文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表達分析*

李 猛 周素明 劉 璐 彭 頔 王國良

(寧波大學 應用海洋生物技術教育部重點實驗室 寧波 315211)

文蛤(Meretrix meretrix)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchiata)、簾蛤目(Veneroida)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤屬(Meretrix)。具有很高的食用和藥用價值, 廣泛分布于山東、江蘇、廣西、浙江等沿海地區。近年來, 由于養殖規模擴大, 環境惡化, 管理方法不當等導致病害滋生, 嚴重阻礙了文蛤養殖業的健康發展。為提高文蛤的抗病害能力, 有必要對其免疫相關因子進行深入研究。

凝集素是一類可結合糖類物質的蛋白, 最初于植物中發現, 在細菌、真菌和動物中同樣大量存在。凝集素在多種生命過程包括細胞間通信、蛋白的折疊和裝配、信號轉導、非己識別等中發揮著重要作用(Vastaet al, 2004)。根據凝集素糖類識別結構域CRD的結構特征不同, 可將凝集素分為 C-、L-、P-、I-、R-和 S-型凝集素等(Janewayet al, 2002)。C-型凝集素家族是目前研究最多的一類凝集素, 其主要特征是在蛋白質分子的 C末端含有糖識別的結構域 CRD,具有保守特征性功能域, 其凝集活性具有鈣離子依賴性(羅展等, 2010)。貝類動物的免疫機制以非特異性免疫為主, 其中 C-型凝集素作為可與糖專一性結合并能促使細胞凝集的蛋白質或糖蛋白, 在免疫識別和防御系統中專一地與異物表面特定的糖基結合,從而吸附和凝集異物, 促進機體清除和殺滅異物(Tamplinet al, 1989)。目前, 已經在櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(Wanget al, 2007; Zhanget al, 2009a)、海灣扇貝(Argopecten irradians)(Zhuet al, 2008)、合浦珠母貝(Pinctada fucata)(胡鈺婷等, 2011)、刺參(Apostichopus japonicus) (Hanet al, 2012)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(Zhanget al, 2009b)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(于金紅等, 2013)等不同海洋動物中發現并克隆獲得 C-型凝集素基因的全長序列, 但在文蛤中對 C-型凝集素的研究相對較少。本實驗成功獲得了文蛤 C-型凝集素基因的 cDNA全序列, 明確了它的序列特征、系統進化關系及其對環境因子脅迫影響的表達變化, 為進一步深入研究文蛤 C-型凝集素的免疫功能提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

文蛤采樣于溫州市龍灣區文蛤養殖場, 選擇殼色正常、無異味, 健康無發病癥狀的文蛤于實驗室暫養3天后進行試驗。大腸桿菌E.coliTG1和溶藻弧菌菌株為本實驗室保存, 連接載體 pMD18T購于TaKaRa公司。

TRizol總 RNA 提取試劑盒(Invitrogen), 3￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase (TaKaRa),5￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase(TaKaRa), PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthseis Kit (TaKaRa), GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。PCR儀(Bio-Rad), 微量核酸蛋白測定儀(Bio-Rad), 冷凍離心機(Eppendorf),凝膠成像儀(Bio-Rad)。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank上已有的貝類C-型凝集素基因序列, 設計克隆及定量PCR所需引物(表1, 表2)。

表1 文蛤C-型凝集素基因克隆所用引物及序列Tab. 1 Primers used to clone the C-type lectin gene of M. meretrix

1.3 文蛤總RNA提取及cDNA第一鏈合成

挑選三只健康文蛤并取肝胰腺組織 20—50mg,采用RNA提取試劑盒(Trizol Reagent, Invitrogen)提取總RNA。使用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthseis Kit, TaKaRa)將之反轉錄成cDNA,37 °C反轉錄15min, 85°C 5s。合成的cDNA產物于–20°C保存以供后續實驗使用。

1.4 文蛤C-型凝集素基因克隆

根據文蛤C-型凝集素基因(Mm-CTL)的EST序列設計一對引物CTL-R1和CTL-F1(表1), 以cDNA為模板 PCR 擴增。擴增體系: 超純水 15.7μL, cDNA 1.0μL, 10×PCR buffer 2.5μL, MgCl21.5μL, dNTP 2.0μL, CTL-R1 1.0μL, CTL-F1 1.0μL, rTaq 0.3μL。反應條件: 94°C 5min, 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 40s, 共35個循環, 72°C延伸10min。擴增產物經過凝膠電泳后, 利用 GenClean 柱式瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收目的條帶, 與 pMD18T載體連接并轉化進大腸桿菌TG1中, PCR檢測正確并送至上海英駿生物公司測序。

根據所得序列分別設計3￠RACE和5￠RACE引物(表 1), 按照 3￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒和 5￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒說明書進行擴增。擴增產物進行凝膠電泳確認, 并將出現的條帶割膠回收, 回收產物連接轉化, PCR檢測正確并送樣測序。

1.5 生物信息學分析

將拼接后的 Mm-CTL進行生物信息學分析。利用 NCBI 的 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)程序對所得序列作開放閱讀框分析, 預測編碼氨基酸序列, 同時利用 Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白的功能域。使用 NCBI的blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行氨基酸同源性分析, 用MEGA 4.1軟件構建系統進化樹。

1.6 感染及環境脅迫實驗

制備濃度為107cells/mL的溶藻弧菌菌懸液, 取菌懸液以 1︰100的比例與過濾海水稀釋后, 將文蛤放入其中浸染, 對照組采用過濾后海水, 鹽度 20, 溫度25°C。對照組與實驗組同步取樣, 分別在0h、6h、12h、24h、48h、72h隨機選取每組三只文蛤提取肝胰腺RNA, 反轉錄成cDNA備用。

