苯酚-硫酸法測定花椒葉多糖含量

齊素芬，張華峰，姚 美，程 芳，王正齊，陳思雨

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西西安 710062）

苯酚-硫酸法測定花椒葉多糖含量

齊素芬，張華峰*，姚 美，程 芳，王正齊，陳思雨

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，陜西西安 710062）

建立了一種靈敏、特異、精確定量分析花椒葉多糖的苯酚-硫酸法，采用該方法測定了陜西大紅袍花椒葉中多糖的含量。該方法選擇半乳糖作為標準單糖，484 nm為工作波長。通過單因素實驗和正交試驗優化得到了較佳顯色反應條件是加樣次序為苯酚-樣品-濃硫酸，顯色溫度為25℃，質量分數為5%的苯酚添加量為0.3 mL，濃硫酸添加量為3.5 mL，顯色時間為30 min。系統適應性實驗顯示該方法的標準曲線方程為y=0.0127x-0.0076（R2=0.997），線性范圍為10.00～60.00 μg/mL，LOD和LOQ分別為2.08 μg/mL和6.30 μg/mL，日內、日間精密度分別在0.49%～3.64%，5.17%～6.05%之間，平均回收率為101.19%。樣品溶液在顯色反應后的2 h內穩定性較好。測定發現陜西大紅袍花椒葉中w（多糖）在8.11～8.89 mg/g之間。該方法為花椒葉多糖的定量分析和花椒葉資源的開發利用提供了參考。

花椒葉；多糖；苯酚-硫酸法；顯色反應

蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）植物花椒（Zanthoxylum bungeanum）的果皮是重要的傳統香料，在我國的種植面積約有21萬hm2［1］。國內外學者對花椒果皮中揮發性芳香油、生物堿、香豆素、類黃酮等的開發利用進行了廣泛研究［2-3］，但是對花椒葉資源的研究相對較少［1］?；ń啡~中含有蛋白質、氨基酸、脂肪、維生素、類黃酮等多種營養素和生物活性物質，在陜西省渭南市等很多地區作為蔬菜食用，但是目前對花椒葉多糖的研究卻較鮮見［1］。我們實驗室研究發現，花椒葉粗多糖具有抗氧化活性。準確測定花椒葉多糖的含量，系統分析花椒葉多糖的生物活性，對于花椒資源的科學開發和綜合利用具有一定的積極意義。植物多糖的定量分析方法包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚-硫酸法等，其中最常用的方法是苯酚-硫酸法［4-6］。該方法的原理是利用多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物進而和苯酚縮合成有色化合物，以葡萄糖為標準單糖在490 nm波長下進行比色分析。該方法操作簡便，快捷靈敏，無須大型儀器，但是其準確性和重現性受實驗條件（如顯色反應）的影響較大［5-6］。為了給花椒葉多糖的定量分析和花椒葉資源的開發利用提供依據，本研究對苯酚-硫酸法的實驗條件進行了優化，然后采用系統適應性實驗進行了方法學評價，最終建立了靈敏、特異、精確的花椒葉多糖定量分析方法，并運用該方法測定了陜西大紅袍花椒葉中多糖的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DL-4C型低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；HH-2型恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀，上海安亭實驗儀器有限公司；BS224S型分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司。

葡萄糖、半乳糖、甘露糖標準品，純度為99%，購自美國Sigma公司；無水乙醇、95%乙醇、丙酮、濃硫酸、苯酚等，分析純，國產試劑；蒸餾水，陜西師范大學自制。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理

1.2.1.1 花椒葉的前處理

花椒葉2014年5～8月份采自陜西省渭南市?；ń啡~經挑選（除去莖、葉柄和雜物）后清洗、晾干，然后粉碎、過篩（80～100目）、烘干（50～60℃），置密閉容器中避光保存。

1.2.1.2 花椒葉多糖的提取

準確稱取10 g花椒葉粉末，置250 mL錐形瓶中，加入200 mL蒸餾水，浸泡過夜，然后置80℃水浴中提取4 h，抽濾并收集濾液，濾渣重復浸提2次，合并濾液。將所得濾液蒸發濃縮后加入4倍量體積分數為95%的乙醇，室溫下沉淀過夜，在4000r/min下離心10 min得到沉淀。將沉淀移至10 mL離心管中，依次用體積分數為80%的乙醇、95%的乙醇、無水乙醇和丙酮進行漂洗，然后揮干溶劑，在30～40℃烘干至恒重，碾成粉末即得花椒葉多糖樣品。比色測定時將多糖樣品配制成ρ為0.05 mg/mL的水溶液（多糖溶液）。

