殼聚糖固定化風味蛋白酶的制備及其酶學特性

師廣波，馬艷芳，鄭明剛，孫中濤，*

（1.山東農業大學生命科學學院，山東泰安 271018；2.國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室，山東青島 266000）

殼聚糖固定化風味蛋白酶的制備及其酶學特性

師廣波1，馬艷芳1，鄭明剛2，孫中濤1，*

（1.山東農業大學生命科學學院，山東泰安 271018；2.國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室，山東青島 266000）

研究了球形交聯殼聚糖固定化風味蛋白酶的制備工藝及其酶學特性。以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯劑，采用共價交聯法制備固定化風味蛋白酶的較適條件為ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%、ω（戊二醛）=0.5%，交聯時間6 h，載體中ω（酶）=40 mg/g，于35℃、pH值5.5條件下固定化反應10 h。固定化后，風味蛋白酶較適反應溫度從50℃提高至70℃，較適pH值從7.0 提高至8.0，且可在更寬溫度與pH值范圍內保持較高的酶活力。固定化風味蛋白酶具有良好的儲存穩定性和操作穩定性，可反復多次使用，適宜于在工業生產中推廣應用。

風味蛋白酶；固定化；球形交聯殼聚糖；酶學特性

風味蛋白酶是由米曲霉發酵產生，再經固液分離、超濾濃縮和噴霧干燥等工序精制而成的一種蛋白酶制劑，除具有內切酶活性外，還具有外切蛋白酶的活性，可作用于肽鏈C端或N端的疏水性氨基酸形成的肽鍵，使其水解成游離氨基酸［1-3］。在食品工業中，風味蛋白酶廣泛應用于各種動植物蛋白質的水解，具有提高水解產物的水解度和游離氨基酸含量、減輕或脫除苦味、增強和改善風味的作用［4-7］。例如，Benjakul等［8］用風味蛋白酶水解美國白對蝦，不僅提高了水解物的產量，而且改善水解液的風味；Tsou等［9］利用風味蛋白酶水解大豆分離蛋白，不僅提高了水解度，而且減輕了大豆肽的苦味；謝章斌等［10］采用風味蛋白酶對鵝肝醬中的蛋白質進行可控水解，顯著降低了鵝肝醬的腥味和異味；張根生等［11］利用風味蛋白酶水解脫脂碎肉粉，水解度高達30.13%，游離氨基酸含量顯著提高，改善了產品風味。

目前，國內外對風味蛋白酶的研究與應用主要集中于游離態的風味蛋白酶，而對其固定化技術與固定化酶的應用研究較少。風味蛋白酶價格較高，采用游離態的風味蛋白酶對動植物蛋白進行水解時，酶與底物分離困難，不能重復利用，且酶促反應的進程不易控制，這限制了風味蛋白酶在食品工業中的應用［12］。與游離酶相比，固定化酶穩定性好、酶促反應過程的可控性高，生產工藝相對簡單，酶與底物容易分離，可重復利用，節約生產成本［13-14］。因此，采用適宜的載體對風味蛋白酶進行固定化，改善其應用特性，降低應用成本，可以拓展風味蛋白酶在食品工業中的應用范圍。本實驗采用殼聚糖為載體，以戊二醛為交聯劑，對風味蛋白酶進行固定化，并對其酶學特性進行了研究，旨在為固定化風味蛋白酶在食品工業中的規?；瘧锰峁├碚撘罁?。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（脫乙酰度≥90.0%）、福林試劑，北京索萊寶科技有限公司；Flavourzyme500MG型粉末狀風味蛋白酶，諾維信生物技術有限公司；戊二醛（w=25%水溶液），中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

DHZ-D型恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司；PHSJ-4A型pH計，上海雷磁儀器廠；Spectrumlab S22型可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；JA1003型電子天平，上海恒平科學儀器有限公司。

