香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)水通道蛋白基因AQP1的克隆、分子特性和表達分析*

萬 茜 張 揚 張躍環 喻子牛

(1. 中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室及廣東省應用海洋生物重點實驗室 廣州 510301;2. 南海資源開發與保護協同創新中心 廣州 510275; 3. 中國科學院大學 北京 100049)

水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是一類參與生命活動中水分子跨膜運輸的調控蛋白, 屬于主要內嵌蛋白超家族成員(major intrinsic protein superfamily), 它主要介導水分由低滲區向高滲區的跨膜轉運, 也能轉運甘油、尿素、氨水等中性小分子。自從 Pretson等(1992)發現了第一個水通道蛋白 1(CHIP28)以來,研究人員已經發現水通道蛋白廣泛分布于古菌、真菌和真核生物組成的三界系統中。水通道蛋白在脊椎動物和植物中已經有很多研究報道, 人類 13種水通道蛋白(從水通道蛋白0到12)已經被發現并且鑒定; 但是, 無脊椎動物水通道蛋白的研究相對較少, 并且主要集中在模式生物線蟲、果蠅和昆蟲中; 在軟體動物中研究甚少 (Yang, 2000; Huanget al, 2007; Campbellet al, 2008; Ishibashiet al, 2011; Pieńkowskaet al,2014)。水通道蛋白是一個多亞型的蛋白家族, 根據氨基酸序列的同源性可以分為四種類型: 第一類為AQP1-like型(包括AQP0, 1, 2, 4, 5和6, 屬于典型的傳統 AQP, 只轉運水分子), 第二類為 AQP3-like型(包括AQP3, 7, 9和10, 屬于水甘油通道蛋白, 除了水分子, 還可以轉運甘油、尿素、氨水等中性小分子),第三類為AQP8-like型(只包括AQP8這一種傳統水通道蛋白), 第四類為AQP11-like型(包括AQP11和12,屬于非傳統AQP) (Sotoet al, 2012)。所有的水通道蛋白都是以同源四聚體形式存在于細胞膜表面, 每個單體包括 6個跨膜區段(Ⅰ—Ⅵ)和 5個環形結構(loopA-E)。根據“砂漏”模型(Agreet al, 1993), B環和E環從兩側半嵌入膜內形成一個開放式狹窄的水通道。保守的 NPA基序(Asn-Pro-Ala)和選擇性水孔構件 ar/R (aromatic/arginine, 芳香族/精氨酸區)被認為是最主要的控制水或其它中性小分子滲透性的關鍵區域(Ericet al, 2006)。

香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)是我國華南沿海養殖的主要經濟種, 主要分布在廣東、廣西等地, 年產量在130多萬 t, 產值在 80—100億元(中國漁業年鑒, 2013)。香港牡蠣與其它牡蠣種類相比較,其價值主要體現在體大肉肥、味道鮮美, 另外其市場價值遠高于其它種類牡蠣, 深受廣東、廣西、港澳、東南亞一些國家消費者青睞(張躍環等, 2012)。作為河口區域典型牡蠣經濟種(Lamet al, 2003), 它對低鹽有較強的抗性, 但對高鹽仍具有一定的耐受性, 更適宜于棲息在河口咸淡水環境(謝忠明, 2003)。水通道蛋白作為促進水分子跨膜運輸的重要蛋白, 參與滲透平衡的調節, 在鹽度變化劇烈的環境中發揮重要作用。目前, 對編碼牡蠣水通道蛋白的基因研究甚少, 且不清楚鹽度脅迫下水通道蛋白基因的表達特性。因此, 本文采用RACE技術首次克隆了香港牡蠣水通道蛋白1(AQP1)基因cDNA全長, 分析該基因編碼蛋白序列特征、理化性質和空間結構, 通過實時熒光定量 PCR技術分析該基因在香港牡蠣中的組織分布及7天鹽度脅迫下的表達情況, 旨在為進一步研究香港牡蠣的廣鹽適應機制提供分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料、鹽度處理及取樣

