基于響應曲面法研究亞硝酸鹽與養殖密度對吉富羅非魚幼魚生長與肝臟抗氧化力的影響*

強 俊 楊 弘, 馬昕羽 王 輝 徐 跑,① 何 杰 朱志祥

(1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心 農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室 無錫 214081;2. 南京農業大學無錫漁業學院 無錫 214081; 3. 淮陰師范學院生命科學學院 淮安 223300)

隨著水產養殖中集約化水平的提高, 高密度高投餌的養殖方式造成了高蛋白殘餌和高含氮排泄物的增加(Parket al, 2007)。水體中的硝化細菌可以將氨氮氧化成可以轉化為(Camargoet al,2005)。與NO3相比,對魚體的毒性較大(Holtetal, 1983)。在低密度養殖中, 水中的含量一般較低(0.03—0.1mg/L)(Siikavuopioet al, 2006), 然而, 近年來的高密度養殖方式可能導致水環境中含量的增加, 魚體血液和組織中濃度是水環境中的10—100 倍(Da Costaet al, 2004)。在機體中能夠轉化為一些有毒的衍生物, 使魚體生理功能產生紊亂, 進而阻礙生長與存活(Svobodováet al, 2005)。De lima等(2011)研究發現, 水中的濃度低于1.19mg/L對鯰魚(Rhamdia quelen)的特定生長率與存活率無顯著影響; 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)暴露在中28d后, 生長和存活與對照組相比無顯著差異, 而濃度為3.0 mg/L時, 體重下降, 存活率為65% (Kroupovaet al, 2008)。Deane等(2007)研究發現, 將平鯛(Sparus sarba)放置在不同濃度(0, 25, 50mg/L)下 7d, 隨濃度上升, 肝臟指數增加, 血清 T4含量下降、T3含量不變,脅迫對血清中 K+和 Na+含量無影響, 但可提高鰓絲中Na+-K+ATPase活力; Park 等(2007) 鲉發現無備平(Sebastes inermis)在700mg/L濃度下脅迫 96h,皮膚、鰓絲、肝臟與腎臟組織發生非正常組織學變化,總紅細胞數, 血紅蛋白以及血清蛋白含量也顯著下降。關于對羅非魚影響的研究主要集中在急性脅迫對其存活與生化指標的影響方面(Atwoodet al, 2001; Wanget al, 2006; Yildizet al, 2006)。

養殖密度是影響水產養殖生產力和水產品品質的重要因素。隨著我國南方地區羅非魚集約化養殖的大規模發展, 合理地增加養殖密度有助于提高水體利用與養殖效益。然而, 魚類種群數目增加可能對其生存空間與攝食產生影響, 引起擁擠脅迫(Monteroet al, 1999),影響養殖群體生長率和存活率(馬愛軍等, 2005; Merinoet al, 2007)。同時高密度集約化養殖也會增加水環境中氨氮、亞硝酸鹽等有毒物質含量, 影響機體的免疫力,增加魚病發生的幾率(王文博等, 2004; Ngaet al, 2005)。

已有研究發現, 養殖密度與水環境因子對水生動物生長、存活(Salama, 2005)以及生化指標(董曉煜等, 2008)存在聯合影響。養殖密度與水環境因子之間是相互聯系、相互制約的關系。本實驗主要研究了不同養殖密度下, 慢性亞硝酸鹽脅迫對吉富羅非魚幼魚生長與肝臟抗氧化力的影響, 利用響應曲面法分析了因子間可能的二次效應與互作效應, 建立了相關的曲面模型。本研究對保障羅非魚集約化養殖高產、高效、安全、健康, 實現羅非魚產業的可持續發展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗開始前將吉富羅非魚幼魚放置于室內4.2m3水泥池中暫養 8d, 暫養條件為水溫(28±0.5)°C), pH 7.4±0.2, 亞硝酸鹽低于0.01 mg/L, 溶氧高于5mg/L。暫養期間每天投喂膨化飼料2次(8: 00和15: 00), 飼料中粗蛋白含量為28%, 粗脂肪為6%。

