蛋氨酸對瓦氏黃顙魚幼魚肝臟及血漿中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活力的影響?

王香麗， 麥康森， 徐 瑋， 張彥嬌， 艾慶輝

(中國海洋大學農業部水產動物營養與飼料實驗室，教育部海水養殖重點實驗室，山東 青島 266003)

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蛋氨酸對瓦氏黃顙魚幼魚肝臟及血漿中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活力的影響?

王香麗， 麥康森， 徐 瑋， 張彥嬌， 艾慶輝??

(中國海洋大學農業部水產動物營養與飼料實驗室，教育部海水養殖重點實驗室，山東 青島 266003)

本文旨在研究人工飼料中蛋氨酸對瓦氏黃顙魚幼魚肝臟及血漿中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活力的影響。在基礎飼料中分別添加0.0、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5g/100 g的晶體DL-Met，以L-Glu作為等氮替代物，配制6組等氮等脂飼料(Met的實測值為0.40、0.73、1.04、1.33、1.70和1.98g/100 g飼料)，在室內循環水系統中進行為期70d的生長實驗。實驗表明,隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，肝臟谷丙轉氨酶(GPT)活力顯著升高，并在蛋氨酸含量為1.70g/100g飼料時，活力達最大值(P<0.05)；肝臟谷草轉氨酶(GOT)活力與GPT活力有相似的變化趨勢，但各處理組間無顯著性差異(P>0.05)。隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，血漿中的GPT活力呈現先升高后平穩的變化趨勢，且拐點出現在蛋氨酸含量為1.04g/100 g(P<0.05)飼料組，而血漿中GOT活力呈現先升高后降低的變化趨勢，且最大值出現在蛋氨酸含量為0.73g/100 g(P<0.05)飼料組。研究表明，當飼料中蛋氨酸含量不足或過量時，都會影響瓦氏黃顙魚幼魚轉氨酶的活力，從而在一定程度上影響魚體的氨基酸代謝。

瓦氏黃顙魚； 肝臟； 幼魚； 蛋氨酸； 谷草轉氨酶； 谷丙轉氨酶

蛋氨酸作為機體主要的含硫氨基酸，是魚類生長的必需氨基酸之一。在動物體上，蛋氨酸功能主要表現為：參與機體蛋白代謝、參與機體硫代謝以及參與機體轉甲基反應[1-2]。研究表明，在多種魚類中，當飼料蛋氨酸含量不足或過量時，不僅會導致魚體生長和飼料轉化率下降[3-5]，而且還會降低實驗魚的存活率[6-7]。飼料氨基酸主要通過轉氨基作用和脫氨基作用在體內被進一步代謝轉化，魚類則主要通過聯合脫氨基作用滿足機體需要，谷丙轉氨酶(Glumtaic-pyruvic transaminase，GPT)和谷草轉氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase， GOT)是氨基酸代謝中的2個關鍵酶，它們的活力大小不僅反映了氨基酸代謝程度的強弱[8]，而且也顯示了肝功能的正常與否[9]。在大豆濃縮蛋白替代魚粉實驗中，過高替代量會顯著降低瓦氏黃顙魚肝臟中GPT和GOT的活力[10]，即影響了肝臟內的氨基酸代謝平衡。在蛋氨酸需求及MHA替代蛋氨酸實驗中，蛋氨酸有效含量不足會顯著升高建鯉和金鯧魚血漿中GPT和GOT的活力，對魚體肝臟造成了一定程度的損傷，抑制肝臟的正常生理功能[11-12]。

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)又名江黃顙，肉食性魚類，因其肉味鮮美，無肌間刺等深受消費者喜愛[13]，是長江、淮河等流域的主要養殖對象之一。目前有關瓦氏黃顙魚研究多集中于主要營養素對魚體生長的影響等方面[14-16]，而關于飼料中蛋氨酸對瓦氏黃顙魚幼魚血漿及肝臟中代謝酶(GOT和GPT)活力影響的研究仍屬空白；因此，本文探討了瓦氏黃顙魚配合飼料中不同蛋氨酸水平對血漿和肝臟轉氨酶(GOT和GPT)活力的影響，以進一步了解蛋氨酸在魚類營養中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗飼料設計