實驗材料為殼高在120mm左右的2齡香港牡蠣,采自廣東省陽江市陽西縣程村。在實驗室27°C, 鹽度為 18海水中暫養一周后, 選取健康香港牡蠣個體,快速吸取出淋巴液, 離心(12000 r/min, 30s)后棄上清,立即加入等量TRIzol reagent (Invitrogen公司)重懸沉淀, 繼續提取RNA或者凍存于–80°C。另外, 取下小塊外套膜、鰓、閉殼肌、消化腺和整個心臟, 加入1mL TRIzol reagent, 勻漿, 繼續提取 RNA 或者凍存于–80°C。

鹽度處理時, 將 200只健康牡蠣隨機分為 4組,即4鹽度組、18鹽度組、32鹽度組和42鹽度組。由于香港牡蠣最適鹽度范圍為 10—20 (謝忠明, 2003),所以本實驗以18鹽度組作為對照組。用0.8%扁藻喂養, 并且每天換3次海水。處理開始后, 在時間節點1天(24h)、3天(72h)、5天(120h)和 7天(168h)對四組分別隨機挑取5個個體, 取出一小塊鰓組織, 立即加入TRIzol, 勻漿后凍存。

1.2 試劑與儀器

大腸桿菌菌株 DH5α、克隆載體 pMDTM19-T、exTaq酶、DNAmarker、T4DNA連接酶、DNA片段純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、逆轉錄試劑盒 PrimeScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit 、用于定量實驗的逆轉錄試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 購于寶生物工程 (大連) 有限公司。TRIzol試劑購于Invitrogen公司。RACE試劑盒BD SMART RACE cDNA Amplification kit 購于Clontech公司。實時定量試劑盒 2×SYBR Green Master Mix 購于Roche公司。用羅氏的LightCycler 480Ⅱ儀器進行Real-time PCR。引物合成和測序工作在北京六合華大進行。

1.3 香港牡蠣總RNA 提取與cDNA第一鏈的合成

根據TRIzol reagent (Invitrogen公司)的產品說明操作提取淋巴及勻漿后的各個組織總 RNA, 用Nanodrop 2000c (Thermo公司)測定RNA的純度和濃度, 并用電泳檢測 RNA 質量。用 PrimeScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit進行cDNA第一鏈的合成,反轉錄產物用于PCR擴增或者保存在–20°C。

1.4 香港牡蠣AQP1基因片段的RT-PCR擴增

根據在 NCBI 太平洋牡蠣EST數據庫中獲得的一段序列, 設計引物ChAQP1F1和ChAQP1R1 (表1),以混合各個組織cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。反應條件為: 94°C預變性3min; 94°C變性30s, 50°C退火 30s, 72°C延伸1min, 共30個循環; 最后72°C延伸10min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后, 切膠回收純化目的片段。將純化產物連接至 pMD19-T質粒載體上, 轉化至E. coliDH5α感受態細胞中, 培養過夜, 挑取單克隆進行菌落PCR驗證, 陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。測序結果在 NCBI上進行 Blast比對, 初步確定獲得片段為香港牡蠣水通道蛋白1基因。

1.5 香港牡蠣AQP1末端序列的RACE擴增及全長序列的確定

根據上述克隆獲得的片段序列, 設計用于5’RACE擴增的基因特異性引物ChAQP1R2和ChAQP1R3, 用于 3’RACE擴增的基因特異性引物ChAQP1F2 和ChAQP1F3(表 1)。按照 BD SMART RACE cDNA Amplification kit試劑盒說明, 利用引物GR5P/ChAQP1R2和 GR3P/ChAQP1F2進行 5’RACE和 3’RACE 第一輪反應, 反應條件為: 94°C 3min;94°C 30s, 72°C 2min, 5 個循環, 94°C 30s, 70°C 30s,72°C 2min, 5 個循環, 94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 2min,25個循環; 72°C 10min。以第一輪PCR產物為模板,引物 GR5NP/ChAQP1R3和 GR3NP/ChAQP1F3進行第二輪反應, 反應程序為: 94°C 3min; 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min, 25個循環; 72°C 10min。PCR 產物進行切膠回收純化, 連 T載體, 轉化, 挑克隆, 送測序,獲得測序結果經Blast比對后, 用DNAstar軟件拼接所得序列片段, 最后獲得完整全長序列。