1.3.1 固定化風味蛋白酶制備條件的優化

稱取一定質量的殼聚糖，加入一定體積ω（乙酸）=2%水溶液，攪拌至呈透明膠液狀，用注射器逐滴注入ω（NaOH）=3%的水溶液中，固化2 h，傾去NaOH溶液，用蒸餾水將殼聚糖球狀載體洗至中性，再以ω（戊二醛）=0.5%的水溶液于室溫下交聯6 h，然后用蒸餾水洗去戊二醛殘液，即制得交聯殼聚糖球載體［15］；向載體中加入風味蛋白酶溶液，于4℃固定12 h，再用蒸餾水洗掉未被固定的酶分子，抽干，置于4℃冰箱中保存備用。采用單因素實驗設計，依次采用不同質量分數的殼聚糖和NaOH溶液制備載體，評測其形狀與機械強度，以確定較佳殼聚糖和NaOH質量分數。戊二醛質量分數和交聯反應時間是影響載體活化程度的重要因素，將固化好的殼聚糖載體分別加入到不同質量分數的戊二醛溶液中（ω=0.1%～2%），于常溫下交聯反應2～12 h，然后評測其對風味蛋白酶的固定化能力，以確定較佳戊二醛質量分數和交聯反應時間。給酶量、固定化反應時間、溫度、pH值是影響活化后的殼聚糖載體對風味蛋白酶固定化能力的重要因素，依次采用單因素實驗設計對載體中酶的質量分數（20～80 mg/g）、固定化反應時間（2～12 h）、溫度（5～55℃）和pH值（pH值3.5～8.5）進行優化，以確定固定化反應的較佳條件。

1.3.2 固定化風味蛋白酶的酶學性質

以酪蛋白為底物，分別于不同溫度和pH值下測定固定化風味蛋白酶的酶活力，以確定固定化風味蛋白酶的較佳酶促反應溫度與pH值。將固定化酶置于室溫下（25℃），每隔5 d取樣并測定其酶活力，以評價其儲存穩定性；連續多次用固定化酶于55℃水解大豆分離蛋白，每次水解時間3 h，水解完畢，濾出固定化酶，用蒸餾水沖洗干凈，然后測定殘留酶活力，以評價其操作穩定性。

1.3.3 固定化風味蛋白酶活力的測定

采用福林酚法（GB/T 23527—2009）。在40℃、pH值7.5的條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位，以U表示。相對酶活力以各組實驗的較高酶活力為100%進行折算.

2 結果與分析

2.1 風味蛋白酶較佳固定化條件的優化

人胚腎細胞（HEK293細胞）由吉林農業大學動物科學技術學院分子免疫實驗室提供。以含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素混合液的DMEM培養液在恒溫37℃、5%CO2的培養箱中培養。每2 d換液，待細胞密度達75%～85%用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數生長期細胞用于實驗。

2.1.1 殼聚糖和NaOH質量分數的影響

隨機取10粒殼聚糖載體夾在兩蓋玻片中間，在蓋玻片上放置適量砝碼擠壓載體，觀察載體有無變形破裂，以此來表示載體的機械強度。制備殼聚糖載體時，殼聚糖與NaOH質量分數對載體的成型性和機械強度的影響如表1。

表1 殼聚糖與NaOH質量分數對殼聚糖載體形狀與機械強度的影響Tab.1 Effects of chitosan and NaOH concentrations on shape and mechanical strength of chitosan carrier

殼聚糖質量分數主要影響載體的成型性和機械強度，殼聚糖質量分數較低時，載體的成型性和機械強度較差。增加殼聚糖質量分數可以提高成球性能和機械強度，但殼聚糖質量分數過高時，向NaOH中滴加時有拖尾現象，所形成的載體呈蝌蚪狀。

NaOH質量分數主要影響載體的固化速度，NaOH質量分數較低時，載體固化速度慢，在重力的作用下發生形變，呈扁球狀或橢球狀，如圖1。

圖1 不規則形狀的殼聚糖載體Fig.1 Irregular shape chitosan carriers

當ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%時，所形成的殼聚糖載體呈規則球形，機械強度大，再增加殼聚糖質量分數，會出現拖尾現象，而再增加NaOH質量分數，對載體的形狀和機械強度的影響不再明顯。因此選擇ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%為較佳濃度。