以瓦氏黃顙魚幼魚魚體氨基酸組成為標準，添加相應晶體氨基酸使基礎料中除蛋氨酸外其他氨基酸均達到魚體氨基酸水平，分別在基礎料中梯度添加0.0、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5g/100g的晶體DL型蛋氨酸(DL-Met)，以L型谷氨酸(L-Glu)作為等氮替代物，配制6組等氮等脂實驗飼料(蛋氨酸的實測值為0.40、0.73、1.04、1.33、1.70和1.98g/100g飼料)(見表1)。飼料保存于-20℃冰箱中，待正式實驗開始時，破碎成適宜大小顆粒進行投喂。

表1 實驗飼料配方和化學成分分析表(干物質)[17]

注：*：3個重復的平均值。Note：*：Means of three analysis.

①Glutamic acid； ② DL-methionine；③Proximate composition (dry matter)； ④Methionine； ⑤Cysteine； ⑥Crude protein； ⑦Crude lipid

1.2 養殖過程

實驗魚購自四川眉山，選用當年人工孵化的同一批苗種，在濰坊學院室內循環養殖水系統進行為期70d的養殖實驗?；A料馴化投養10d后，挑選健康無病、規格一致的幼魚(初始平均體重(1.53±0.10)g)隨機分為6組，每組3個重復，每個重復為50尾魚，7：00和19：00手工緩慢投喂至表觀飽食。實驗過程水溫25～28℃，pH為7.2～7.6，溶氧量不低于6.0mg/L。

1.3 分析與統計

1.3.1 樣品采集 養殖實驗結束后，對實驗魚饑餓處理24h，以丁香酚(1∶10000)麻醉，對每個桶的魚進行計數、稱重。從每桶中抽取10尾魚，以1mL無菌注射器從魚體尾靜脈取血，轉移至2mL的抗凝采血管中，4℃靜置6h后3000r/min離心10min，分離血漿并暫存于液氮中。同時每桶另取3尾魚的肝臟，暫存于液氮中。所有樣品均轉移至-80℃以備后期分析。

1.3.2 常規分析 飼料經破碎后105℃烘干至恒重，參照AOAC法進行常規分析。采用凱氏定氮法測定粗蛋白含量；采用索氏抽提法測定粗脂肪含量。蛋白含量和脂肪含量均重復測定2次，取平均值為測定結果。

1.3.3 含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)分析 含硫氨基酸采用高效液相色譜法(HPLC)測定。飼料經冷凍干燥后，取樣品0.2g，加入6mol HCl 6mL，在110℃下水解22～24h后濾紙過濾，經0.5mol NaHCO3沖洗后定容至50mL，色譜分離后經鄰苯二甲醛(Orthophthaldehyde，Sigma)衍生后，用高效液相色譜儀(HPLC,HP1100,USA)進行氨基酸分析。飼料中蛋氨酸和半胱氨酸含量均重復測定2次，取平均值為測定結果。

1.3.4 GOT與GPT分析 肝臟和血漿中的GOT、GPT活力均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體操作如下。

樣本前處理：

①血漿樣本待測：直接取樣測定。②肝臟組織樣本：準確稱取組織重量，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，2500 r/min，離心10min，取上清液待測。

操作流程：

a.將基質液20μL(37℃已預溫)與待測樣品5μL混勻后放入測定孔中，將基質液20μL(37℃已預溫)放入對照孔中，均37℃水浴30min。

b.將2,4-二硝基苯肼液20μL放入測定孔中，將2,4-二硝基苯肼液20μL與待測樣品5μL混勻后放入對照孔中，均37℃水浴30min。

c.輕輕水平搖勻96孔板，室溫放置15min后，在510nm波長下用酶標儀測各孔OD值(絕對OD值=測定孔OD值-對照孔OD值)，查標準曲線，求得相應GOT或GPT活力。GOT/GPT活力 組織中GOT/GPT活力(U/gprot)=通過標準曲線得勻漿液GOT/GPT活力(U/L)÷待測勻漿液蛋白濃度(gprot/L)。

GOT測定原理 GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸移換氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應過程中可自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2,4二硝基苯肼反應生成2,4二硝基苯棕，在堿性溶液中呈紅棕色，于505nm比讀吸光度并計算酶活力。

GPT測定原理 GPT在37℃及pH=7.4條件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反應30min后(固定時間)加入2,4二硝基苯肼鹽酸溶液，既中止反應，同時2,4二硝基苯肼與酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色，于505nm比讀吸光度并計算酶活力。