根據已拼接的基因序列設計特異性引物ChAQP1F4和ChAQP1R4 (表1), PCR擴增香港牡蠣AQP1 的編碼區, 反應條件為: 94°C 3min; 94°C 30s,55°C 30s, 72°C 2min, 30 個循環; 72°C 10min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果, 測序驗證。

表1 本文中所用引物序列Tab.1 Sequences of designed primers used in this study

1.6 序列分析、結構預測及分子進化樹的構建

從NCBI蛋白數據庫中獲得水通道蛋白1同源序列, MatGAT2.02軟件分析氨基酸序列的一致性(Tamuraet al, 2007)。ProtParam (http: //web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白質基本理化性質。蛋白質保守結構域的預測由在線軟件Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)完成(http: //smart.emblheidelberg.de/)。氨基酸多序列分析由ClustalX 1.81軟件完成。分子進化樹由MEGA 4.0軟件構建獲得。蛋白質親水性分析通過 ProtScale在線服務器預測(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl) (Kyteet al,1982)蛋白質三級結構預測在SWISS-MODEL中進行,用Rasmol 2.7.0.1查看預測的結構。

1.7 實時定量PCR分析

以香港牡蠣不同組織總RNA及不同鹽度脅迫下鰓組織中總RNA 1μg為底物, 按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser產品說明合成用于實時定量PCR的單鏈cDNA模板。根據全長AQP1序列信息, 設計特異定量引物ChAQP1F5和ChAQP1R5;以看家基因 β-actin為內參基因, 設計內參定量引物β-actin F1和 β-actin R1(表 1), 用于測定香港牡蠣AQP1基因在不同組織中的時空表達量; 以看家基因GAPDH為內參基因, 設計內參定量引物 GAPDHF1和GAPDH R1(表1), 用于測定香港牡蠣AQP1基因在不同鹽度脅迫下的表達量; 定量 PCR反應體系20μL 為: 10 μmol/L 的上、下游引物各 2μL; 2×SYBR Green Master Mix (Roche, USA) 10 μL; cDNA 模板 2 μL;滅菌超純水 H2O 4μL。定量 PCR反應條件為: 95°C預變性 1min; 95°C 變性 10s, 55°C 退火 15 s, 72°C 延伸20s 共40個循環。為檢測定量PCR的特異性, 在反應結束時進行熔融曲線分析。數據由 LightCycler 480Ⅱ1.5軟件生成并且記錄。采用法分析香港牡蠣AQP1 mRNA在不同組織中的相對表達量。

1.8 數據分析

采用 SPSS軟件包單因素方差分析法(one-way ANOVA)中的 Duncan多重比較檢驗法對實時定量PCR中的數據進行分析, 比較香港牡蠣AQP1在組織分布及不同鹽度脅迫下鰓中的相對表達量(平均值±標準差)差異。