1.2 實驗設計與分組

正式實驗開始前, 采用預實驗分析實驗魚正常生長的亞硝酸鹽范圍。本實驗運用中心復合實驗設計(Central Composite Rotatable Design: CCD), 以亞硝酸鹽(0.02—2.8mg/L)與養殖密度(1—5尾/10L)為實驗考察因子, 分別以N和D表示。實驗組合見表1, 實驗中每個組合重復3次。特定生長率(specific growth rate: SGR)和肝臟SOD、CAT活力與MDA含量為本實驗的響應值, 具體的編碼水平與實際值見表1。

表1 實驗設計組合和結果Tab.1 Experimental design of nitrite and density and results (Mean±SD)

1.3 養殖管理

選取39個容積為1200L的塑料養殖桶, 每個桶1000L自來水, 曝氣3d后使用。本實驗中采用NaNO2調節水中亞硝酸鹽濃度, 實驗開始前先配制4.93 g/L的亞硝酸鹽母液。實驗中每隔4h調節水中亞硝酸鹽濃度一次, 檢測方法按照Chen等(2000)。實驗用魚的馴化采用漸進方式, 每天水中亞硝酸鹽濃度增加0.2—0.3 mg/L, 分別馴化至實驗所需濃度(0.02, 0.43,1.41, 2.39和2.8 mg/L), 在此亞硝酸鹽濃度下馴養10d左右, 吉富羅非魚可以正常攝食與活動后開始實驗。實驗期間采用恒溫加熱棒控溫在(28±0.5)°C, pH 7.6±0.2。 實 驗 用 魚 體 重 為 (2.97±0.06)g, 體 長 為(4.45±0.12)cm, 將表 1的養殖密度: 1、1.59、3、4.41和 5尾/10L)轉換為實際魚數為 100、159、300、441和500尾/m2, 實驗共需11700尾魚, 各實驗組合魚體均重無顯著差異(ANOVA,P>0.05)。飼料投喂量為體重的4%—6%。實驗期間連續充氣, 每隔3d換水1/3, 換水前后溫差不超過±0.5°C, 自然光周期。未添加亞硝酸鹽前的實驗用水中總氨氮 0.02mg/L, Cl–16mg/L。

1.4 響應值測定

取樣前停飼24h, 每個實驗組合隨機挑選20尾魚測量體重, 特定生長率(SGR) (%/d) = [(lnW2–lnW1)/(t2–t1)] ×100。式中,W1、W2分別為起始時間t1、終末時間t2時的體重(g)。

每個養殖桶隨機取5尾魚, 取0.1g左右的肝臟用液氮速凍后, 于–70°C保存, 用于酶活與MDA分析。用預冷生理鹽水沖洗解凍后的肝臟樣品, 濾紙吸干水分, 分析天平稱重后加入 4倍體積(W/V)預冷生理鹽水, 使用勻漿器研磨制勻漿, 粗酶液置于4°C保存, 在24h內測定完畢。肝臟組織中丙二醛(Malondialdehyde:MDA)含量測定參照 Xiang等(1990); 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase: SOD)含量測定參照ōyanagui(1984); 過氧化氫酶(Catalase: CAT)含量測定參照 Sinha(1972); 蛋白質采用 Felin-酚試劑法(Lowryet al, 1951), 試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。

1.5 數據處理與模型建立

本實驗中的測定結果用平均值±標準差(Mean±Standard diversion)表示。實驗設計與結果處理采用STATISTICA 8.0軟件, 通過最小二乘法擬合因子與響應值之間的二次多項回歸模型為:

式中, ?Y為響應預測, 在此響應指標為SGR、MDA、SOD 和 CAT;b0、b1、b2、b3、b4、b5, 分別為回歸常數、N與D的一次效應、N與D間互作效應、N與D的二次效應。顯著水平P<0.05, 極顯著水平P<0.01。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽(N)與養殖密度(D)對吉富羅非魚幼魚SGR的影響

將表1中SGR結果采用最小二乘法進行回歸擬合, 結果列于表2?；貧w方程系數顯著性檢驗中N、D、D×N和N2和D2對SGR均有顯著影響(P<0.05)(表2)。同時, 由表2回歸系數可見, 在對SGR影響效應上,N占主效應。D和N與SGR之間模型為(1):

