值穩定性結果一致。那么，在不同pH值條件下ana-rLOX的結果究竟發生了如何變化，從而影響了酶的活性和穩定性呢？

圖4 ana-rLOX在不同緩沖體系中的熔解溫度Fig.4 Tmof ana-rLOX treated by different buffer

2.4 不同緩沖體系對ana-rLOX構象的影響

2.4.1 不同緩沖體系對ana-rLOX遠紫外區CD光譜的影響

圖5中給出不同緩沖體系處理的ana-rLOX的CD光譜，從CD光譜曲線中可以觀察到195 nm處的正峰以及208，222 nm處的兩個負峰，它們由多肽鏈的酰胺π-π和n-π躍遷所致，屬于a-螺旋結構［17］。由圖5可知，不同緩沖體系對ana-rLOX的CD光譜的影響程度不同，在不同緩沖體系中的anarLOX的CD光譜曲線，譜峰峰位和峰高均發生了不同程度的變化。

圖5 不同緩沖體系中ana-rLOX的CD光譜Fig.5 CD spectra of ana-rLOX treated by different buffer

不同緩沖體系中的ana-rLOX的CD光譜在195nm處的正峰峰位，在pH值為5和9時此峰位上沒有明顯正峰，在pH值為6，7，8時，此正峰峰位發生紅移，從pH值為6時的195 nm紅移至pH值為7、pH值為8的198 nm，紅移了3 nm；并且正峰峰高在pH值為7時達到最高，隨后下降。

不同緩沖體系中的ana-rLOX的CD光譜在208，222 nm處的負峰峰位有不同程度的藍移。pH值為5，6時，在208 nm處沒有負峰；pH值為8時負峰峰高最大，并隨著pH值的增加，峰高減少明顯。圓二色光譜變化表明，在不同緩沖體系中的anarLOX的螺旋的質量分數有不同程度的變化，說明了不同pH值條件下，由于離子的作用使ana-rLOX二級結構各單元之間發生轉化，從而導致酶的活性和穩定性發生變化。

2.4.2 不同緩沖體系對ana-rLOX二級結構的影響

表1是利用CONTINLL軟件計算ana-rLOX在不同緩沖體系中的二級結構的變化情況。由表1可知，ana-rLOX在不同緩沖體系中各二級結構的質量分數變化關系。

表1 不同緩沖體系對ana-rLOX二級結構的影響情況Tab.1 Contents of secondary structures of ana-rLOX treated by different buffer%

1）螺旋結構的質量分數的變化。隨著pH值的升高，螺旋的含量呈先降低后升高的變化趨勢，pH值為7時含量最低。2）折疊結構的質量分數變化。pH值為5，9，10時，折疊結構的質量分數均為0；pH值為8時，折疊結構的質量分數較pH值為7時有明顯降低，從25%下降至16%。3）轉角結構的質量分數變化。隨著pH值的升高，轉角結構的質量分數呈先降低后升高的變化趨勢，pH值為6，7時，質量分數相同且最低；pH值為9時增幅最大。4）無序結構的質量分數變化。pH值為5時，無序結構的質量分數最高；pH值為6～9時，隨著pH值的升高，無序結構的質量分數也隨之升高，在pH值為9時的增幅最大。

總體來看，ana-rLOX二級結構的質量分數變化主要體現在折疊結構的轉化，螺旋結構、轉角結構與無序結構的質量分數隨之發生變化。

2.4.3 緩沖體系對ana-rLOX相對活性和二級結構的影響

圖6表示了ana-rLOX的相對活性和各二級結構的質量分數隨pH值的變化情況。在pH值為6～9時，ana-rLOX的相對活性變化和螺旋結構、轉角結構變化總體呈正相關，與折疊的質量分數變化呈負相關。最穩定的酶的二級結構是折疊結構、無序結構、螺旋結構和轉角結構，其質量分數均在20%～30%。螺旋和折疊是維系蛋白空間結構的骨架，其結構中存在大量氫鍵，因此使其二級結構具有一定的穩定性；轉角和無序結構中氫鍵只有很弱的作用，使各個殘基間有更大的自由度，表現出極大的柔性。當蛋白處于不同的緩沖體系中時，蛋白分子的電荷分布發生改變，同時生物介質中的非極性分子發生位移極化，使極性分子發生取向極化。在不同的緩沖體系中，蛋白二級結構各組分的質量分數發生轉化，是由于酶蛋白分子內部電荷分布的變化，使原有維系其螺旋和折疊結構穩定性的氫鍵取向發生改變［18-20］。

圖6 不同pH值對ana-rLOX二級結構和酶活的影響Fig.6 Effects of different pH values on second structure and activity of ana-rLOX

目前，研究酶活和二級結構含量之間相關性的研究較少，關于pH值對脂肪氧合酶構象的影響尚未見報道。有研究表明，螺旋含量下降，折疊含量增加，與酶的鈍化有相關性，本研究結果也證實了這一點，即螺旋含量與酶活性成正相關，酶的穩定性與4種結構的平衡有關。

3 結 論

本研究首次對ana-rLOX的二級結構和pH值穩定性的關系進行了研究。通過分光光度法、ESR法和蛋白熔解確定該酶的最適反應pH值為9，最穩定pH值為7；通過圓二色譜法對ana-rLOX在不同緩沖體系的二級構象進行分析，發現在不同緩沖體系中，ana-rLOX的相對活性變化和螺旋結構，轉角結構和無序結構有密切的關系。在pH值為6～9時，酶活性與螺旋結構、轉角結構總體呈正相關，但與折疊結構的質量分數變化呈負相關。折疊的減少使酶活增加，但酶穩定性變差。最穩定的酶的二級結構是折疊結構、無序結構、螺旋結構和轉角結構，其質量分數均在20%～30%。

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Effect of Different pH on Activity and Conformation of Ana-rLOX

WANG Xiaoming，ZHU Xiaoyu，ZHANG Chong，Lü Fengxia，BIE Xiaomei，LU Zhaoxin*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

The conformations of Anabaena Sp.lipoxygenase（ana-rLOX），such as secondary structure，helical structure，turn structure，and disordered structure were studied in different pH buffers.The correlation between the activity and conformation of ana-rLOX was studied.The results showed that the optimal pH and the most stable pH of ana-rLOX were 9 and 7.The enzyme activity was correlated with the content of helical structure，turn structure，and disordered structure.The enzyme activity positively correlated with the helical structure and turn structure while the enzyme activity negatively correlated with the disordered structure under the pH value between 6 and 9.The enzyme was most stable when the contents of helix，sheet，turn，and random structures were 20%-30%.

lipoxygenase；enzyme activity；secondary structure；buffer solution

葉紅波）

TS201.3；TS202.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.004

2095-6002（2015）04-0016-06

汪曉鳴，朱筱玉，張充，等.酸堿度對重組魚腥藻脂肪氧合酶構象與活性的影響［J］.食品科學技術學報，2015，33（4）:16-21.

WANG Xiaoming，ZHU Xiaoyu，ZHANG Chong，et al.Effect of different pH on activity and conformation of ana-rLOX［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:16-21.

2015-04-22

國家自然科學基金資助項目（31470095）。

汪曉鳴，女，助理研究員，博士，主要從事食品生物技術方面的研究；

*陸兆新，男，教授，博士，主要從事食品微生物與生物技術方面的研究。

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