2 結果

2.1 香港牡蠣ChAQP1基因的克隆和分析

以香港牡蠣各個組織混合cDNA為模板, 使用引物ChAQP1F1和ChAQP1R1進行PCR擴增, 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得約600bp的核酸條帶(圖 1a), 測序獲得核酸序列。將核酸序列在 NCBI中Blast比對, 初步確定獲得香港牡蠣AQP1基因序列。再用特異性引物ChAQP1R2、ChAQP1R3和ChAQP1F2、ChAQP1F3 分別進行 5’RACE 和 3’RACE兩輪PCR擴增, 分別獲得1條大小約503 bp (圖1b)和353 bp (圖1c)的核酸條帶。將3段序列拼接后得到長度為1153 bp的香港牡蠣水通道蛋白1基因全長序列。其5’非編碼區(UTR)長度為165 bp, 3’非編碼區長度為100 bp, 基因編碼區長為888 bp, 編碼295個氨基酸(圖 2)。設計包含編碼區及以外若干序列的特異引物ChAQP1F4和ChAQP1R4擴增獲得1060 bp的核酸條帶(圖 1d), 經測序驗證為目的基因, 將此基因命名為ChAQP1。將序列提交至GenBank, 獲得登錄號KJ704847。

圖1 香港牡蠣ChAQP1 PCR 擴增結果Fig.1 The PCR amplification products of ChAQP1 in C.hongkongensisM: DL2000 marker; a: 中間片段; b: 5'端片段擴增; c: 3'端片段擴增; d: 全長cDNA片段

2.2 ChAQP1蛋白質基本理化性質分析及結構預測

Protparam在線預測軟件表明該蛋白分子式為C1463H2278N370O400S14, 分子量為31.89 kDa, 等電點為8.61, 負電荷氨基酸總殘基數(Asp+Glu)為 21, 正電荷氨基酸總殘基數(Arg+Lys)為 24, 脂肪系數為 99.19,親水性總平均數為 0.439, 為脂溶性蛋白, 不穩定系數為20.16, 屬于一類穩定的蛋白。

SMART在線服務軟件對獲得的ChAQP1基因進行蛋白質結構域預測, 結果表明有1個與該基因匹配的蛋白質結構域MIP (major intrinsic protein superfamily),位于第31—243位氨基酸(圖2)。

ProtScale分析蛋白質疏水性表明, 該蛋白二級結構中具有 6個跨膜螺旋 TM1—TM6, 5個連接環A—E (圖 3)。

MatGAT分析表明,ChAQP1氨基酸序列除了與太平洋牡蠣氨基酸序列一致性為87.8%以外, 與其它的都只有30%左右的一致性(表2)。由于與人類AQP1氨基酸序列一致性為40.2%, 故選擇人類AQP1 (PDB ID:1H6I)為模板, 利用 SWISS-MODEL中 Target-Template Alignment進行ChAQP1蛋白三級結構預測。結果發現(用Rasmol查看)兩者有相似的結構, 都存在六個跨膜結構域, 2個半跨膜結構域和5個連接環(圖 4、圖 5)。

2.3 ChAQP1蛋白序列比對和分子進化樹的構建

Clustal 同源多序列比對結果(圖6)表明ChAQP1有兩個保守的 NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)結構基序, 位于第93—95和第208—210位氨基酸處, 這與其它物種AQP1中序列一致。ar/R選擇性水孔構件由F73、H196、S205和R211四個位點構成, 除了S205位點相對不保守, 其它三個位點存在高度保守性, 這表明ChAQP1屬于傳統的水通道蛋白, 只允許水分子通過該孔道。另外, 在第一個 NPA基序上游發現有ISGGH序列(第87—91位), 在其它傳統AQP氨基酸序列中也普遍存在。此結果進一步說明, 水通道蛋白1的NPA基序和ar/R結構在不同物種中存在很高的進化保守性。

使用 MEGA 4.0軟件中的 N-J建樹方法對ChAQP1蛋白序列和其它物種中的AQP1及AQP家族成員構建分子進化樹(圖7)。結果顯示, AQP家族成員聚類分成4個主要分支, 即AQP1-like, AQP3-like,AQP8-like和AQP11-like四類,ChAQP1屬于AQP1-like分支。將AQP1-like分支序列中AQP1序列重新構建進化樹(圖 8), 結果表明, 脊椎動物能較好地聚為一類, 無脊椎動物則不能聚為一類。在無脊椎動物中, 香港牡蠣與太平洋牡蠣聚為一類, 親緣關系最近,這顯示了它們中水通道蛋白1相似性但也存在差異。