卡門氏單位 1mL液體，反應液總容量3mL，340nm波長，1cm光徑，25℃，1min內所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD而引起吸光度每下降0.001為1個門卡氏單位(1門卡氏單位=0.482U/L，25℃)。

肝臟蛋白含量采用微量考馬斯亮藍法測定，試劑盒來自南京建成生物工程研究所，具體操作參照試劑盒說明書進行。

1.3.5 統計方法 采用SPSS 17.0對所有數據進行單因素方差分析，如果差異顯著，則進行Tukey多重比較，顯著性分析為P<0.05。

2 結果

2.1 飼料中蛋氨酸含量對肝臟GPT和GOT活力的影響

隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，GPT活力呈現先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)，且最大值出現在蛋氨酸含量為1.70g/100g飼料(Diet 5)組(見圖1)。GOT活力與GPT活力具有相似的變化趨勢，但各個處理組間無顯著性差異(P>0.05)(見圖2)。

(圖中數值為平均值±標準誤(n=3)。各處理的不同字母表示顯著影響(P<0.05，Tukey′s檢驗)。Values are means (n=3), with their standard errors represented by vertical bars.a, b, cMean values for the same enzyme with unlike letters were significantly different (P<0.05, Tukey′s test).)

圖1 飼料蛋氨酸對瓦氏黃顙魚肝臟中谷丙轉氨酶活力的影響
Fig.1 Effects of dietary methionine on hepatic activities of glutamic-pyruvic transaminase

(圖中數值為平均值±標準誤(n=3，P>0.05，Tukey′s檢驗)。Values are means (n=3，P>0.05, Tukey′s test).)

圖2 飼料蛋氨酸對瓦氏黃顙魚肝臟中谷草轉氨酶活力的影響
Fig.2 Effects of dietary methionine on hepatic activities of glutamic oxalacetic transaminase

2.2 飼料中蛋氨酸含量對血漿GPT和GOT活力的影響

隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，GPT活力逐漸升高，且在飼料蛋氨酸含量為1.04g/100g(Diet 3)時達到最大值，而后呈現平穩的變化趨勢，且1.04g/100g(Diet 3)到1.98g/100g(Diet 6)組GPT活力無顯著性差異(P>0.05)(見圖3)。隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，GOT活力呈現先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)，且最大值出現在Met含量為0.73g/100g(Diet 2)組(見圖4)。

(圖中數值為平均值±標準誤(n=3)。各處理的不同字母表示顯著影響(P<0.05,Tukey′s檢驗)。Values are means (n=3), with their standard errors represented by vertical bars.a, bMean valuesfor the same enzyme with unlike letters were significantly different (P<0.05, Tukey′s test).)

圖3 飼料蛋氨酸對瓦氏黃顙魚血漿中谷丙轉氨酶活力的影響
Fig.3 Effects of dietary methionine on plasmatic activitie of glutamic-pyruvic transaminase

(圖中數值為平均值±標準誤(n=3)。a,b,c各處理的不同字母表示顯著影響(P<0.05,Tukey′s檢驗)。Values are means (n=3), with their standard errors represented by vertical bars.a,b,cMean values for the same enzyme with unlike letters were significantly different (P<0.05, Tukey′s test).)

圖4 飼料蛋氨酸對瓦氏黃顙魚血漿中谷草轉氨酶活力的影響
Fig.4 Effects of dietary methionine on plasmatic activities of glutamic oxalacetic transaminase

3 討論

本實驗中，隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，肝臟中GPT與GOT活力均呈現先升高后降低的變化趨勢，且最高值均出現在蛋氨酸含量為1.70g/100g飼料組，實驗結果在一定程度上顯示了魚體肝臟氨基酸代謝狀況。轉氨酶(GOT和GPT)的主要作用是催化氨基酸生成酮酸，從而保持機體穩態。當飼料中氨基酸(底物)不足時，GPT活力和GOT活力較低，轉氨作用較弱；當底物含量適宜時，GPT活力和GOT活力相應升高，轉氨作用相應增強；當底物含量過量時，GPT活力和GOT活力相應降低，轉氨作用相應減弱，這或許是因為飼料氨基酸吸收時間的跨度或小腸絨毛上轉運蛋氨酸載體數目有限[18]。本實驗肝臟的GPT活力和GOT活力的最高值出現在蛋氨酸含量為1.70g/100g飼料組；這表明適宜的蛋氨酸含量時GPT和GOT活力最高，氨基酸代謝最快，而過高或過低的蛋氨酸含量均不利于機體氨基酸代謝。類似的結果也出現在花鱸[19]的研究上，當菜籽粕替代魚粉含量較高，即飼料氨基酸較不平衡影響了肝臟中氨基酸代謝的穩態，進而表現為實驗魚肝臟中GPT和GOT活力顯著降低。

