海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacien)產抗生素Macrolactin A的碳源優化*

侯東園 吳祖芳 張 鑫

(寧波大學海洋學院 應用海洋生物技術教育部重點實驗室 寧波 315211)

由于從陸地微生物中探查篩選天然藥物及發現新的代謝產物的速率減緩(Tulpet al, 2004), 加之海洋環境的特殊性, 從海洋獲取藥物資源成為新世紀海洋生物技術的重要發展方向(Haefner, 2003; 王征等, 2006)。Macrolactin系列天然產物是美國 Scripps海洋研究所 Fenical教授課題組發現的一類具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性的24元環大環內酯類抗生素(Heet al, 2012b), 目前該家族共有19個成員(Gustafsonet al, 1989; Jaruchoktaweechaiet al,2000)其中Macrolatin A是由24元內酯環、吡喃型葡萄糖和一個開鏈的酸構成, 結構式如圖 1所示。Macrolactin A不但有抗菌作用, 而且在體外有顯著抑制B16-F10黑色素瘤細胞活性, 更為重要的是Macrolactin A能有效抑制哺乳動物Ⅰ型和Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex)的復制及HIV在T淋巴細胞內的復制(Kimet al, 1997; 董曉毅等, 2008)。然而, 由于Macrolactin A結構復雜、化學合成步驟多, 得率非常低, 通過天然生物材料直接提取, 分離步驟多, 樣品易變性, 因此藥源不足已成為制約該類化合物進一步研發的瓶頸。

為了實現Macrolatin A的大規模生產, 生物發酵是其理想途徑, 本研究采用一株前期研究得到的可穩定產 Macrolactin類化合物的海洋細菌海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) ESB-2 (Heet al,2012a), 能夠高效合成 Macrolatin A, 由于發酵法生產受培養條件和環境等影響較大, 因此必須通過優化發酵工藝條件來提高Macrolatin A的產量。前期研究中通過發酵條件優化使其產量有所提高(Heet al,2012a), 鑒于目前國內外還未有對產 Macrolactin A微生物培養基成分優化的報道(Yanget al, 2009), 作為培養基重要組分的碳源是細胞生長最重要的營養和能量來源, 碳源種類對于細胞催化的次級代謝水平具有不同的抑制效應(Kimet al, 2005)。而Macrolactin A產生量的檢測必需對發酵培養液進行分離純化過程; 高速逆流色譜法(high speed countercurrent chromatography, HSCCC)作為一種能在一個流程中分離復雜樣品中極性差異較大的各個組分制備純品的分離技術(Ito, 1991), 其方法簡捷和快速高效, 儀器及試劑成本明顯低于高效液相色譜(Owenet al, 1997;Liet al, 2001), 已廣泛應用于生物工程、中藥成分分析和制備、天然產物化學等領域(孫媛媛等, 2003), 在微生物產物的分離純化方面及多種結構類型抗生素的分離純化方面也得到成功的運用(Dalhoffet al,2003; Nishivamaet al, 2000)。

為提高該菌生產 Macrolactin A的產量, 本研究采用大孔樹脂靜態吸附法對該菌株的次級代謝產物進行粗提取, 進一步采用高速逆流色譜法對該菌株的粗提物進行分離提純, 得到高純度的單體化合物,探究了不同碳源對 Macrolactin A產量的影響, 現將主要研究結果報道如下。

圖1 Macrolactin A的化學結構Fig.1 The chemical structure of Macrolactin A

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)ESB-2, 保藏于寧波大學海洋學院海洋生物實驗室。

1.1.2 培養基 2216E基礎培養基, 蛋白胨5.0g、酵母粉 1.0g、瓊脂 15.0g、海水晶 35.0g、硫酸亞鐵0.1g、1000mL蒸餾水, 用于ESB-2菌株平板培養; 液體培養基, 蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、海水晶35.0g、硫酸亞鐵0.1g、1000mL蒸餾水, 用于ESB-2搖瓶液體發酵。所有培養基均在 121°C, 1×105Pa下滅菌20min備用。