圖2 ChAQP1的全長cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence of ChAQP1 and deduced amino acid sequences ORF區用大寫字母顯示, 5’UTR和3’UTR用小寫字母顯示?；疑幱皹耸維MART預測的MIP結構域。橢圓框顯示的是NPA基序。終止子用“*”表示

表2 ChAQP1與其它已知AQP1同源序列氨基酸一致性比較Tab.2 Amino acid identity comparison of the ChAQP1 with other known AQP1 homologues

圖3 ChAQP1疏水性圖Fig.3 Hydropathy plots of ChAQP1數字1—6表示跨膜結構域, 字母A—E表示5個連接環

圖4 ChAQP1蛋白預測的三級結構Fig.4 The predicted 3D structure of ChAQP1

圖5 1H6I蛋白三級結構Fig.5 The 3D structure of 1H6I

2.4 ChAQP1基因在香港牡蠣中的組織分布

ChAQP1 mRNA在各個組織中的表達量可以通過實時定量PCR的方法進行檢測, 結果表明ChAQP1基因在香港牡蠣鰓、外套膜、閉殼肌、消化腺、性腺、心臟和淋巴中都有表達, 其中在閉殼肌中表達量最高, 其次是外套膜、性腺、消化腺、鰓。心臟、淋巴中表達量較低(圖9)。

2.5 鹽度脅迫下ChAQP1基因的表達量分析

7天鹽度脅迫實驗結果如圖10。香港牡蠣最適鹽度為18, 故以之作為對照組。低鹽處理后(鹽度為4),ChAQP1基因的表達量與對照組表達量相近, 并隨鹽度脅迫時間的延長維持在一個相對穩定的水平, 1天、3天、5天、7天分別為對照組的1.06、0.90、0.72、0.92倍。在32高鹽脅迫下,ChAQP1基因的表達量在前五天呈現出略微下降的趨勢, 分別為對照組的0.65、0.76、0.86倍, 而在第 7天恢復正常水平(1.11倍)。42高鹽脅迫下,ChAQP1基因的表達量在前五天迅速下降, 隨時間延長維持在一個較低水平, 分別為對照組的 0.18 (P<0.01)、0.48、0.28 (P<0.05)倍, 在第7天恢復正常水平(1.03倍)。

3 討論

本研究采用RACE技術從香港牡蠣中克隆獲得其香港牡蠣水通道蛋白1基因ChAQP1 (KJ704847),對其進行蛋白保守區段預測發現, 該蛋白具有一個典型的MIP結構域、6個跨膜螺旋、5個連接環。在氨基酸同源性序列比對中,ChAQP1含有兩個保守的 NPA基序, 這與其它物種中水通道蛋白 1一致;ar/R區氨基酸組成在 F73、H196和 R211這三個位點上與其它物種 AQP1中的也是高度一致, 這符合傳統水通道蛋白的特性, ar/R區氨基酸形成的孔徑正好允許水分子通過(Beitzet al, 2006)。第一個NPA基序上游的 ISGGH序列也是高度保守的, 可見,ChAQP1是非常傳統的, 只允許水分子穿過雙分子膜的水通道蛋白, 在關鍵的功能結構域上具有較高的保守性。系統進化分析表明, 該蛋白屬于AQP-1like類型的水通道蛋白。對不同物種AQP1序列進行聚類分析發現,ChAQP1與同科同屬的太平洋牡蠣 AQP1遺傳距離最近, 與同為軟體動物門的腹足綱蝸牛(Lymnaea stagnalis, Catascopia occulta和Stagnicola palustris)遺傳距離比較近, 而與哺乳動物中的人類及鼠遺傳距離相對較遠, 符合其遺傳進化關系。

