利用微衛星標記的魁蚶混交家系鑒定?

孫 楠， 李 琪， 于 紅， 孔令鋒

(中國海洋大學水產學院，山東 青島 266003)

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研究簡報

利用微衛星標記的魁蚶混交家系鑒定?

孫 楠， 李 琪??， 于 紅， 孔令鋒

(中國海洋大學水產學院，山東 青島 266003)

本文使用6個具有多態性的微衛星位點，對30個魁蚶親本及其300個子代(共330個個體)進行家系分析，評估苗種生產中親本與子代間的遺傳變異。研究表明，家系鑒定成功率與模擬結果一致，使用6個微衛星位點可以實現超過99%的鑒定率?？烙H本與子代間等位基因多樣性相似，子代群體的期望雜合度顯著低于親本群體(P<0.05)，觀測雜合度和親本群體相比略有降低，但無顯著差異。所有魁蚶父母本都參與了繁殖過程，并具有多重父權和多重母權的現象。研究顯示，微衛星作為一種分子標記可以有效應用到家系鑒定中，同時對于養殖魁蚶群體的遺傳多樣性變化仍需要進一步的監測。本研究為魁蚶人工育苗、養殖生產制定合理的管理方針提供幫助，同時為微衛星作為分子標記進行魁蚶增殖放流溯源提供科學支持。

魁蚶；微衛星；家系分析

魁蚶(Scapharcabroughtonii)屬于瓣鰓綱(Lamellibranchia)蚶科(Arcidae)，又稱大毛蚶、赤貝、血貝，是一種大型底棲經濟貝類，廣泛分布在中國、日本、韓國及菲律賓海沿岸。其成體個大體肥, 肉質鮮美, 經濟價值很高。近年來，由于需求旺盛, 而自然資源遠不能滿足市場的需要, 因此魁蚶的人工育苗及養殖生產得到快速發展[1-2]。但由于魁蚶具有大部分海洋雙殼貝類高繁殖力的特點，因此在其苗種生產中往往使用有限的親本，而易發生近親交配。較高的近交率會引起養殖群體遺傳多樣性下降，這成為魁蚶養殖生產中一個備受關注的問題。

微衛星標記具有多態性高、遵循孟德爾分離定律、共顯性遺傳等特點，已成為家系鑒定、遺傳圖譜構建、種群遺傳學研究的重要工具[3-5]。利用微衛星標記進行家系鑒定已成功應用于許多水產動物，例如：蘇天鳳等[6]使用16個微衛星標記鑒定了斑節對蝦(Penaeusmonodon)7個全同胞家系的親緣關系；Norris等[7]在混養的大西洋鮭魚中，證明了在沒有物理標記及背景信息的情況下，微衛星分子標記可以有效的進行家系鑒定和親緣關系分析。近幾年，已先后開發出魁蚶微衛星標記100多個[8-10]，本研究從已開發的魁蚶微衛星標記中篩選出6個多態性高、特異性強的微衛星標記，對30個親本及其混交產生的300個子代進行微衛星分型，分析家系鑒定效率，比較親本與子代間的遺傳變異，以期為魁蚶養殖群體的遺傳多樣性保護提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗用魁蚶親貝于2012年6月采自山東省日照海區。隨機選擇30個魁蚶親本(14個雄性和16個雌性)進行催產。受精24 h后，D形幼蟲用25μm篩絹濾出，移入1.5μL的無菌離心管中，輕微離心后倒出海水，取幼蟲和30個親本組織于100%酒精固定。

1.2 DNA提取及微衛星分析

取親貝的閉殼肌組織約100mg，采用傳統的苯酚-氯仿法來提取基因組DNA[11]。幼蟲DNA參照Li等[12]使用Chelex-100樹脂提取。實驗中選取Sb51[13],ScBr04、 ScBr03、 ScBr20、 ScBr14和ScBr09[8]6個特異性強、多態性較高的微衛星位點進行分析。

