表面活性劑存在下兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯

錢俊青，李尚謙，仲 翔，郭 輝

（浙江工業大學藥學院，浙江杭州 310032）

表面活性劑存在下兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯

錢俊青，李尚謙，仲 翔，郭 輝

（浙江工業大學藥學院，浙江杭州 310032）

為提高假絲酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的催化效率，采用兩相體系中加入表面活性劑形成膠束溶液，然后優化假絲酵母脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯工藝條件。研究表明，與不加表面活性劑的對照組相比，表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨存在的實驗組，反應的酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性均有明顯提升。假絲酵母脂肪酶在該體系中催化合成蔗糖-6-乙酯的優化工藝條件為：反應介質為仲丁醇/水，其中水質量分數為60%，表面活性劑的濃度為10 mmol/L，乙酸乙烯酯與蔗糖物質的量比為3∶1，反應pH值9，溫度35℃，反應時間4 h。在此反應條件下，得到蔗糖乙酯酯化率為71.2%，其中蔗糖-6-乙酯選擇性為56.4%。

表面活性劑；脂肪酶；酯化；蔗糖-6-乙酯

蔗糖-6-乙酯是合成三氯蔗糖的關鍵中間體［1-3］。三氯蔗糖是目前國內外市場需求量快速增長的功能性甜味劑，具有甜度高、無能量、味質好、安全性高等優點，是肥胖癥、心血管病和糖尿病患者理想的輔助治療產品，應用前景廣闊［4-6］。蔗糖有八個羥基，每個羥基都能被親電試劑?；?，產生不同取代位置、不同取代度的蔗糖酯，因此，如何選擇性高效合成蔗糖酯是國內外研究的難點。目前合成蔗糖酯常用化學法和酶法，化學法易于工業化生產，但由于蔗糖的8個羥基反應活性相近，所以酯化反應作用位點較難控制［7-8］，要得到特定位點酯化的單一產物往往比較困難，需要冗長的保護和去保護步驟；此外，化學合成中多種有毒試劑的使用在一定程度上降低了產品的食品安全性。這些弊端促使較多的學者將研究重點轉向酶法合成蔗糖酯。酶法合成可利用蔗糖直接酯化的方法，具有合成路線短，操作簡單，反應條件溫和等優點，而良好的區域選擇性更是酶催化合成的特色，因此酶法合成越來越被廣泛地研究和應用［9-11］。

已有文獻表明，在含水體系中可以進行酯化反應，而且通常反應在短時間內可以達到較大的酯化率［12-14］。由于蔗糖在水中的溶解度明顯高于有機溶劑，可顯著提高反應底物濃度，提高反應效率，因此，含水兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯具有良好的應用前景。據文獻報道，表面活性劑可以大大增加兩相體系中兩相間的合成反應速率，減少副反應的發生，增加目標化合物的選擇性［15-17］。表面活性劑在其濃度超過臨界膠束濃度（CMC）后會形成膠束，對有機相中的物質起到水相增溶作用，可擴大兩相界面間接觸，同時還受到局部濃集效應、靜電效應、極性效應等影響，能夠有效促進合成反應在兩相中的進行。本研究是采用水與有機溶劑兩相體系中加入表面活性劑形成膠束溶液，以假絲酵母脂肪酶進行催化反應，探索了假絲酵母脂肪酶在該體系中催化合成蔗糖-6-乙酯的工藝過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗糖及所有有機溶劑均為國產分析純；假絲酵母脂肪酶（candida rugosa lipase，CRL）（10 000 U/g），購于北京高瑞森科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；Alltech 3300型蒸發光檢測儀（ELSD），美國格雷斯公司；TH2-82A型恒溫水浴振蕩器，金壇市江南儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蔗糖-6-乙酯合成方法

將4 mmol蔗糖、0.1 g酶、12 mmol乙酸乙烯酯、0.1 mmol表面活性劑、6 mL蒸餾水、4 mL醇類溶劑置于50 mL具塞三角瓶中，放入恒溫搖床，180 r/min振蕩。35℃條件下反應5 h，每隔一定時間用6 mol/L NaOH調節反應液至初始pH值。

1.3.2 產物分析方法

采用高效液相色譜蒸發光散射檢測法（HPLCELSD）對產物進行分析。反應結束后，沸水浴5 min使得脂肪酶失活，其中反應液中的有機溶劑基本可揮發除去，將剩余的反應液定容至100 mL，膜過濾后進行高效液相分析，每組做3個平行實驗。色譜條件:ZORBAX SB-Aq 4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相:去離子水，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，進樣量5 μL。蒸發光檢測器溫度85℃，氮氣流速1.5 L/min。記錄色譜圖，計算酯化率和蔗糖-6-乙酯的選擇性，見式（1）、式（2）。