1.1.3 主要儀器及試劑 高效逆流色譜系統:TAUTO HSCCC-TBE300B高速逆流色譜儀(螺旋管行星式串聯三柱逆流色譜儀, 管徑 2.6mm, 柱體積280mL, 進樣體積20mL), SHP DC-0506低溫恒溫槽,AKTAprime plus泵, 上海同田生物技術有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀, 色譜分析柱 YMCPack ODS-A(150 mm ×4.6 mm, 5 μm), 美國 Waters公司; SPX型智能生化培養箱, 寧波江南儀器廠; GL-21MC臺式高速冷凍離心機, 湖南湘儀; UV-3300紫外可見光分光光度計; LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器, 上海申安醫療器械廠; SW-CJ-2D型超凈工作臺; HGC-12D氮吹儀; PHS-3C pH計; RE-52C旋轉蒸發器等。

甲醇、乙腈(色譜級, CNW公司), 正戊烷、乙酸乙酯、ADS-30大孔樹脂、無水乙醇, 瓊脂粉、氯化鈉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、糊精、可溶性淀粉、乳糖、甘油、油酸等(分析純, 國藥)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化及發酵培養 取菌株 ESB-2在基礎培養基上活化24h, 接種于裝有100mL基礎發酵液的250mL三角瓶中, 置于控溫搖床中, 30°C、150r/min活化24h, 作為種子液, 再以5%接種量, 接種到發酵培養液中, 30°C、150r/min發酵48h, 發酵液備用。

1.2.2 菌株發酵產物Macrolactin A的粗提取 發酵液用乙酸乙酯等體積萃取三次, 合并提取液, 45°C旋轉蒸發至干, 加入1mL甲醇溶解, 12000r/min離心15min, 取上清液。

1.2.3 碳源篩選 選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、可溶性淀粉、甘油和油酸8種不同類型的碳源, 以 1%的添加量添加到基礎平板培養基中, 觀察其生長情況, 選擇該菌株可利用的碳源。

1.2.4 碳源優化 可利用碳源添加量為 1%, 接種同批次種子菌懸液, 5%接種量, 40%裝液量, 30°C, 搖瓶轉速 150r/min, 發酵 48h, 乙酸乙酯等體積萃取三次, 旋轉蒸干, 甲醇溶解離心處理得上清液, 經 0.45μm微孔濾膜過濾, HPLC法檢測得到Macrolactin A的產量, 比較加入不同碳源的培養基得到的該菌株產物Macrolactin A的含量。

1.2.5 Macrolactin A純品的制備 Macrolactin A粗品的制備: 分批次搖瓶共培養30L發酵液, 對發酵液進行菌體離心(8000 r/min, 10min)、利用ADS-30大孔樹脂靜態吸附上清液, 選擇無水乙醇解吸附, 得到無水乙醇洗脫液, 旋轉蒸發至干得到活性浸膏, 純水懸浮, 采用乙酸乙酯萃取三次, 旋轉蒸干用甲醇溶解,得到Macrolactin A的粗提取物, 氮氣吹干備用。

逆流分離: 按照V(乙酸乙酯) :V(正己烷) :V(甲醇)︰V(水)為 4︰3︰4︰3溶劑體系將所有溶劑加入分液漏斗中, 充分振搖后靜置待其分層分相; 取上相作為高速逆流色譜的固定相, 取下相為流動相, 上、下相超聲脫氣 20 min備用; 用流動相與固定相的混合溶液 [按照V(流動相) :V(固定相) = 1︰1的比例]配制樣品液(章能勝等, 2010)。高速色譜系統開機預熱, 將固定相以30mL/min的恒定速度泵滿螺旋管柱,開啟速度控制器, 使高速逆流色譜儀螺旋管柱按順時針方向旋轉轉速為800 r/min, 再以流速為10mL/min泵入流動相, 檢測波長 280nm, 根據色譜圖手動收集色譜峰組分。