聚合酶鏈式反應(PCR)的總體積為10μL，內含模板DNA 1.0μL，1μmol/L 的正反引物, 0.2mmol/L dNTPs, 1×PCR buffer, 1.5mmol/L MgCl2, 0.25U TaqDNA聚合酶(寶生物工程有限公司)。親本的PCR擴增程序為:94℃預變性3min，然后進行35個擴增循環，每一循環包括94℃變性30s,退火溫度45s,72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存備用。幼蟲的PCR擴增程序為：94℃預變性3min，然后進行7個擴增循環，每一循環包括94℃變性1min，退火溫度30s，72℃延伸30s；然后再進行33個循環，每一循環包括94℃變性30s，退火溫度30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。擴增產物通過6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。在1×TBE電泳緩沖液, 220 V恒壓下，電泳2.5h，電泳完畢后,銀染檢測，利用10 bp DNA ladder(Invitrogen公司)作為marker檢測等位基因位置。為防止每張板膠孔的差異及讀數偏差，每張板中加入若干親本的PCR產物作為對照。

1.3 統計分析

首先，使用軟件CERVUS 3.0模擬估算魁蚶家系鑒定所需要的微衛星位點數及其鑒定效率。具體參數如下：模擬子代數目為10000(循環重復數)，候選親本數為30，親本檢測率100%，位點檢測率100%，分型誤差率1%，置信水平95%。然后根據實驗結果，計算真實的鑒定效率。多態信息含量(PIC)及位點的非排除概率(NE-1P, NE-2P，NE-PP)也由CERVUS 3.0計算，NE-1P、NE-2P和NE-PP分別指位點對第一個親本、第二個親本和親本對的非排除概率。根據位點的PIC值，由高到低逐一增加位點數來計算位點的累積鑒定能力。利用MICRO-CHECKER[14]評估6個微衛星位點的無效等位基因情況。親本和子代的遺傳多樣性參數：等位基因數(Na)、期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)由CERVUS 3.0計算。差異顯著性由SPSS 19.0(美國SPSS公司)進行非參數兩配對樣本Wilcoxon符號秩檢驗[15]。

2 結果

2.1 家系鑒定成功率

用于家系模擬鑒定的6個微衛星位點的等位基因數為6～13，平均值為10.8，平均多態信息含量(PIC)為0.746；對第一個親本的非排除概率(NE-1P)為0.311～0.839，對第二個親本的非排除概率(NE-2P)為0.183～0.658，親本對的非排除概率(NE-PP)為0.055～0.452(見表1)。MICRO-CHECKER分析結果表明，位點Sb51、ScBr04、ScBr20、ScBr14、ScBr09純合子過剩，可能存在無效等位基因，但都沒有大片段基因丟失的現象。

表1 6個微衛星位點的綜合信息Table 1 The information of 6 microsatellite loci

注：①Annealing Temperature；②No. of GenBank；③Number of alleles；④Polymorphism information content；⑤Average non-exclusion probability to first parent；⑥Average non-exclusion probability to second parent；⑦Average non-exclusion probability to parent pair；⑧Average

根據位點的PIC值由高到低逐一累加計算6個位點的累積家系鑒定成功率。模擬結果表明：采用4個位點的鑒定成功率為96%；采用5個位點的鑒定成功率能達到99%；使用6個位點，則獲得超過99%的鑒定成功率(見圖1)。實際家系鑒定在330個個體中進行(包括300個子代和30個親本)。在95%置信度下，運用5個位點成功鑒定了97%的子代個體，當運用6個位點后，子代的鑒定率達到100%。實際家系鑒定中的累積鑒定成功率與模擬家系基本一致(見圖1)。

圖1 6個微衛星位點模擬和實際鑒定的累積鑒定成功率

2.2 親本和子代遺傳多樣性比較

表2顯示了6個微衛星位點在親本和子代群體中的等位基因數(Na)，等位基因長度范圍，期望和觀測雜合度(He、Ho)。親本群體中等位基因數為6～13，平均值為10.8。子代中沒有出現等位基因丟失現象。子代群體的期望雜合度顯著低于親本(P<0.05)。但子代的觀測雜合度和親本群相比略有降低，但是差異不顯著(P=0.345)。

