丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機制的實驗研究進展

曹澤標，周小青*，張利美，陳娉婷，劉旺華

（1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410007）

丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機制的實驗研究進展

曹澤標1，周小青2*，張利美1，陳娉婷1，劉旺華2

（1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南 長沙 410007）

丹龍醒腦方；缺血性腦損傷；機制；級聯反應；神經再生

腦血管病是威脅中老年人健康的常見疾病，據衛計委《2014中國衛生和計劃生育統計年鑒》顯示，在2013年居民主要疾病發病率、死亡率和致殘率中，腦血管病都排前三位，給社會和家庭帶來了巨大負擔，而腦血管病中約80%屬缺血性[1]。研究表明，腦缺血后，將發生缺血性腦損傷級聯反應[2]，使神經細胞大量丟失導致腦功能缺失；同時處于“靜息”狀態下的神經干細胞被激活而發生神經再生[3]。因此，干預級聯反應減少腦缺血后神經細胞丟失和促進神經再生已成為治療缺血性腦血管病的主要途徑。

丹龍醒腦方是周小青教授經驗方，用于治療缺血性腦血管病，現已作為附屬醫院院內制劑，并獲得了中藥新藥臨床研究批文（批件號：2003L1997）。十多年來，在臨床應用該復方取得良好療效的同時，研究人員結合現代科技，對其抗缺血性腦損傷的機制進行了大量實驗研究，發現其能針對腦缺血后的病理生理過程進行多方位、多環節、多靶點干預，現將有關研究成果和進展綜述如下。

1 丹龍醒腦方與缺血性腦損傷級聯反應

1.1 缺血性腦損傷級聯反應

缺血性腦損傷是一個復雜的病理生理過程，它包括缺血期的原發性損傷和再灌注期的繼發性損傷，二者緊密聯系，呈現出級聯反應。概括地說，該級聯反應主要涉及代謝紊亂、炎癥反應、循環障礙和細胞凋亡等環節。

1.1.1 代謝紊亂 該級聯反應的始動因素是缺血缺氧，導致ATP合成減少，離子泵部分功能失效和細胞膜去極化，細胞間隙中以谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)為代表的興奮性氨基酸（EAAs）濃度升高，呈現出一定的毒性；同時Ca2+大量進入胞內出現鈣超載，線粒體功能障礙并損傷，一氧化氮（NO）等自由基及其代謝產物如丙二醛(MDA)生成增多、自由基生成抑制劑如超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，從而表現出一定的氧化損傷[4]。

1.1.2 炎癥反應 氧自由基及其他信使可激活核轉錄因子尤其是核因子κB亞基(NF-κB)調控的炎癥相關基因的表達[5]，導致炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等表達增多，同時趨化因子釋放，黏附分子如細胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子l等表達上調，白細胞黏附于血管內皮細胞阻塞微血管，形成“無復流現象”，并釋放大量炎性介質和細胞因子，吸引更多中性粒細胞浸潤，加重炎癥，造成惡性循環。

1.1.3 循環障礙 自由基和鈣超載可進一步導致血液流變學改變，如腦血管痙攣、紅細胞變形性差、血小板聚集、纖維蛋白含量增加、血液黏稠度增加等，致使腦微小血管血栓形成；另外，NO等自由基的擴血管作用及炎性反應可使血腦屏障（BBB）通透性增加，甚至破壞BBB[6]。

1.1.4 細胞凋亡 腦缺血后EAAs毒性、鈣超載等各種誘導因素可引起細胞凋亡啟動，然后主要通過死亡受體通路和線粒體通路介導細胞凋亡，表現為前者重要因子Fas/FasL、TNF-α、Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）、凋亡蛋白酶（caspase）-8、caspase-3等表達上調；后者的重要因子細胞色素-C（Cyto-C）、第二種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活物（Samc）、caspase-9、caspase-3等表達上調[7]，凋亡抑制蛋白（IAPs）尤其是X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）表達下調。細胞凋亡受基因調控，腦缺血后，促凋亡基因（如Bax）及抑制凋亡基因（如Bcl-2）表達會發生動態變化[8]，影響神經細胞凋亡。需要指出的是，上述各環節常密切相關，互為因果，彼此重疊，形成惡性循環，最終導致腦細胞死亡和腦功能缺失。

1.2 丹龍醒腦方可多環節干預缺血性腦損傷級聯反應

1.2.1 調節腦組織代謝 研究發現，丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷機制與其調節腦組織代謝有關。研究者用雙側頸總動脈反復夾閉再灌注同時腹腔注射硝普鈉建立VD大鼠模型，研究該方對腦組織代謝的影響。結果顯示丹龍醒腦片組能使Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯升高，腦組織中Glu、Asp、MDA、Ca2+的含量明顯降低，SOD活性顯著升高。表明該方能改善腦組織能量代謝障礙，維持細胞的主動轉運功能，使細胞內外離子濃度趨向正常[9]；能調節腦組織EAAs含量、減輕其興奮性毒性，保護大腦神經細胞[10]；還可以改善自由基代謝、減輕神經細胞Ca2+超載[11]。另外，對腦缺血再灌注沙土鼠模型，丹龍醒腦片也能調節其腦組織EAAs含量、減輕其興奮性毒性，保護大腦海馬區神經元[12]。