N和D與SGR之間的響應曲面圖及其等高線圖見圖1(a和b)。本實驗條件下, 隨著水環境中N升高,SGR基本在6.90%/d; 然而,N高于0.70mg/L時, SGR呈下降趨勢(P<0.05); SGR隨D的增加呈先上升后下降的趨勢。D為2.03—2.36尾/10L,N為0.43—0.48mg/L時, SGR介于7.26—7.29%/d。

表2 回歸方程系數顯著性檢驗Tab.2 Test of significance for regression coefficient

圖1 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚特定生長率影響的響應面(a)和等高線(b)Fig.1 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on SGR in GIFT tilapia juvenile

2.2 N與D對吉富羅非魚幼魚肝臟MDA含量的影響

采用最小二乘法對表1的MDA數據進行回歸擬合, 分析結果列于表3。D和N對MDA有極顯著影響(P<0.01),D2、N2和D×N對 MDA 沒有顯著影響(P>0.05)(表 3); 在對 MDA的影響效應上,D較為顯著?；貧w模型為(2):

由圖2可見, MDA含量隨著N與D的增加而上升。當N為1.41mg/L,D為1尾/10L時, 幼魚肝臟MDA含量為0.67nmol/mgprot; 高密度刺激了肝臟MDA含量的增加,D為5尾/10L, MDA含量達到0.96nmol/mg prot。

2.3 N與D對吉富羅非魚幼魚肝臟SOD活力的影響

SOD回歸分析結果見表4。D、D2和N2對SOD有極顯著影響(P<0.01), 而N與D×N對SOD也有顯著影響(P<0.05)(表4); 回歸系數顯示,D對SOD的效應較N明顯?；貧w模型為(3):

本實驗條件下, 當D為3尾/10L時, SOD活力隨水環境中N濃度增加(從0.02 mg/L到1.50mg/L)而上升; 然而, 隨著N濃度繼續上升(>1.50mg/L), SOD活力顯著降低(P<0.05)(圖3); 同時,N為1.63 mg/L,D為2.55尾/10L時, 肝臟SOD活力為105.46 U/(mg prot),其可靠性為0.918。

2.4 N與D對吉富羅非魚幼魚肝臟CAT活力的影響

CAT活力擬合與顯著性檢驗結果見表5?；貧w模型極顯著(P<0.01); 失擬項P=0.1186>0.05, 模型有效。N,D和D×N對CAT活力有顯著影響(P<0.05),N2與D2對CAT活力有極顯著影響(P<0.01)(表5); 回歸系數顯示,N與D對CAT活力的影響無明顯差異。D、N與CAT活力之間的實際二次回歸模型(4):

表3 回歸方程系數顯著性檢驗Tab.3 Test of significance for regression coefficient

圖2 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚肝臟MDA含量影響的響應面(a)和等高線(b)Fig.2 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on hepatic MDA contents in GIFT tilapia juvenile

圖3 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚超氧化物歧化酶活力影響的響應面(a)和等高線(b)Fig.3 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on hepatic SOD activities in GIFT tilapia juvenile

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Tab.4 Test of significance for regression coefficient

表5 回歸方程系數顯著性檢驗Tab.5 Test of significance for regression coefficient

本實驗條件下,D為3尾/10L, 肝臟CAT活力隨水中N濃度的增加(從0.02mg/L上升為1.35mg/L)而上升; 然而, 水環境中N高于1.35mg/L時, 羅非魚肝臟CAT活力呈下降趨勢(圖4);D對CAT活力的影響與SOD相似。當D為3.19尾/10L,N為1.20 mg/L時,CAT活力為45.17 U/(mg prot), 其可靠性為0.929。

3 討論

在含氮化合物中, 氨氮與亞硝酸鹽是水產養殖系統中主要的污染物。水環境中亞硝酸鹽的毒性依據實驗條件的不同以及生物個體的特點, 在不同魚類中差異較大, 這就給比較不同魚類對于亞硝酸鹽的敏感程度帶來了困難。紅肚鯧魚(Colossoma macropomum)在急性亞硝酸鹽脅迫下96h的半致死濃度為0.54mg/L, 顯示對亞硝酸鹽脅迫極為敏感(Da Costaet al, 2004); 虹鱒在溫度為 14.0—15.5°C時, 96h的半致死濃度為11.2mg/L, 而在10.0°C時僅為0.24mg/L(Russoet al,1977); 鮭類對亞硝酸鹽的耐受性可達 140mg/L(Russoet al, 1977)。本研究中, 在亞硝酸鹽濃度不同、其它水環境因子基本相同的條件下, 比較了水中 Cl–濃度為16 mg/L時, 不同養殖密度下慢性亞硝酸鹽脅迫對吉富品系尼羅羅非魚生長與肝臟抗氧化因子的影響。