2 結果與分析

2.1 表面活性劑種類對反應的影響

表面活性劑的分子結構和極性是影響兩相體系膠束催化的重要因素。實驗組中分別加入陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、十二烷基硫酸鈉（SDS），非離子表面活性劑聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（Tween-80）、失水山梨糖醇脂肪酸酯（Span-80），以及不加表面活性劑的空白對照樣品，觀察在兩相體系中表面活性劑種類對蔗糖-6-乙酯合成的影響。實驗結果如表1。

表1 不同表面活性劑種類對合成蔗糖-6乙酯反應的影響Tab.1 Influences of different type of surfactants on synthesis of sucrose-6-acetate%

由表1可知，加入陽離子表面活性劑CTAB，酯化率比空白對照提高許多，原因一是因形成的膠束產生了反應界面擴大效應，使反應物之間接觸概率大增；二是因在偏堿性催化酯交換反應中，陽離子表面活性劑形成的膠束的正電荷能使反應中間體（帶負電荷）易于形成。同理，由于陰離子表面活性劑形成的膠束所帶的負電荷不利于反應中間體的形成，其酯化率比空白組有所下降。非離子表面活性劑形成的膠束不帶電，對中間體產生無影響，所得到的酯化率比空白組略有提高。同時，我們觀察到加入表面活性劑CTAB的實驗組具有較高的蔗糖-6-乙酯選擇性，因此，表面活性劑選擇為CTAB。

2.2 兩相體系中有機溶劑對反應的影響

在反應的水和有機溶劑兩相體系中，由于有機溶劑極性的差異，使其與底物形成不同空間取向的結合，從而使酶與底物形成不同的活性中間態而影響產物的生成。本實驗選取了無毒性的醇類有機溶劑作為反應介質，實驗結果如表2。

由表2可知，選擇仲丁醇-水兩相體系作為反應介質，合成蔗糖-6-乙酯時具有較高的酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性，這可能與仲丁醇的剛性結構有關。因此選取仲丁醇作為反應體系中的有機溶劑。

2.3 兩相體系中水質量分數對反應的影響

水質量分數是兩相體系中合成蔗糖酯的一個重要因素。相比于有機溶劑，蔗糖在水中具有非常好的溶解性，增加水質量分數可以提高反應體系的傳質，但水的存在也會引起反應底物乙酸乙烯酯和產物蔗糖-6-乙酯的水解。因此考察了水質量分數對酶催化合成蔗糖-6-乙酯的影響，實驗結果如圖1。

表2 有機溶劑對合成蔗糖-6-乙酯反應的影響Tab.2 Influences of organic solvents on synthesis of sucrose-6-acetate%

圖1 水質量分數對合成蔗糖-6-乙酯的影響Fig.1 Influences of water content on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖1可知，隨著體系中水質量分數的增加，反應產物酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性均有所提高，在水質量分數為60%時，酯化率達到最大；超過60%后，酯化率顯著下降，蔗糖-6-乙酯選擇性也有所下降。故體系中水質量分數確定為60%。

2.4 底物物質的量比對反應的影響

乙酸乙烯酯是較為活潑的?；w。在蔗糖轉酯化反應中，若乙酸乙烯酯的量超過一定的范圍，會繼續與產物蔗糖單酯發生反應，生成蔗糖多酯。因此乙酸乙烯酯的加入量會對反應產生重要的影響，選擇不同底物物質的量比（乙酸乙烯酯/蔗糖），考察其對蔗糖-6-乙酯合成的影響，實驗結果如圖2。

由圖2可知，隨著乙酸乙烯酯與蔗糖物質的量比的增加，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性同時升高，當物質的量比超過3時，蔗糖-6-乙酯選擇性開始下降，其原因是蔗糖分子上其他位羥基接觸到乙酸乙烯酯活性中間體的機會增加，影響選擇性，且過多的乙酸乙烯酯水解不利于對體系pH值的控制，也影響酯化率。因此實驗中采取底物物質的量比為3∶1。

2.5 體系pH值對反應的影響

pH值對酶的活性具有極為顯著的影響，通常酶只有在一定的pH值范圍內才能表現出活性。選用6 mol/L NaOH將去離子水的pH值調成一定梯度，考察體系pH值對蔗糖-6-乙酯合成的影響，實驗結果如圖3。

圖2 底物物質的量比對蔗糖乙酯合成的影響Fig.2 Influences of molar ratio of substrates on synthesis of sucrose-6-acetate