純度分析: 利用HPLC法對制備得到的樣品進行純度分析, 所用色譜分析柱為 YMC-Pack ODS-A(150 mm × 4.6 mm, 5 μm), 檢測波長 280nm, 柱溫30°C, 流動相為甲醇和水; 梯度洗脫60min內甲醇由10%升至 90%, 然后用甲醇和水繼續洗脫 10min, 流速0.8mL/min, 進樣量10μL。

1.2.6 Macrolactin A含量的檢測 標準曲線的制作, 準確稱取高速逆流色譜法制備的純品做對照品,用甲醇溶解并定容至濃度 1mg/mL, 用甲醇逐級稀釋到 0.2、0.04和 0.008mg/L濃度的純品溶液測定, 以各個濃度標準溶液測定出的峰面積對應的質量濃度作圖, 得到標準曲線并求出回歸方程。

含量檢測: 利用高效液相色譜法測定Macrolactin A的含量, 測定條件為色譜柱YMC-Pack ODS-A (150 mm ×4.6 mm, 5 μm), 檢測波長 280nm, 柱溫 30°C, 流動相(A)甲醇: (B)水; 梯度洗脫60min內甲醇(A)由10%升至90%, 流速0.8mL/min, 進樣量10μL。

1.2.7 菌株生長曲線、pH及總糖的測定 引用相關文獻方法(楊云喜等, 2014), 將上述 ESB-2種子液以 5%的接種量接種于麥芽糖培養基中, 采用空白培養基對照, 三次平行, 每隔2h取5mL發酵液迅速測其OD值并記錄; 采用pH計直接測發酵液pH; 采用蒽酮比色法測定總糖。

2 結果與分析

2.1 Macrolactin A純品的制備

2.1.1 Macrolactin A的 HSCCC分離及純度檢測采用V(乙酸乙酯) :V(正己烷) :V(甲醇) :V(水)為4︰3︰4︰3的溶劑體系, 按照1.2.5的方法進行分離, 將樣品溶于10mL等體積上相和下相混合溶液中, 進行HSCCC分離, 得到 HSCCC分離圖(圖 2), 測得固定相的保留率為48%。根據色譜圖手動收集各色譜峰組分, 利用HPLC將每一試管收集的組分進行分析, 根據 HPLC色譜圖上的保留時間及光譜圖可以初步判斷收集的餾分A為Macrolactin A, 同時采用HPLC峰面積歸一化法, 計算分離得到的餾分純度達 95.8%,其HPLC圖譜與光譜圖結果如圖3所示。

圖2 Macrolactin A粗提物的HSCCC色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of the crude extract of Macrolactin A

圖3 HSCCC分離純化得到的Macrolactin A高效液相色譜圖(a)及紫外光譜圖(b)Fig.3 HPLC and UV of Macrolactin A by HSCCC

本研究首先采用ADS-30大孔樹脂對發酵液進行初步純化的處理, 取代乙酸乙酯萃取, 節約了有機溶劑的使用, 使用高效液相色譜測得其純度達 23%以上。繼而利用HSCCC對其進一步分離純化, HSCCC分離中容積體系的選擇對分離效果至關重要, HSCCC分離規律顯示, 一個好的容積系統固定相要有較高的保留率, 兩相系統分離時間小于 30s; 分配系數K盡量符合0.5

2.1.2 Macrolactin A標準曲線 用甲醇溶解以上制備的純品并定容至濃度 1mg/mL, 用甲醇逐級稀釋到0.2、0.04、0.008mg/L濃度的純品溶液測定, 以各個濃度標準溶液測定出的峰面積對應的質量濃度作圖, 測得 Macrolactin A色譜峰面積與其質量濃度的線性方程為Y=2.9E+6X–33234, 相關系數R2=0.998。

高效液相色譜法雖耗時比較長、成本較高, 但是目前測定抗生素效價最為準確的方法。試驗采用外標法, 分別將對照品與待測物質進行液相色譜法測定,可根據相同保留時間對應的峰值的峰面積的比例來測定待測物的含量(王洪強等, 2013)。