3.1 亞硝酸鹽與養殖密度對吉富羅非魚幼魚生長的影響

圖4 亞硝酸鹽、密度及其交互作用對吉富羅非魚幼魚過氧化氫酶活力影響的響應面(a)和等高線(b)Fig.4 Response surface plot (a) and its contour plot (b) of the effect of nitrite and stocking density and their mutual interactions on CAT activities in GIFT tilapia juvenile

亞硝酸鹽能直接或間接影響魚類的生長和生存,其對魚類的毒害作用會嚴重制約水產養殖業的發展。亞硝酸鹽對淡水生物的毒性遠高于海洋生物, 可能是因為海水中有較高的氯化物濃度以及對滲透壓調節能力的不同(Jensen, 2003)。本實驗中, 吉富羅非魚不同實驗組合下飼養35d后, 養殖密度為3尾/10L時,亞硝酸鹽濃度為 0.02mg/L的實驗組, 幼魚的特定生長率是2mg/L組的1.82倍。Frances等(1998)研究發現石首魚(Bidyanus bidyanus)在水中亞硝酸鹽濃度低于 16.2mg/L時, 不會引起死亡; 而濃度高于 1.43mg/L時, 25d后, 其生長速度顯著降低。Siikavuopio等(2006)研究發現, 大西洋鱈魚(Gadus morhua)在0—5mg/L的亞硝酸鹽濃度的水環境中, 31d后, 生長速度隨濃度升高而降低, 但對攝食率無明顯影響。本研究中發現, 當亞硝酸鹽濃度高于 0.7mg/L時, 幼魚的生長率顯著下降。血紅蛋白中的Fe2+可以通過水體的亞硝酸鹽氧化為 Fe3+, 從而產生高鐵血紅蛋白, 由于高鐵血紅蛋白缺乏運輸氧氣的能力, 因而血液的載氧能力降低, 呼吸機能下降, 造成組織缺氧(Jensen,2003)。魚體需要更多能量來加快自身解毒功能, 魚類活動能力會增強, 呼吸頻率加快, 耗氧率上升(Mallasenet al, 2006), 因而用于生長的將會減少。與本實驗結論相反, Kamstra等(1996)研究發現, 隨著水中亞硝酸鹽濃度升高, 50d后, 高濃度實驗組歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)的死亡率較高, 但亞硝酸鹽對其生長與飼料利用無顯著影響, 可能是因為各組魚的死亡引起密度差異或其它環境因子的復合影響, 導致無法更加有效的解釋其生長數據。

Kebus等(1992)認為, 高養殖密度抑制魚類生長主要是由于高負載造成水質惡化引起的。本實驗中,除了水中亞硝酸鹽濃度不同外, 其它各項水環境指標均在羅非魚正常生長的范圍之內。實驗中發現, 適當的提高養殖密度可能會刺激羅非魚的能量代謝,通過提高外源食物的獲取, 在一定程度上促進羅非魚的生長。然而, 隨著密度的增加, 高養殖密度對羅非魚產生了生理應激, 動員體內更多的能量來彌補應激對能量的額外需求, 從而導致用于生長的能量減少(Qianget al, 2013), 對生長產生了抑制作用。