1.2.2 方法建立與優化

1.2.2.1 標準單糖和工作波長的確定

按照質量分數為5%苯酚0.3 mL、多糖溶液1.0 mL、濃硫酸2.0 mL的比例加樣，混勻后在室溫下顯色20 min，在250～600 nm波長范圍內進行掃描；分別用葡萄糖、半乳糖、甘露糖3種單糖溶液替代多糖溶液，顯色后進行掃描。通過比較單糖、多糖的吸收光譜確定標準單糖和工作波長。

1.2.2.2 加樣次序的確定

測定不同樣品添加順序（樣品-苯酚-濃硫酸、樣品-濃硫酸-苯酚、濃硫酸-樣品-苯酚、濃硫酸-苯酚-樣品、苯酚-樣品-濃硫酸、苯酚-濃硫酸-樣品）對吸光度的影響，以確定較佳加樣次序。加樣量為質量分數5%苯酚0.3 mL、多糖溶液1.0 mL、濃硫酸2.0 mL。顯色溫度為室溫，顯色時間20 min。

1.2.2.3 顯色時間對吸光度的影響

按照質量分數為5%苯酚0.3 mL、多糖溶液1.0 mL、濃硫酸2.0 mL的比例依次加樣，混勻后在室溫下分別顯色5，10，20，25，30 min，測定吸光度。1.2.2.4 濃硫酸添加量對吸光度的影響

按照質量分數為5%苯酚為0.3 mL，多糖溶液為1.0 mL，濃硫酸分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL的比例依次加樣?；靹蚝笤谑覝叵嘛@色25 min，測定吸光度。

1.2.2.5 苯酚添加量對吸光度的影響

在質量分數為5%的苯酚分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的條件下，依次加入多糖溶液1.0 mL、濃硫酸3.5 mL，室溫下顯色2 5min，測定吸光度。

1.2.2.6 顯色溫度對吸光度的影響

按照質量分數為5%苯酚0.2 mL、多糖溶液1.0 mL、濃硫酸3.5 mL的比例依次加樣，混勻后分別在10，20，30，40，50℃下顯色25 min，測定吸光度。

1.2.2.7 正交試驗設計

根據上述單因素實驗結果，選擇顯色時間、濃硫酸添加量、質量分數5%苯酚添加量、顯色溫度4個變量進行四因素三水平正交試驗，確定較優組合條件。每組實驗設2個重復。

1.2.3 方法考察與評價

1.2.3.1 標準曲線的繪制

精確配制ρ分別為5.00，10.00，20.00，30.00，40.00，50.00，60.00 μg/mL的半乳糖標準溶液，按照質量分數為5%苯酚0.3 mL、半乳糖標準溶液1.0 mL、濃硫酸3.5 mL的比例加樣，混勻后在25℃顯色30 min，在484 nm處測定吸光度。每個濃度設5個重復。

1.2.3.2 LOD和LOQ的測定

參照Rolim等［7］的方法測定LOD和LOQ。

1.2.3.3 精密度實驗

參照Shabir［8］的方法連續3天重復測定高、低兩種濃度花椒葉多糖溶液中多糖的含量，計算日內精密度（n=5）和日間精密度（n=15）。

1.2.3.4 回收率實驗

參照Rolim等［7］的方法將一定量的高、低兩個濃度水平的半乳糖標準溶液（ρ分別為30.00、50.00 μg/mL）與已知濃度花椒葉多糖溶液混合，顯色后測定吸光度和總糖含量，計算加標回收率。

1.2.3.5 穩定性實驗

取一定量的花椒葉多糖溶液，在最佳顯色反應條件下比色測定吸光度。每隔1 min測定一次，連續測定10次以考察儀器穩定性；每隔10 min測定一次，連續測定2 h以考察溶液穩定性。

2 結果與分析

2.1 標準單糖與工作波長的選擇

在250～600 nm波長下掃描花椒葉多糖與葡萄糖、半乳糖、甘露糖3種單糖顯色后溶液的光譜曲線見圖1，可以發現花椒葉多糖的最大吸收峰對應波長不是490 nm，而是484 nm。3種單糖中，半乳糖與花椒葉多糖的最大吸收波長最為接近，因此選擇半乳糖作為標準單糖。由于花椒葉多糖在484 nm處有最大吸收峰，而半乳糖在484 nm處的吸光度也較高，因此選擇484 nm作為最佳吸收波長。這樣就避免了傳統方法以葡萄糖為標準單糖、以490 nm為工作波長而使方法的特異性和靈敏度受到影響的弊端。

圖1 花椒葉多糖（下）與半乳糖（上）的掃描光譜Fig.1 Absorption spectra of polysaccharides from Zanthoxylum bungeanum leaves（lower spectrum）and galactose standard（upper spectrum）