圖6 ChAQP1與其它物種AQP1氨基酸序列比對Fig.6 Multiple alignment of ChAQP1 amino acid sequences with other AQP1 proteins“*”代表一致, “: ”代表高度保守, “.”代表低度保守。2個陰影部分代表2個NPA基序, 橢圓標示ar/R結構并且方框標示ISSGGH序列。橫線標示保守的跨膜結構域。AQPl 來源及GenBank登錄號詳見表2

組織分布結果顯示ChAQP1 mRNA 在香港牡蠣主要組織鰓、外套膜、閉殼肌、消化腺、性腺、心臟和淋巴中都有表達, 其中鰓、外套膜、閉殼肌、消化腺和性腺表達量相對較高些, 這說明著ChAQP1可能在轉運水分子的相關生理過程中起到重要作用。Moon等(1993)研究發現人類 AQP1也存在各個組織器官組成型表達的現象, 人類AQP1廣泛分布于紅細胞、腎、眼、肺和血管內皮細胞等組織中。Pieńkowska等(2014)研究蝸牛AQP1, 發現在腦、腎、足和消化腺等組織器官中都有廣泛分布。Tipsmark等(2010)發現大西洋鮭魚AQP-1a也廣泛分布在腸、腎、鰓、腦等組織中。在 7天鹽度脅迫實驗中, 以鹽度 18作為對照, 當鹽度達到 42時,ChAQP1基因表達受到抑制,而在低鹽(4)組沒有太大的變化, 在高鹽(32)組呈現出略微下降的趨勢。這與 Meng等(2013)利用轉錄組數據分析太平洋鹽度適應性時, 發現的 3個 AQP基因在高鹽(鹽度為40)和低鹽(鹽度為10)下均為呈下調趨勢的結果不太一致。這是因為太平洋牡蠣最適鹽度為30, 為了維持細胞膨脹與收縮的穩定, 機體通過增加蛋白質磷酸化來降低水通道蛋白活性, 從而保護機體免于更多水分的進入, 而在鹽度4到32范圍內, 香港牡蠣ChAQP1基因表達量和正常鹽度下表達量波動不是很大, 這說明在該鹽度范圍內AQP1基因參與鹽度調節的能力是有限的, 尤其是在低鹽下。這種現象同樣出現在鱸魚中, Ivone等發現鱸魚在低鹽下,鰓組織中AQP1基因表達量并沒有變化(Giffard-Menaet al, 2007)。而在高鹽下, AQP1基因表達量普遍存在下調趨勢。在42鹽度下, 香港牡蠣ChAQP1基因表達量顯著下降, 這說明機體通過降低該基因的表達來降低 AQP1蛋白的活性, 抑制機體內水分的流失,保持機體內水鹽平衡, 提高機體對逆境的耐受力。同樣的現象也出現在大西洋鮭魚中, 從淡水到海水的過程中, 鮭魚AQP1-a基因在鰓中表達量也明顯下調(Tipsmarket al, 2010)。以上結果表明, 在香港牡蠣中,AQP1參與了調節滲透壓平衡, 為探討香港牡蠣廣鹽適應性提供一定的實驗數據和根據。

圖7 ChAQP1與其它物種水通道蛋白的系統進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ChAQP1 with AQP family members of other species置信水平通過在每個分支節點上進行1000次重復獲得。標尺顯示發生0.2%概率氨基酸位點變異的長度。序列信息由縮寫名、物種全名和登錄號構成。方框標示ChAQP1蛋白

圖8 ChAQP1與其它物種AQP1的系統進化分析Fig.8 Phylogenetic analysis of ChAQP1 with AQP1 of other species

圖9 ChAQP1 mRNA在不同組織表達量分布圖Fig.9 Tissue distribution of ChAQP1 mRNA expression level每個bar代表平均值歸一化的表達水平(n=3)

圖10 7天鹽度處理對ChAQP1基因表達的影響Fig.10 Relative expression level of ChAQP1 was analyzed under salinity stress in 7 days圖中數據為平均值±S.E (n =5), 顯著性差異用1個星號(P<0.05)和2個星號(P<0.01)標示

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