家系鑒定結果成功鑒定出14個父本和16個母本組成的144對親本組合。對于父本，子代數目從7～40，平均數為21.5；對于母本，子代數目從7～34，平均數為18.8。每個親本的平均子代比例如表3所示。本研究中，所有親本參與繁殖，母本的平均子代比例為6.25%，父本的平均比例為7.14%。在所有的16個母本中均發現多重父權現象，每個母本的卵子與5～12個父本的精子受精。對所有母本來說，由不同雄性個體作為父本的子代比例和遺傳有效父權頻率如表4所示。父本根據所產生子代的比例由高到低排列，平均有9個父本與每個母本個體受精，且平均遺傳有效父權頻率為3.27。在14個父本中也存在多重母權現象，每個父本的精子與4～14個母本的卵子受精。對所有父本來說，由不同雌性個體作為母本的子代個體比例和遺傳有效母權頻率如表5所示。母本根據所產生子代的比例由高到低排列，平均有10.29個母本與每個父本個體受精，且平均遺傳有效母權頻率為3.14。

表2 魁蚶親本和子代遺傳多樣性的比較

注：①Sample size；②Alleles range；③No. of alleles；④Expected heterozygosity；⑤Observed heterozygosity

3 討論

3.1 家系分析

在人工育苗生產中，為防止系譜信息錯誤的逐級放大，導致群體大規模的近交、退化[17]，準確的家系鑒定對于避免近交具有重要意義。在實際鑒定之前使用模擬鑒定，可以調整位點的數量，有利于減少成本、提高效率。本研究的實際鑒定結果與模擬鑒定基本一致。

表3 各親本的繁殖成功率Table 3 Percentage of parental contribution to reproduction

Note：①All females；②All males.

Note：①No. of males participating in clutches；②No. of clutches (% of total)；③Paternity proportion of most successful male；④Paternity proportion of second-most successful male；⑤Paternity proportion of third-most successful male；⑥Paternity proportion of fourth-most successful male；⑦Paternity proportion of the least successful male；⑧Genetically effective paternity

基因分型錯誤、無效等位基因和DNA質量較差是造成家系鑒定不匹配的主要原因[18]，其中無效等位基因頻率高于5%時，會降低家系鑒定的效率[19]。海洋軟體動物的自然種群中，利用微衛星標記經常會觀測到雜合子缺失的現象[20-21]。在本研究中，6個微衛星位點中，雖有5個位點(Sb51、ScBr04、ScBr20、ScBr14和ScBr09)由于純合子過剩，可能存在無效等位基因，但在鑒定過程中，并未降低家系鑒定的置信度。使用這6個魁蚶微衛星位點成功鑒定了30個親本及其300個子代的親子關系，表明這6個位點用于家系鑒定的有效性。

3.2 遺傳多樣性和親本貢獻率

養殖群體和野生群體相比，由于其親本數量有限，親本與子代間基因頻率經常發生遺傳漂變及遺傳多樣性的降低[22]。遺傳多樣性的降低表現為等位基因數和雜合度的降低[23-25]，會對水產動物生產性狀產生不利影響，例如生長率下降、適合度降低[26-27]。本研究中，所有親本都參與了生產繁殖，避免了等位基因多樣性的降低，但由于5個位點可能含有無效等位基因，因此子代和親本相比，觀測雜合度略有降低，但不顯著。

表5 交配組母權比例(平均值±標準差)Table 5 Maternity proportions for clutches (Mean ± SD)

Note：①No. of females participating in clutches；②No. of clutches (% of total)；③Maternity proportion of most successful female；④Maternity proportion of second-most successful female；⑤Maternity proportion of third-most successful female；⑥Maternity proportion of fourth-most successful female；⑦Maternity proportion of the least successful female；⑧Genetically effective maternity

多重父權或多重母權現象在混交動物中普遍存在[28]。本研究的父權分析表明，在所有的繁殖個體中均存在多重父權現象，每個交配組的遺傳有效父權頻率顯著大于1，說明魁蚶雄性精子的競爭程度比較高?？赖挠行笝囝l率也顯著大于1，表明在配子水平上存在多重母權現象，這種現象在大西洋鱈魚和太平洋牡蠣中也有報道[29-30]。

4 結語

本實驗對魁蚶人工養殖群體的研究，證實使用微衛星進行魁蚶家系分析可以鑒定親本的繁殖成功率，監測生產活動中遺傳變化，為今后魁蚶人工育苗、養殖生產制定合理的管理方針提供幫助，同時為微衛星作為分子標記進行魁蚶增殖放流溯源提供科學支持。

[1] 梁超, 楊愛國, 劉志鴻, 等. 4個地理群體魁蚶(Scapharcabroughtonii)的形態差異與判別分析[J]. 海洋科學, 2011, 35(11): 108-113.