2.2 碳源篩選優化分析

2.2.1 碳源篩選 選擇乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉和油酸對ESB-2進行不同碳源利用實驗, 添加濃度均為 1%, 固定培養基其它成分, 培養條件30°C, 24h。通過平板培養計數觀察發現(圖4), 2216E基礎培養基與添加了乳糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘油、糊精和可溶性淀粉這幾種碳源的培養基均可被該菌株利用, 油酸抑制該菌株生長。其中較好利用的分別為淀粉、麥芽糖和乳糖, 其它幾種碳源利用情況相對較差。

圖4 碳源對ESB-2的菌落總數的影響Fig.4 Effect of carbon sourceon thenumber of totalcolony of ESB-2

培養基的碳源是能夠向微生物提供組成細胞物質或者代謝產物中碳骨架的營養物質, 是組成培養基的重要成分之一, 本研究選擇了單糖, 雙糖,多糖等多種類碳源對其進行碳源利用實驗。由結果可以看出碳源對海洋解淀粉芽孢桿菌 ESB-2菌株的生物量具有重要的的影響, 從而選擇出乳糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉作為碳源, 進一步考察不同碳源對該菌株產Macrolactin A的影響。

2.2.2 碳源對 ESB-2菌株產 Macrolactin A的影響用基礎培養基做對照, 選擇乳糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘油、糊精、可溶性淀粉7種不同的碳源,其質量濃度均為 1% (W/V), 培養基其它成分不變,進行發酵, 其對菌體的生物量和 Macrolactin A的產量影響如表 1所示。由表 1所知, 菌體生長和Macrolactin A的產生并無直接關系, 加入淀粉的培養基中菌體生物量最高, 其產物與基礎培養基中持平,即較高的菌體生長不一定得到較高的Macrolactin A的積累量。

由Macrolactin A產量可以初步判斷該菌株可以有效利用多種單糖、雙糖碳源(劉俊, 2010), 與文獻報道一致(賀娟, 2011); 添加乳糖、甘油和糊精的產量比較低, 其原因可能是海洋解淀粉芽孢桿菌降解多糖或者發酵乳糖的能力較差, 其中麥芽糖、葡萄糖和蔗糖均能夠得到有效的利用, 其 Macrolactin A的產量均超出 2216E基礎培養基, 通過數據軟件SAS分析, 可得到麥芽糖是其最佳碳源, 鑒于蔗糖成本高于葡萄糖, 葡萄糖與麥芽糖成本相當, 綜合考慮,故選擇產量更高的麥芽糖作為最佳碳源更利于工業化生產。

表1 碳源對ESB-2菌株生物量及Macrolactin A產量的影響Tab.1 Effects of carbon source on biomass and Macrolactin A production by ESB-2

2.2.3 麥芽糖濃度對Macrolactin A產量的影響 通過添加不同濃度的麥芽糖(5、10、20、30和40 g/L), 其它培養條件一致, 測定其Macrolactin A的產量, 結果如圖5所示。從圖5中可以看出, Macrolactin A的產量隨著麥芽糖的濃度的變化有顯著變化, 麥芽糖過低, 不利于菌體的生長, 在麥芽糖濃度為10 g/L以下時, MA產量基本呈線性增加, 在10 g/L以上時, 隨著麥芽糖濃度增加 Macrolactin A的產量迅速降低, 表明過高的麥芽糖濃度則會對菌體產次級代謝產物產生抑制作用。當麥芽糖濃度為10 g/L時, Macrolactin A含量最高, 為 18.816 g/L, 是基礎培養基的 2.08倍,表明麥芽糖濃度對發酵活力有很大影響, 1%濃度為其最佳添加濃度。

圖5 麥芽糖濃度對Macrolactin A產量的影響Fig.5 Effects of maltose concentration on Macrolactin A production