2.2 顯色反應條件的優化

2.2.1 加樣次序

加樣次序對吸光度的影響見圖2，加樣次序對吸光度具有明顯影響。先加入質量分數為5%的苯酚，再加入花椒葉多糖溶液，后加入濃硫酸，顯色后溶液的吸光度最高。故選擇苯酚-樣品-濃硫酸為較佳加樣次序。

2.2.2 顯色時間

在5～25 min范圍內，隨著顯色時間的延長吸光度呈現緩慢增加的趨勢，超過25 min時吸光度開始緩慢下降，見圖3，因此顯色時間應該保持在25 min左右。

2.2.3 濃硫酸添加量

濃硫酸添加量對吸光度的影響見圖4，當濃硫酸添加量在1.0～3.5 mL區間時，吸光度隨著濃硫酸添加量的增加而增大，當濃硫酸添加量為3.5 mL時吸光度最大，此后吸光度開始減小，這可能是因為濃硫酸在顯色過程中的作用既是強酸，又是催化劑，如果添加量過多，則會引起被測物質化學解離狀態及其顯色配合物組成的改變，從而影響有色配合物的吸收光譜。綜上，濃硫酸添加量控制在3.5 mL為宜。

圖2 加樣次序對吸光度的影響Fig.2 Effect of addition sequences on absorbance

圖3 顯色時間對吸光度的影響Fig.3 Effect of hromogenic reaction timeon absorbance

2.2.4 質量分數為5%的苯酚添加量

苯酚添加量對吸光度的影響見圖5，苯酚添加量過多、過少都會使吸光度降低，當苯酚添加量為0.2 mL時，吸光度最高，因此，苯酚添加量應當為0.2 mL左右。

2.2.5 顯色溫度

顯色溫度對吸光度的影響見圖6，當溫度為30℃時吸光度最大，高于或低于30℃時吸光度均較小，其原因可能是溫度過低顯色反應速度較慢，溫度過高顯色配合物的結構容易遭到破壞，因此顯色溫度應該維持在30℃左右。

圖4 濃硫酸添加量對吸光度的影響Fig.4 Effect of amount of concentrated sulfuric acid on absorbance

圖5 質量分數5%的苯酚添加量對吸光度的影響Fig.5 Effect of amount of 5%phenol on absorbance

表1 四因素三水平正交試驗結果及極差分析Tab.1 Results and range analysis of orthogonal test of four factors at three levels

圖6 顯色溫度對吸光度的影響Fig.6 Effect of temperature of chromogenic reaction on absorbance

2.2.6 正交試驗

測定的正交試驗結果和分析見表1和表2。由表1的極差分析和表2的方差分析可知，顯色溫度（A）、質量分數為5%的苯酚添加量（B）、濃硫酸添加量（C）、顯色時間（D）對吸光度均有顯著影響（P＜0.01），影響大小依次為C＞B＞D＞A。

由極差分析可知，較優組合條件為A1B3C2D3，即顯色溫度為25℃、質量分數為5%的苯酚添加量為0.3 mL、濃硫酸添加量為3.5 mL、顯色時間為30 min。在9組正交試驗中，第9組實驗的吸光度最高。理論優化所得較優組合條件（A1B3C2D3）與第9組實驗條件（A3B3C2D1）中C、B兩個影響較大的因素均處于相同水平，提示較優組合條件是符合邏輯的。由于較優條件（A1B3C2D3）在9組正交試驗中沒有出現，因此按照該條件進行了驗證實驗，發現吸光度顯著高于9組正交試驗的吸光度（P＜0.05），說明理論優化得到的較優組合條件（A1B3C2D3）是切實可行的。

2.3 系統適應性實驗

2.3.1 標準曲線的繪制結果

以半乳糖標準溶液質量濃度（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，見圖7，回歸方程為y=0.012 7x-0.007 6，相關系數R2=0.997（圖7）。當半乳糖標準溶液質量濃度為5.00 μg/mL時，精密度和準確度較差；標準曲線的數據分析見表3，當標準溶液質量濃度在10.00～60.00 μg/mL時，精密度和準確度較好。因此，標準曲線的線性范圍為10.00～60.00 μg/mL。

表2 正交試驗方差分析Tab.2 Variance analysis of orthogonal test

圖7 半乳糖標準曲線Fig.7 Standard curve of galactose

表3 標準曲線的數據分析Tab.3 Analysis of standard curve

2.3.2 LOD和LOQ的確定結果

此方法的LOD和LOQ測定數據見表4。由表4可知，LOD和LOQ分別為2.08 μg/mL和6.30 μg/mL。

表4 LOD與LOQTab.4 Limits of detection and quantification

2.3.3 精密度實驗結果

方法的精密度實驗數據見表5。由表5可知，當花椒葉多糖溶液中多糖ρ在15.72～31.70 μg/mL范圍時，日內精密度在0.49%～3.64%之間，日間精密度在5.17%～6.05%之間，可以滿足花椒葉多糖的定量分析要求。