2.1.2 戊二醛質量分數和載體活化時間的影響

交聯劑戊二醛的質量分數與殼聚糖載體的活化時間影響載體上活性基團數量，從而影響其固定化能力。戊二醛質量分數與活化時間對載體固定化能力的影響結果如圖2。

圖2 戊二醛質量分數與活化時間對固定風味蛋白化酶相對活力的影響Fig.2 Effects of glutaraldehyde concentration and activation time on relative activity of immobilized flavourzyme

圖3 載體中酶的質量分數對固定化酶活力的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on relative activity of immobilized flavourzyme

ω（戊二醛）=0.5%時，固定化酶的活力較大，再增大戊二醛的質量分數，酶活力反而下降。其原因是戊二醛質量分數較小時，殼聚糖載體上的活性基團數量少，固定化能力低；但戊二醛質量分數過高時，殼聚糖分子上的氨基與戊二醛發生分子內或分子間交聯，導致載體與酶的結合能力降低。隨著活化時間的延長，載體偶聯的戊二醛數量增加，固定化能力增強，并在第6 h時達到較大值，此時，偶聯反應已經平衡，再增加活化時間，載體上偶聯的戊二醛數量不再增加。

2.1.3 載體中酶的質量分數對固定化酶活力的影響

載體中酶的質量分數對固定化酶活力的影響如圖3。

由圖3知，固定化酶活力隨著載體中酶的質量分數的增加而逐漸增大，并在載體中酶的質量分數為40 mg/g載體時達到較大值，此后，再增加載體中酶的質量分數，固定化酶活力的變化趨于平緩并有不同程度的下降。其原因是載體上的活性基團數量是一定的，當活性位點被酶分子全部占據后，再增加載體中酶的質量分數，被固定的酶分子數量不再增加，且過多的酶分子會在載體網格內聚集，產生空間位阻，影響酶與底物的正常結合，另一方面也會對固定化蛋白酶有一定的水解作用，從而導致固定化酶活力下降［16］。

2.1.4 固定化反應時間的影響

固定化時間對固定化酶活力的影響如圖4。

圖4 固定化反應時間對固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of immobilization reaction time on relative activity of immobilized flavourzyme

隨著固定化反應時間的增加，固定化酶活力逐漸增大，并在10 h時達到較大值，再延長反應時間，固定化酶活力不再增加。因此，較佳固定化反應時間為10 h。

2.1.5 固定化反應溫度和pH值的影響

固定化反應溫度和pH值對固定化酶活力的影響如圖5。溫度較低時，殼聚糖載體上的醛基與酶蛋白上的氨基反應速度慢，被固定化的酶分子少，固定化酶活力較低。提高固定化反應的溫度，可以提高固定化酶活力，并在35℃時達到較大值。再提高反應溫度，固定化酶活力反而下降，其原因是溫度較高時，酶蛋白的穩定性差，容易變性失活。固定化反應的pH值對固定化酶活力的影響如圖5b，pH值的變化對固定化酶活力影響很大，其原因是反應體系的pH值直接影響殼聚糖載體和酶蛋白的解離狀態，從而影響載體與酶蛋白的結合量。pH 5.5是固定化反應的較佳pH值，此時固定化酶活力較大。

圖5 固定化溫度與pH值對固定化酶活性的影響Fig.5 Effects of temperature and pH on relative activity of immobilized flavourzyme

2.2 固定化風味蛋白酶的特性

2.2.1 較適反應溫度與pH值

風味蛋白酶固定化后，較適反應溫度與pH值發生了變化，如圖6。

圖6 固定化風味蛋白酶的較適溫度與pH值Fig.6 Optimum temperature and pH of immobilized flavourzyme

游離酶與固定化酶在50～70℃范圍內，均有較高的酶活性，但游離酶的較適反應溫度為50℃，固定化酶的較適反應溫度為70℃。酶固定化后較適反應溫度升高的原因是酶分子與載體結合后，熱穩定性提高，熱變性失活速率下降。風味蛋白酶固定化后，較適pH值向偏堿的方向移動。游離酶在pH值7.0時酶活力較高，且較適pH值范圍較窄；而固定化酶在pH值8.0時酶活力較高，且在pH值7.5～9.0的范圍內均能保持較高的酶活力。