[2] Li R, Li Q, Wang C. Sibship reconstruction and effective population size estimation in mass spawning ark shell,Scapharcabroughtoniibased on microsatellite analysis [J]. Genes Genom， 2013, 35(6): 703-708.

[3] Queller D C, Strassmann J E, Hughes C R. Microsatellites and kinship [J]. Trends Ecol Evol, 1993, 8(8): 285-288.

[4] Desvignes J F, Laroche J, Durand J D, et al. Genetic variability in reared stocks of common carp (CyprinuscarpioL.) based on allozymes and microsatellites [J]. Aquaculture, 2001, 194(3): 291-301.

[5] Holland D C. Identity and agency in cultural worlds [M]. Massachusetts： Harvard University Press, 2001.

[6] 蘇天鳳, 熊小飛, 江世貴, 等. 斑節對蝦7個全同胞家系間親緣關系的微衛星分析 [J]. 南方水產科學, 2010, 6(6): 1-7.

[7] Norris A T, Bradley D G, Cunningham E P. Microsatellite genetic variation between and within farmed and wild Atlantic salmon (Salmosalar) populations [J]. Aquaculture, 1999, 180(3): 247-264.

[8] Sekino M, Kurokawa T, Sasaki K. Multiplex PCR panels of novel microsatellites for the ark shellScapharcabroughtonii(Pteriomorphia, Arcoida) [J]. Conserv Genet Resour, 2010, 2(1): 39-42.

[9] Tian J T, Liu Z H, Zhou L Q, et al. Isolation and characterization of 48 polymorphic microsatellite markers for the blood clamScapharcabroughtonii(Arcidae) [J]. Genet Mol Res, 2012, 11(4): 4501-4507.

[10] Li M, Zhu L, Zhou C Y, et al. Development and characterization of EST-SSR markers fromScapharcabroughtoniiand their transferability inScapharcasubcrenataandTegillarcagranosa[J]. Molecules, 2012, 17(9): 10716-10723.

[11] Li Q, Kijima A. Microsatellite analysis of gynogenetic families in the Pacific oyster,Crassostreagigas[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2006, 331(1): 1-8.

[12] Li Q, Park C, Kijima A. Allelic transmission of microsatellites and application to kinship analysis in newly hatched Pacific abalone larvae [J]. Fisheries Sci, 2003, 69(5): 883-889.

[13] Li N, Li Q, Kong L F, et al. Development of three multiplex PCRs in the ark shellScapharcabroughtoniiand their validation in parentage assignment [J]. Journal of Ocean University of China，(Unpublished).

[14] Oosterhout C V, Hutchinson W F, Wills D P M, et al. Micro-Checker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data [J]. Mol Ecol Notes, 2004, 4(3): 535-538.

[15] Wang J. A new method for estimating effective population sizes from a single sample of multilocus genotypes[J]. Mol Ecol, 2009, 18(10): 2148-2164.

[16] Bekkevold D, Hansen M M, Loeschcke V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadusmorhua, L.)[J]. Mol Ecol, 2002, 11(1): 91-102.

[17] Hoffman J I, Amos W. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion[J]. Mol Ecol, 2005, 14(2): 599-612.

[18] Jerry D R, Preston N P, Crocos P J, et al. Parentage determination of Kuruma shrimpPenaeus(Marsupenaeus)japonicususing microsatellite markers (Bate) [J]. Aquaculture, 2004, 235(1): 237-247.

[19] Marshall T C, Slate J, Kruuk L E B, et al. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations[J]. Mol Ecol, 1998, 7(5): 639-655.