1.2.2 抑制腦內炎癥 多項實驗表明丹龍醒腦方可通過抑制炎癥來發揮抗缺血性腦損傷的作用。在觀察活血通絡法（丹龍醒腦方）對大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)再通誘導的中性粒白細胞浸潤的影響時，發現丹龍醒腦方能降低腦組織髓過氧化物酶（MPO）活性，減輕再灌注腦組織中性粒白細胞的浸潤[13]。研究組成員還分別就丹龍醒腦方對老齡大鼠腦缺血再灌注模型的NF-κB及相關炎癥因子的表達進行了探討[14-16]，顯示該方能顯著抑制NF-κB及ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的表達，表明丹龍醒腦片抗老年腦缺血再灌注損傷的保護機制與其抑制由缺血再灌注損傷誘導的NF-κB及相關炎癥因子的表達有關。

1.2.3 改善大腦血液循環 研究人員觀察了丹龍醒腦片對VD模型大鼠血液流變學的改善作用，發現丹龍醒腦片組全血黏度、血漿黏度、紅細胞壓積及纖維蛋白原濃度均降低，提示丹龍醒腦片能通過改善腦缺血損傷后大鼠血液流變狀態，從而改善大腦血液供應[17]。對實驗性腦血栓形成大鼠保護作用及對花生四烯酸(AA)代謝的影響研究表明，丹龍醒腦片組腦組織伊文思蘭吸光度值A620、血漿血栓素B2（TXB2）、6-酮前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量均明顯降低，顯示丹龍醒腦片對血栓誘導劑誘導的腦血栓形成具有抑制作用，對腦血栓形成后腦血管通透性的升高有抑制作用，其作用可能是通過對抗腦血栓形成而發揮的[18]。

1.2.4 減少神經細胞凋亡 大量研究證實丹龍醒腦方抗缺血性腦損傷的一個非常重要的機制是減少神經細胞的凋亡。研究顯示丹龍醒腦片能使MCAO大鼠模型神經細胞凋亡指數（AI）和凋亡神經細胞積分光密度（IOD）明顯降低，海馬區存活細胞數明顯增多[19]，表明該方能減少神經細胞凋亡。研究者還從介導細胞凋亡的兩條主要信號通路進行了探討，發現該方能顯著抑制Fas/FasL、TNF-α的表達，使FADD、caspase-8、caspase-3陽性細胞數明顯減少，表明該組方的作用機制可能與抑制細胞凋亡死亡受體通路有關[20-21]。對于線粒體通路，該方能顯著減少Cyto-C、caspase-9、caspase-3、Smac并促進XIAP的表達，保護神經元及神經功能，提示該方作用機理與抑制細胞凋亡線粒體通路有關[22]。另外，研究人員還從細胞凋亡基因調控層面進行了研究，發現丹龍醒腦方組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著性增加，凋亡基因Bax蛋白表達降低，表明丹龍醒腦方能通過增強Bcl-2的表達、抑制Bax的表達來抑制神經元凋亡，起到保護神經元的作用[23]。

2 丹龍醒腦方與缺血性腦損傷后神經再生

2.1 缺血性腦損傷后神經再生

缺血性腦損傷后的神經再生主要是指神經干細胞（NSCs）的增殖、遷移和分化過程。神經干細胞終身具有分裂潛能和自我更新能力，廣泛存在于神經系統[24]。研究顯示，在腦組織發生缺血缺氧等損傷后，NSCs能通過不對稱分裂增殖分化成神經元和膠質細胞，同時向梗死區遷移，參與神經功能的修復過程，即神經發生。在此過程中，神經干細胞所表達的特異性標志物巢蛋白（Nestin）及星形膠質細胞特異性活化的標志蛋白膠質纖維酸性蛋白 （GFAP）等表達升高[25]。同時，神經再生還受多種調節因子和信號通路的調控。研究表明，損傷后多種促進神經再生的生長因子如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），細胞因子如睫狀神經營養因子（CNF）及營養因子如膠質源性神經營養因子（GDNF）、神經生長因子（NGF）的表達增加[26]，這些神經再生的調節因子在NSCs增殖、分化中發揮重要作用。同時，與神經干細胞增殖分化相關的信號通路如Wnt/β-catenin[27]、Notch、骨形成蛋白、促分裂素原活化蛋白激酶、NF-κB信號通路等啟動，從各個環節對NSCs的增殖、遷移和分化進行調控。同樣，各調節因子和信號通路并非孤立的，而是交叉重疊，相互影響，共同構成了一個影響神經再生的精密網絡調控系統。