通過對麥芽糖濃度優化, 尋找到該菌株產Macrolactin A的最適濃度, 試驗中發現, 麥芽糖濃度會對Macrolactin A的產量有非常顯著的影響, 通過本次最佳碳源及其最佳濃度的發酵優化, 雖然大大提高了Macrolactin A的發酵產量, 但是該產量還不足以達到日后產業開發的需求, 更多的優化研究需要進一步的開展, 誘變、基因改造都可以進一步的嘗試(李興艷等, 2013)。

2.2.4 搖瓶發酵曲線 利用上述優化的發酵培養基, 進行搖瓶發酵得到 ESB-2的發酵過程曲線(0—48h), 其發酵曲線如圖 6所示, 整個發酵過程中, pH先下降后上升, 總糖不斷被消耗, 產物不斷積累。發酵 0—12h, 菌體處于對數生長期, 基質快速消耗, 此時該菌株的次級代謝產物 Macrolactin A含量很低,pH下降其原因可能是菌株生長較快呼吸作用釋放出二氧化碳與有機酸導致。發酵 12—24h, 菌體進入穩定期, pH略微上升, 基質快速消耗, 此時Macrolactin A的產量呈現上升趨勢。發酵24—48h, pH逐步上升可能是菌株產物呈現堿性的緣故, 隨著菌體濃度的上升, 次級代謝產物積累較多, 說明發酵產物和菌體的生長是部分偶聯的(劉朝輝等, 2008)?；|還原糖濃度的消耗過程跟菌體的生長、發酵產物的合成呈現對應關系, 發酵 24h后, 基質消耗緩慢, 此時消耗的基質主要用于合成代謝產物。

搖瓶發酵曲線為其放大發酵提供必要的依據(劉超超, 2013), 通過對搖瓶發酵曲線的模擬, 可以發現該菌株產抗生素的周期較短, 通過對該菌株發酵條件的控制, 有望在發酵罐中的生產能力將比搖瓶發酵條件下有較好的提高。

圖6 ESB-2搖瓶發酵過程曲線Fig 6 The fermentation curves of shaking flask culture

3 結論

在科研和制藥工業等藥物質量控制中都需要大量的高純度單體化合物, 然而應用傳統的分離方法,例如通過薄層色譜、柱色譜或者高效液相制備色譜從植物、微生物中制備分離純化單體活性化合物是比較困難和繁瑣的。本研究利用ADS-30大孔樹脂靜態吸附結合高速逆流色譜法從海洋解淀粉芽孢桿菌體的發酵液分離出Macrolactin A純品, 純度達到95.8%,分離時間短且效率較高, 為進一步實驗分析提供了依據。繼而, 通過對ESB-2初步的碳源優化, 得到麥芽糖為最佳碳源, 最佳濃度1%, 且發酵2d產量可達到18.82 mg/L, 是其優化前的2倍多, 與國內現有產Macrolactin A菌株需要發酵 7d相比, 發酵周期短,其日產量是已報道的產Macrolactin A菌株的3.5倍。說明該菌株是一株具有極高應用價值的菌株, 也為下一步發酵培養基中氮源、無機鹽、前體物質的優化及發酵擴大培養提供了可行的方法, 可為進一步的工業化生產打下基礎。

王 征, 董平原, 張天民等, 2006. 海洋抗腫瘤藥物研究開發中的主要問題. 食品與藥品, 8(4): 1—4

王洪強, 何 山, 楊 銳等, 2013. 一株海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)生產Macrolactin B 的發酵條件優化. 海洋與湖沼, 44(6): 1592—1596