圖3 反應pH值對蔗糖-6-乙酯合成的影響Fig.3 Influences of pH on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖3可知，體系pH值對蔗糖-6-乙酯的合成影響較大。當pH值低于7時，即在偏酸性環境時，酯化率很低，然后隨著pH值的增大，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性都不斷上升。當pH值達到9.0時，酯化率和蔗糖6-乙酯選擇性同時達到最大，此后又隨著pH值的進一步增大，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性都出現較快下降。其原因是pH值過低或過高，都會使生成的蔗糖酯更易發生水解，并會使脂肪酶失活。

2.6 溫度對反應的影響

在酶催化反應中，溫度的改變直接影響著酶的催化活性。溫度過低時，酶催化活性較低，催化速率較慢；當溫度過高時，酶可能因為結構發生改變而失活。選擇不同的反應溫度，研究不同溫度條件下蔗糖-6-乙酯的合成情況，實驗結果如圖4。

圖4 反應溫度對酯化率的影響Fig.4 Influences of reaction temperature on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖4可知，隨著溫度的升高，酶的活性上升，當溫度達到35℃時，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性都達到最大。而后再升高溫度，酶活性開始下降，酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性也隨之下降。故選擇35℃為本反應體系中的最適反應溫度。

2.7 時間對反應的影響

在兩相體系中加入表面活性劑形成膠束反應體系，可以顯著地增加兩相間反應物的反應速率。因此，對不同時間酯化率以及蔗糖-6-乙酯選擇性的變化情況加以考察，實驗結果如圖5。

圖5 反應時間對酯化率的影響Fig.5 Influences of reaction time on synthesis of sucrose-6-acetate

由圖5可知，當反應達到4 h時，酯化率達到71.2%，蔗糖-6-乙酸酯選擇性為56.4%。隨著反應繼續，酯化率的變化不再明顯，這表明在本反應體系中比傳統有機溶劑中合成蔗糖酯的反應速率要快許多。4 h后蔗糖-6-乙酯選擇性下降較為明顯，其原因是生成的蔗糖單酯已轉化為蔗糖多酯，導致蔗糖-6-乙酯選擇性下降。

3 結 語

探索了表面活性劑存在下，在水-仲丁醇兩相體系中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酯的反應。發現加入表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）后，脂肪酶在膠束體系中催化合成蔗糖-6-乙酯較雙水相體系的酯化率和蔗糖-6-乙酯選擇性均有較大提升。經實驗優化的反應工藝條件為:反應介質為仲丁醇/水，其中水質量分數為60%，乙酸乙烯酯與蔗糖物質的量比為3∶1，反應pH值9.0，溫度35℃，反應時間4 h。在此反應條件下，得到蔗糖乙酯酯化率為71.2%，其中蔗糖-6-乙酯選擇性為56.4%。本研究的反應體系以及工藝優化條件可為酶法催化合成蔗糖-6-乙酯提供實驗依據，為進一步開發利用甜味劑三氯蔗糖提供理論指導。

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Enzymatic Synthesis of Sucrose-6-Acetate in Two-Phase Medium with Surfactant

QIAN Junqing，LI Shangqian，ZHONG Xiang，GUO Hui（School of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In order to increase the yield of sucrose-6-acetate which is catalysed by candida rugosa lipase，the method of this paper was that the surfactant was added into the two-phase system to formate the micelles，then use the candida rugosa lipase as catalyst to synthesis sucrose-6-acetate.The results showed that compared with the control group，the esterification rate and sucrose-6-acetate rate significantly increased in surfactant cetyltrimethyl ammonium bromide group.The optimum conditions as followed:reaction medium is butanol/H2O，content of water is 60%，the concentration of surfactant is 10 mmol/L，n（vinyl acetate）∶n（sucrose）is 3∶1，pH 9，reaction at 35℃for 4 h.The sucrose acetate esterification rate is 71.2%，the selectivity of sucrose-6-acetate is 56.4%.

surfactant；lipase；esterification；sucrose-6-acetate

葉紅波）

TS202；Q814.9

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.005

2095-6002（2015）04-0022-05

錢俊青，李尚謙，仲翔，等.表面活性劑存在下兩相體系酶法催化合成蔗糖-6-乙酯［J］.食品科學技術學報，2015，33（4）:22-26.

QIAN Junqing，LI Shangqian，ZHONG Xiang，et al.Enzymatic synthesis of sucrose-6-acetate in two-phase medium with sur factant［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:22-26.

2015-05-19

錢俊青，男，教授，博士生導師，主要從事食品酶法加工方面的研究。