2.2 丹龍醒腦方能促進缺血性腦損傷后神經再生

2.2.1 促進NSCs的增殖和分化 研究者以5-溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法檢測NSCs增殖，顯示丹龍醒腦方組NSCs增殖數量顯著升高，表明該方能促進NSCs的增殖[28]。同時，研究人員還通過免疫組化法檢測Nestin，間接探討該方促NSCs增殖作用，同樣用免疫組化法檢測GFAP來探討其促NSCs分化作用，發現丹龍醒腦方組在治療3 d和7 d后Nestin的平均光密度增加，GFAP的平均灰度值減少，提示該方能促進NSCs增殖和分化，其抗腦缺血損傷的機制可能與促進海馬區神經細胞增殖和分化有關[29]。

2.2.2 促進多種促神經再生調節因子的表達 研究人員通過探討丹龍醒腦方對大鼠腦缺血再灌注后NGF、bFGF和GDNF表達的影響，發現較之模型組，丹龍醒腦方中、大劑量組NGF、bFGF、GDNF的陽性表達灰度值均顯著降低，即陽性率增大，提示丹龍醒腦方可能通過促進NGF、bFGF、GDNF的表達來促進NSCs增殖[28]。

2.2.3 通過調控相關信號通路促進神經再生 腦缺血后神經再生受多條信號通路的調控，有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在NSCs的增殖分化中起重要作用，甚至處于核心地位[30]。本研究組也從Wnt/β-catenin通路探討了丹龍醒腦方促進MCAO大鼠神經再生的機理。近期研究發現，與模型組比較，西藥組、丹龍醒腦方組BrdU陽性細胞數、βcatenin、Wnt-3a蛋白及mRNA表達明顯增強，差異有統計學意義，表明丹龍醒腦方可能通過激活βcatenin及Wnt-3a蛋白表達促進神經干細胞增殖[31]，即與調節Wnt/β-catenin通路活化有關。

3 結語

丹龍醒腦方由丹參、三七、地龍、石菖蒲、遠志、菟絲子、淫羊藿等組成，具有活血通絡、化痰開竅、補腎生髓之功。大量研究顯示[32-33]，對于缺血性腦損傷，活血通絡和化痰開竅法能干預級聯反應，補腎生髓法能促進神經干細胞的增殖分化。另外，現代藥理研究也表明，丹參酮ⅡA能降低腦水腫，清除自由基，抑制炎癥[34]，減少神經細胞凋亡[35]；三七總皂苷能降低腦部細胞因子的表達和血腦屏障通透性[36]；香港遠志黃酮苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠BBB有保護作用[37]；淫羊藿及其提取物對NSCs具有直接促增殖作用[38]。這些都可能是丹龍醒腦方多環節干預級聯反應和促進神經再生的物質基礎，值得進一步研究。

然而，在取得大量實驗研究成果的同時，還有一些尚待完善之處：（1）在多環節干預級聯反應方面已經積累了較多成果，但對促進神經再生方面研究較少，而且不夠系統、深入，尤其是對可能的信號通路的研究，尚未見報道；（2）丹龍醒腦方干預級聯反應機制及促進神經再生機制分別在抗缺血性腦損傷中的作用時間窗及二者間相互關系有待研究；（3）對級聯反應中各環節其他靶點的干預、對不利于神經再生相關調節因子的作用及對與神經再生相關的其他信號通路的影響尚待研究；（4）除對方中主要成分三七總皂苷進行了抗缺血性腦損傷部分研究外，尚缺乏從本方藥理學角度探討其抗缺血性腦損傷的機制，顯然不利于該方科學性的解釋和新藥的開發；（5）目前研究多局限在動物實驗，尚未見細胞水平的研究報道。面對這些問題，研究組正在對其中一部分進行探討，而且已經取得了一定成果；對某些尚未著手研究的部分，期待將來條件成熟時逐漸解決。

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（本文編輯 匡靜之）

Experimental Research Progress on the M echanism of Danlongxingnao Fang against Ischem ic Brain Injury

CAO Zebiao1,ZHOU Xiaoqing2*,ZHANG Limei1,CHEN Pingting1,LIU Wanghua2

（1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China; 2.Research Institute for Diagnostics of TCM,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

Danlongxingnao Fang;ischemic brain damage;mechanism;cascade reaction;nerve regeneration

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.04.019

2014－12－24

國家自然科學基金資助項目（81373702，81473567）。

曹澤標，男，在讀碩士研究生，研究方向：中醫心腦血管疾病證治。

*周小青，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：zxq5381@sohu.com。