2.2.2 固定化酶的儲存穩定性與操作穩定性

與游離蛋白酶相比，固定化風味蛋白酶具有較好的儲存穩定性與操作穩定性，如圖7。

游離酶儲存10 d后酶活力損失95%以上，而固定化酶儲存10 d后，酶活力僅損失30%，儲存30 d后酶活力仍殘留51.9%。風味蛋白酶固定化后可以反復多次使用，并表現出較好的操作穩定性。重復使用5次，酶活力僅損失16%，重復使用11次，殘留酶活力仍為56.7%；同時，球形載體仍保持較好的韌性，未見有破碎或變形現象。良好的儲存與操作穩定性，有利于固定化風味蛋白酶在食品工業中的推廣與應用，可以延長使用時間、增加使用次數，降低生產成本。

圖7 固定化風味蛋白酶的儲存穩定性與操作穩定性Fig.7 Storage and operational stability of immobilized flavourzyme

3 結 論

可用于制備固定化酶的載體很多，但殼聚糖載體由于化學性質穩定，機械強度高、比表面積較大、孔隙率高、內擴散阻力小，被認為是較有工業應用潛力的固定化酶載體［17］。以殼聚糖為載體、戊二醛為交聯劑，采用共價交聯法制備固定化風味蛋白酶的較適條件為ω（殼聚糖）=2.5%、ω（NaOH）=3%、ω（戊二醛）=0.5%，交聯時間6 h，載體中酶的質量分數40 mg/g載體，于35℃、pH 5.5條件下固定化反應10 h。固定化后，風味蛋白酶較適反應溫度從50℃提高至70℃，較適pH值從7.0提高至8.0，且可保持較高酶活力的溫度與pH值范圍均有所擴大。

固定化風味蛋白酶保持了游離酶的高效、專一及溫和的酶催化特性，具有良好的儲存穩定性和操作穩定性，可反復多次使用，分離回收容易，使用效率高；酶反應過程可以控制，大大簡化了生產工藝，適宜于在工業生產中推廣應用。

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Preparation and Properties of Immobilized Flavourzyme on Globular Cross-linked Chitosan

SHI Guangbo1，MA Yanfang1，ZHENG Minggang2，SUN Zhongtao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2.Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique of State Oceanic Administration，Qingdao 266000，China）

The preparation and properties of immobilized flavourzyme on globular cross-linked chitosan，with glutaraldehyde as crosslinking agent，were investigated.The optimal concentration of chitosan，NaOH and glutaraldehyde was 2.5%，3%，and 0.5%，respectively，and the optimal crosslinking time was 6 h.The optimal flavourzyme dosage was 40 mg/g carrier，and the optimal immobilizing reaction temperature，pH，and time was 35℃，pH 5.5，and 10h，respectively.After immobilized，the optimal reaction temperature of flavourzyme was improved from 50℃to 70℃，and the optimal pH value was improved from 7.0 to 8.0.Moreover，the ranges of temperature and pH for keeping the higher enzyme activity had been extended.The stability of storage and operation of the immobilized flavourzyme was good enough to be reused for many times，which suggested that the immobilized flavourzyme was suitable for the wide applications in industry.

flavourzyme；immobilization；globular cross-linked chitosan；enzymatic properties

李 寧）

TS201.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.006

2095-6002（2015）04-0027-06

師廣波，馬艷芳，鄭明剛，等.殼聚糖固定化風味蛋白酶的制備及其酶學特性［J］.食品科學技術學報，2015，33（4）:27-32.

SHI Guangbo，MA Yanfang，ZHENG Minggang，et al.Preparation and properties of immobilized flavourzyme on globular cross-linked chitosan［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:27-32.

2014-09-21

國家海洋局海洋生物活性物質與現代分析技術重點實驗室開放基金資助項目（MBSMAT-2014-05）。作者簡介:師廣波，男，碩士研究生，研究方向為發酵工程與酶工程；

*孫中濤，男，副教授，博士，主要從事發酵工程與酶工程方面的研究。

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