正常情況下血清中的轉氨酶活性值很低；當組織中毒病變或受損組織范圍較大時，血清中的GPT和GOT濃度會相應上升且活性也會相應增強[20]。大量醫學實驗表明GPT和GOT是肝細胞受損最靈敏指標之一，血清中微量的轉氨酶活力即可表征肝功能已受到損傷[21]。因此，血清中GOT和GPT活力的變化是反應肝功能正常與否的重要指標。本實驗中隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，血漿中GPT活力呈現先升高后平穩的變化趨勢，蛋氨酸含量為1.04g/100g(Diet 3)飼料組為拐點。隨著飼料中蛋氨酸含量的增加，血漿中GOT活力呈先升高后降低的變化趨勢，且最大值出現在蛋氨酸含量為0.73g/100g(Diet 2)飼料組。實驗結果表明，在蛋氨酸含量不足時，影響機體蛋白質代謝，進而導致肝臟損傷；類似的結果也出現在建鯉[11]和金鯧魚[12]等魚類研究中，當飼料中蛋氨酸含量過低或蛋氨酸羥基類似物(MHA)替代蛋氨酸比例過高時，魚體肝臟受損，進而導致血漿中GPT和GOT活力均顯著升高。

本實驗研究表明，當飼料中蛋氨酸含量不足或過量時，都會影響瓦氏黃顙魚幼魚轉氨酶的活力，從而在一定程度上影響氨基酸代謝。

致謝：本實驗的養殖和分析過程中得到了楊英豪、張凱凱、左然濤和門珂珂的大力協，在此表示感謝！

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責任編輯 朱寶象

Influence of Dietary Methionine on the Activity of Liver and Plasma Glutamic-Pyruvic and Glutamic Oxalacetic Transaminases of Juvenile Darkbarbel Catfish (Pelteobagrusvachelli)

WANG Xiang-Li, MAI Kang-Sen, XU Wei, ZHANG Yan-Jiao, AI Qing-Hui

(The Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feed, Ministry of Agriculture， The Key Laboratory of Mariculture， Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A 10-week feeding trialina recirculation rearing system was tried in order to determine the influence of dietary methionine on the activity of glutamic-pyruvic and glutamic oxalacetic transaminasesin the liver and plasma of juvenile darkbarbel catfish (Pelteobagrusvachelli). Six nitrogen and lipid contents identicaldiets were formulated by supplementing 0.0%, 0.3%, 0.6%, 0.9%, 1.2% and 1.5% of methionine, making the final dietary methionine content to be 0.40%, 0.73%, 1.04%, 1.33%, 1.70% and 1.98%, respectively. The results showed that when dietary methionine increased, the activity of glutamic-pyruvic transaminase (GPT) in liver increased significantly (P<0.05), reaching the highest when the content of diet methionine was 1.70%， while the activity of glutamicoxalacetictransaminase (GOT) in liver increased in the same trend as that of GPT although no significantdifferencewas found among diets. As dietary methionine increased, the activities of plasma GPTincreased first and then turned to be stable when the content of methionine was 1.04% (P<0.05). Similarly, the activity of plasma GOTfirst increased, reaching the hig-hest when the content of methionine was 0.73% and then decreased (P<0.05). In conclusion, the activity of two transaminases wassignificantly influenced by dietary methionine.

Pelteobagrusvachelli; pliver； juvenile fish； methionine; gutamic oxalacetic transaminase; glutamic-pyruvic transaminase

國家重點基礎研究發展計劃項目(2009CB118702)資助

2014-03-25；

2014-05-28

王香麗(1988-)，女，碩士生，主要從事水產動物營養生理研究。E-mail： diezang1988@163.com

?? 通訊作者： E-mail：qhai@ouc.edu.cn

S963.71

A

1672-5174(2015)09-049-05

10.16441/j.cnki.hdxb.20140097