[20] Prakoon W, Tunkijjanukij S, Nguyen T T, et al. Spatial and temporal genetic variation of green mussel,Pernaviridisin the gulf of Thailand and implication for aquaculture [J]. Mar Biotechnol, 2010, 12(5): 506-515.

[21] Arias-Pérez A, Fernández-Tajes J, Gaspar M B, et al. Isolation of microsatellite markers and analysis of genetic diversity among east atlantic populations of the sword razor shellEnsissiliqua: a tool for population management [J]. Biochemical Genetics, 2012, 50(5-6): 397-415.

[22] Hedgecock D, Sly F. Genetic drift and effective population sizes of hatchery-propagated stocks of the Pacific oyster,Crassostreagigas[J]. Aquaculture, 1990, 88(1): 21-38.

[23] Allendorf F W, Phelps S R. Loss of genetic variation in a hatchery stock of cutthroat trout [J]. T Am Fish Soc, 1980, 109(5): 537-543.

[24] Ryman N, St?hl G. Genetic changes in hatchery stocks of brown trout (Salmotrutta) [J]. Can J Fish Aquat Sci, 1980, 37(1): 82-87.

[25] Cross T F, King J. Genetic effects of hatchery rearing in Atlantic salmon [J]. Aquaculture, 1983, 33(1): 33-40.

[26] Koehn R K, Diehl W J, Scott T M. The differential contribution by individual enzymes of glycolysis and protein catabolism to the relationship between heterozygosity and growth rate in the coot clam,Mulinialateralis[J]. Genetics, 1988, 118(1): 121-130.

[27] Danzmann R G, Ferguson M M, Allendorf F W. Genetic variability and components of fitness in hatchery strains of rainbow trout [J]. J Fish Biol, 1989, 35(Supplement A): 313-319.

[28] Gibbs H L, Weatherhead P J. Insights into population ecology and sexual selection in snakes through the application of DNA-based genetic markers [J]. J Hered, 2001, 92(2): 173-179.

[29] Li R, Yu R. Parentage determination and effective population size estimation in mass spawning Pacific oyster,Crassostreagigas, based on microsatellite analysis [J]. J World Aquacult Soc, 2009, 40(5): 667-677.

[30] Rakitin A, Ferguson M M, Trippel E A. Sperm competition and fertilization success in Atlantic cod (Gadusmorhua): effect of sire size and condition factor on gamete quality [J]. Can J Fish Aquat Sci, 1999, 56(12): 2315-2323.

責任編輯 朱寶象

Parentage Determination ofScapharcabroughtoniiBased on Microsatellite Analysis

SUN Nan, LI Qi, YU Hong, KONG Ling-Feng

(College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

In this study, six highly polymorphic microsatellite markers (meanHe= 0.78 andPIC=0.75) were utilized to determine the pedigree and the genetic variability between brood stock and offspring in a mass spawning event of ark shell,Scapharcabroughtonii. Parentage identification was performed on a total of 330 individuals, including 300 offspring and 30 candidate parents. The results showed that the assignment rate was in accordance with simulation. Using 6 microsatellites reached a successful rate of over 99%. The allelic diversity of offspring populations and brood stock was similar wirth each other, but the expected heterozygosity of offspring was less than that of parents significantly (P<0.05). The observed heterozygosity of offspring was a little lower than that of parents, but not significant. All the 30 parents participated in the reproduction. And the existence of multiple paternity and maternity was detected in clutches and dams in these 30 parents. Microsatellite could be effective markers in parentage determination, meanwhile the gentic diversity of hatchery population ofScapharcabroughtoniineed to be monitored. The information obtained in this study was useful for designing suitable management guidelines of cultured stocks in future, and provided a scientific basement for tracing origins in the releasing and enhancement ofScapharcabroughtoniiusing microsatellite as molecular markers.

Scapharcabroughtonii; microsatellites; parentage analysis

國家海洋公益性行業科研專項項目(201205023)；國家科技支撐計劃項目(2011BAD13B01)資助

2014-07-11；

2014-12-18

孫 楠(1990-)，女, 碩士生, 從事水產動物遺傳育種學研究。 E-mail: sun-shihan@163.com

?? 通訊作者：E-mail: qili66@ouc.edu.cn

S968.31

A

1672-5174(2015)09-042-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140232