2.3.4 回收率實驗結果

不同濃度水平的加標回收率在96.48%～ 105.90%之間（數據未顯示），平均回收率為101.19%，符合定量分析相關要求［8］。

2.3.5 穩定性實驗結果

儀器穩定性實驗數據見表6和表7。由表6和表7可知，儀器穩定性較高（RSD=0.80%），樣品溶液在顯色反應后的2h內也基本穩定（RSD= 1.03%），說明該方法可用于花椒葉多糖的精密、便捷檢測。

表5 精密度實驗數據Tab.5 Results of precision test

表6 儀器穩定性實驗數據Tab.6 Results of instrument stability

表7 溶液穩定性實驗數據Tab.7 Results of stability of colored sample solution

2.4 驗證測定

為了驗證本研究建立的苯酚-硫酸法的實用性，應用該方法測定了陜西大紅袍花椒的頂端葉、中層葉和底部葉中多糖的含量，發現花椒葉中w（多糖）在8.11～8.89 mg/g之間，不同植株之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

表8 陜西大紅袍花椒葉多糖含量測定Tab.8 Determination of polysaccharides in leaves of Dahongpao（a cultivar of Z.bungeanum in Shaanxi province）

3 結 語

本研究通過單因素實驗和正交試驗優化了顯色時間、濃硫酸添加量、質量分數為5%的苯酚添加量、顯色溫度等實驗條件，采用系統適應性實驗考察了新方法的LOD、LOQ、精密度和回收率等，建立了一種靈敏、特異、精確測定花椒葉多糖含量的新方法，并測定了陜西大紅袍花椒葉的多糖含量，為花椒葉多糖的精確定量和花椒葉資源的深度開發提供了依據。

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Development and Application of Phenol-sulfuric acid Method for Determination of Polysaccharides in Zanthoxylum Bungeanum Leaves

QI Sufen，ZHANG Huafeng*，YAO Mei，CHENG Fang，WANG Zhengqi，CHEN Siyu
（College of Food Engineering and Nutritional Science/Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry/National Engineering Laboratory for Resources Development of Endangered Crude Drugs in Northwest China，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China）

A sensitive，specific，accurate and precise phenol-sulfuric acid method was established for quantitative assay of polysaccharides in Zanthoxylum bungeanum leaves.And polysaccharides in leaves of Dahongpao，a cultivar of Z.bungeanum in Shaanxi province，were successfully determinated by the proposed phenol-sulfuric acid method.Galactose was used as standard monosaccharide and 484nm was chosen as working wavelength.The optimum conditions for chromogenic reaction were obtained by single factor experiments and orthogonal test:addition sequence，phenol-sample-concentrated sulfuric acid；temperature of chromogenic reaction，25℃；amount of 5%phenol，0.3 mL；amount of concentrated sulfuric acid，3.5 mL；and duration of chromogenic reaction，30 min.System suitability test indicated that regression equation of standard curve was y=0.012 7x-0.007 6（R2=0.997）and range with satisfactory accuracy and precision was 10.00-60.00 μg/mL.LOD and LOQ were 2.08 μg/mL and 6.30 μg/mL，respectively.Intra-and inter-day precision varied from 0.49%to 3.64%and from 5.17%to 6.05%，respectively.And mean recovery was 101.19%.The colored sample solution was stable within 2 h.The content of polysaccharides in Dahongpao leaves in Shaanxi province，was in the range of 8.11-8.89 mg/g. The developed colorimetric method provides a basis for quantification of polysaccharides from Z.bungeanum leaves and exploitation of leaf resources.

Zanthoxylum bungeanum leaves；polysaccharides；phenol-sulfuric acid method；chromogenic reaction

李 寧）

TS207.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.04.008

2095-6002（2015）04-0040-07

齊素芬，張華峰，姚美，等.苯酚-硫酸法測定花椒葉多糖含量［J］.食品科學技術學報，2015，33（4）:40-46.

QI Sufen，ZHANG Huafeng，YAO Mei，et al.Development and application of phenol-sulfuric acid method for determination of polysaccharides in Zanthoxylum bungeanum leaves［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（4）:40-46.

2014-07-14

中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目（GK201302048）；陜西省大學生創新創業訓練計劃項目（cx13063）。

齊素芬，女，學士，研究方向為藥食兩用植物資源開發與利用；

*張華峰，男，副教授，博士，主要從事食品營養與安全方面的研究。

。