劉 俊, 2010. 多粘類芽孢桿菌胞外多糖的發酵條件、結構、化學修飾及其抗氧化活性的研究. 南京: 南京農業大學博士學位論文

劉超超, 2013. 一株抗真菌抗生素菌株的鑒定及發酵工藝優化.杭州: 浙江大學碩士學位論文

劉朝輝, 陳 云, 齊 崴等, 2008. 中性 β-甘露聚糖酶分批發酵動力學研究. 化學工程, 36(10): 66—70

孫媛媛, 唐玉海, 2003. 高速逆流色譜技術在中草藥有效成分分離中的應用. 西北藥學雜志, 18(6): 282—283

李興艷, 張丙云, 尚永彪, 2013. 正交試驗優化酵母多糖鋅配合物的制備及其對尿素的吸附性能. 食品科學, 34(14):57—62

楊云喜, 李 佩, 徐岳松等, 2014. 產抗菌肽乳酸菌的分離、鑒定及培養條件優化. 應用與環境生物學報, 20(5): 817—824

賀 娟, 2011. 一株產大環內酯類抗真菌抗生素菌株的鑒定及發酵工藝優化. 杭州: 浙江大學碩士學位論文

章能勝, 王金彬, 汪小艷等, 2010. 高速逆流色譜法從蝙蝠蛾擬青霉中快速分離制備麥角甾醇純品. 色譜, 28(1):68—72

董曉毅, 王梁華, 孫銘娟等, 2008. 產Macrolactins的海洋細菌X-2中Ⅰ型PKS基因簇的篩選鑒定與功能分析. 微生物學通報, 35(9): 1367—1372

Cao X L, Wang Q E, Li Yet al, 2011. Isolation and purification of series bioactive components fromHypericum perforatumL. by counter-current chromatography. Journal of Chromatography B, 879(7—8): 480—488

Dalhoff A, Nasu T, Okamoto K, 2003. Beta-lactamase stability of faropenem. Chemotherapy, 49(5): 229—236

Gustafson K, Roman M, Fenical W, 1989. The macrolactins, a novel class of antiviral and cytotoxic macrolides from a deep-sea marine bacterium. Journal of the American Chemical Society, 111(19): 7519—7524

Haefner B, 2003. Drugs from the deep: marine natural products as drug candidates. Drug Discovery Today, 8(12): 536—544

He S, Wang H Q, Wu Bet al, 2012a. Response surface methodology optimization of fermentation conditions for rapid and efficient accumulation of macrolactin a by marineBacillus amyloliquefaciensESB-2. Molecules, 18(1):408—417

He S, Wang H Q, Yan X Jet al, 2012b. Preparative isolation and purification of macrolactin antibiotics from marine bacteriumBacillus amyloliquefaciensusing high-speed counter-current chromatography in stepwise elution mode.Journal of Chromatography A, 1272: 15—19

Ito Y, 1991. Recent advances in counter-current chromatography.Journal of Chromatography A, 538(1): 3—25

Jaruchoktaweechai C, Suwanborirux K, Tanasupawatt Set al,2000. New macrolactins from a marineBacillussp. Sc026.Journal of Natural Products, 63(7): 984—986

Kim H-H, Hwang S-Y, Kim W-Get al, 1997. Neuronal cell protection activity of macrolactin A produced byActinomadurasp.. Journal of Microbiology and Biotechnology,7(6): 429—434

Kim H O, Lim J M, Joo J Het al, 2005. Optimization of submerged culture condition for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides byAgrocybe cylindracea.Bioresource Technology, 96(10): 1175—1182

Li H B, Chen F, 2001. Preparative isolation and purification of six diterpenoids from the Chinese medicinal plantSalvia miltiorrhizaby high-speed counter-current chromatography.Journal of Chromatography A, 925(1—2): 109—114

Nishivama T, Matsuzaki K, Kovama Het al, 2000. In vitro activity of faropenem against beta-lactamase producing clinical isolates. The Japanese Journal of Antibiotics, 53(3):179—183

Owen R O, McCreath G E, Chase H A, 1997. A new approach to continuous counter-current protein chromatography: Direct purification of malate dehydrogenase from aSaccharomyces cerevisiaehomogenate as a model system. Biotechnology and Bioengineering, 53(4): 427—441

Tulp M, Bohlin L, 2004. Unconventional natural sources for future drug discovery. Drug Discovery Today, 9(10):450—458

Yang Q, Han W J, Zhang W Jet al, 2009.Identification of a macrolactina antibiotic-producing marineBacillus amyloliquefaciensJY-863 strain and optimization of its fermentation conditions. Pharmaceutical Biotechnology,16(4): 311—315, 346