3.2 亞硝酸鹽與養殖密度對吉富羅非魚幼魚肝臟MDA、SOD與CAT指標影響

通常, 氧化系統中特異酶活表達水平或活力的變化可以用于環境脅迫時機體氧化應激的生物指標(強俊等, 2012)。本實驗中, 慢性亞硝酸鹽脅迫改變了羅非魚肝臟MDA含量和CAT與SOD的活力。亞硝酸鹽濃度為 1.35—1.41mg/L時, 肝臟中較高的 SOD與 CAT活力可能與魚體增加代謝來適應環境脅迫,減輕脂質過氧化損傷有關。然而, 當水環境中的亞硝酸鹽濃度高于羅非魚自身的耐受范圍時, MDA含量隨著氧自由基積累而增加(強俊等, 2011)。隨著亞硝酸鹽濃度繼續上升, 魚體的SOD與CAT活力明顯下降,可能是細胞代謝發生一定程度的改變而不是氧化應激的結果(Martínez-álvarezet al, 2002)。Wang 等(2004)研究發現, 日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在半致死亞硝酸鹽濃度下脅迫24h, SOD、CAT與GPx活力分別下降了67%、80.6% 和82.7%。本研究中發現, 羅非魚肝臟SOD與CAT活力對水環境中亞硝酸鹽的波動較為敏感, 可用作評估其面對亞硝酸鹽應激時的良好指示物。

魚類工廠化養殖中, 較高的水體亞硝酸鹽濃度通常與高密度的養殖條件密切相連(Mallasenet al,2006)。Aksakal等(2011)發現, 增加養殖密度會抑制抗氧化酶的代謝活力。羅非魚養殖密度較低時(<3尾/10L)時, 肝臟SOD與CAT活力的增加有助于降低魚體氧化應激。同時, 本研究發現SOD與CAT活力隨著密度的繼續升高(>3尾/10L)而下降, 造成肝臟組織中的脂質過氧化物的進一步增加, MDA含量也呈上升趨勢。這與彭士明等(2010)對銀鯧(Pampus argenteus)幼魚的研究結論相似, 適當的養殖密度下可以刺激SOD與CAT活力的表達。

3.3 亞硝酸鹽與養殖密度的互作與二次效應對吉富羅非魚幼魚生長及肝臟抗氧化指標的聯合影響

通過響應曲面分析法可以更好地分析因子對響應值的互作效應。本實驗首次發現羅非魚的生長(表2)與SOD(表4)、CAT(表5)活力與考察因子亞硝酸鹽與養殖密度之間存在顯著的互作效應, 而對MDA含量無互作效應。養殖密度對生長的影響隨著水體中亞硝酸鹽濃度的變化而變化。當水體中亞硝酸鹽濃度為0.02 mg/L, 特定生長率在密度為 1尾/10L時, 為6.90%/d; 而密度為5尾/10L時, 僅為2.76%/d。亞硝酸鹽濃度為2.8 mg/L, 密度為5尾/10L時, 特定生長率為2.60%/d?？赡苁且驗? 養殖密度較低時, 亞硝酸鹽對生長的影響被充足的水中溶氧所減弱(Fosset al,2007)。隨著養殖密度的增加, 高濃度的亞硝酸鹽環境影響了羅非魚呼吸頻率與代謝率, 魚體消耗更多能量用于緩解脅迫。水體中亞硝酸鹽的毒性也會破壞魚體血液中血紅蛋白的載氧能力, 造成機體供氧不足,降低羅非魚的代謝速率, 機體產生的能量又主要用于應對生理脅迫, 從而引起生長減慢、抗氧化能力減弱。此外, 亞硝酸鹽效應對生長的影響較養殖密度明顯; 而密度對肝臟MDA含量與SOD活力上較亞硝酸鹽明顯。

同時, 本研究首次發現養殖密度的二次效應對生長、SOD與CAT活力有顯著影響, 亞硝酸鹽的二次效應對SOD與CAT活力也有顯著影響。這在實際生產中有較高的應用價值。說明適當的養殖密度與亞硝酸鹽的刺激對生長與抗氧化酶活力并無抑制作用,甚至有所提高。提高的抗氧化酶活力有助于羅非魚增強其自身的非特異性免疫力, 提高抗應激能力。

本實驗建立了考察因子與響應值的二次回歸數學模型, 模型決定系數分別為0.9384、0.9004、0.9520和0.9650, 可用于分析與預測。然而, 需要注意的是,在實際集約化養殖中, 如果養殖過大, 對水質管理不規范, 會引起水環境亞硝酸鹽濃度升高, 對魚體產生生理脅迫。通過及時加注新水, 增加溶氧, 可以降低亞硝酸鹽毒性, 減少魚體發病的幾率, 促進羅非魚產業健康持續的發展。

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