將健康的文蛤隨機分成6組, 分別放在鹽度為5、10、15、20、25、30的海水中 25°C 培養, 12h后每組隨機選取3只文蛤提取肝胰腺RNA, 反轉錄成cDNA備用。

將健康的文蛤隨機分成6組, 分別放在溫度分別為 10、15、20、25、30、35°C 的海水中(鹽度 20)培養, 12h后每組隨機選取 3只文蛤提取肝胰腺 RNA,反轉錄成cDNA備用。

分別以上述所制備的 cDNA 為模板, 以 P-β-ACTIN-F、P-β-ACTIN-R、P-C-F、P-C-R (表 2)為引物進行目的基因和內參基因β-actin的RT-PCR擴增,擴增體系同上。目的基因擴增條件為94°C 5min, 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 共 35 個循環, 72°C 延伸10min。內參基因擴增條件為 94°C 5min, 94°C 30s,56°C 30s, 72°C 30s, 共 28 個循環, 72°C 延伸 10min。反應重復三次 RT-PCR。將 PCR結果用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 在凝膠成像儀下成像。

2 結果

2.1 文蛤C-型凝集素的基因克隆與生物信息學分析

通過PCR和RACE技術獲得Mm-CTL核心序列和3￠端與 5￠端序列, 經過拼接該基因的全長為 1855bp(GenBank序列號: JX232217), 其開放閱讀框為519bp,編碼172個氨基酸(圖1)。利用Smart軟件預測蛋白的功能域(圖1, 圖2)。結果顯示, 第34個蛋白到168個蛋白為 Mm-CTL的糖識別結構域(CRD), 該 CRD 含有的參與二硫鍵形成的 6個保守的半胱氨酸, 分別位于 Cys34、Cys47、Cys64、Cys143、Cys159、Cys167。在CRD區域中找到決定糖結合的特異性序列“EPN”。

圖1 文蛤C-型凝集素基因cDNA序列Fig.1 cDNA sequences of C-lectin gene in M. meretrix陰影表示CRD, 曲線下劃線表示決定糖結合特異性的序列(EPN)

圖2 C-型凝集素預測蛋白結構域Fig.2 Domain analysis on putative C-lectin protein

將拼接后的序列進行同源性比對, 結果顯示與日本刺參(Apostichopus japonicus), 青鳉(Oryzias latipes),中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis), 日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus), 長牡蠣(Crassostrea gigas),大竹蟶(Solen grandis)相對應的氨基酸序列相似性分別為 13.5%、13.5%、21.5%、23.2%、23.9%、56.5%(圖 3)。

利用MEGA4.1軟件對Mm-CTL進行生物信息學分析, 構建進化樹, 用 N-J方法進行聚類分析。進化樹結果顯示(圖 4), 不同物種的凝集素各自成簇, 脊椎動物聚在一類, 無脊椎動物聚在一類。從文蛤體內獲得的Mm-CTL與大竹蟶(Solen grandis)聚類在一起,與長牡蠣(Crassostrea gigas)進化距離較近。

2.2 環境因子對文蛤C-型凝集素基因表達量變化的影響

2.2.1 弧菌感染對文蛤體內 C-型凝集素基因表達量的影響 在溶藻弧菌刺激下, 文蛤肝胰腺 Mm-CTL表達量變化結果見圖5。溶藻弧菌感染6h時表達量明顯上升, 在12h時達到最高值, 隨后有所下降,72h時趨于穩定并與對照組無明顯差異。

2.2.2 鹽度變化對文蛤體內 C-型凝集素基因表達量的影響 在不同鹽度脅迫下, 文蛤肝胰腺 Mm-CTL表達量變化結果見圖 6。在鹽度 5時 Mm-CTL表達量比較低, 在鹽度10—20范圍時Mm-CTL表達量相對較高, 當鹽度高于20時, Mm-CTL的表達量反而較低。

2.2.3 溫度變化對文蛤體內 C-型凝集素基因表達量的影響 在不同溫度脅迫下, 文蛤肝胰腺 Mm-CTL表達量變化結果見圖7。在水溫25°C以上時, 隨著水溫的上升表達量明顯上升, 水溫 25°C以下時,隨著溫度下降表達量明顯下降。35°C時表達量相對最高, 10°C時表達量明顯較低。

圖3 文蛤C-型凝集素氨基酸序列與其它物種凝集素氨基酸序列的比對Fig.3 Multiple alignments of amino acid sequence of C-lectin of M. meretrix with other known species genes黑色背景表示相同的氨基酸, 灰色背景表示性質相似的氨基酸

圖4 不同物種凝集素氨基酸序列系統進化樹Fig.4 The evolutionary tree of lectin amino acid sequence of different species

3 討論

C-型凝集素是一類鈣離子依賴活性的糖蛋白,包含至少一個保守的糖基識別結構域(陳政良, 1997),低等生物的 C-型凝集素基因一般只有一個 CRD, 而其它物種則有的兩個或多個CRD (Songet al, 2010)。對于蝦類而言, 日本囊對蝦已報道的 C-型凝集素基因中均只含 1個 CRD結構域, 羅氏沼蝦已報道的 4個C-型凝集素基因中都含2個CRD結構域(Renet al,2012)。中國明對蝦和凡納濱對蝦則存在C-型凝集素基因中既有包含1個CRD的又有含2個CRD結構域的情況(Liuet al, 2007; Sunet al, 2008; Weiet al,2012)。合浦珠母貝和櫛孔扇貝 C-型凝集素基因中也都包含1個CRD結構域(胡鈺婷等, 2011)。本研究中克隆獲得的文蛤 C-型凝集素基因和合浦珠母貝和櫛孔扇貝相似, 只含1個CRD結構域。CRD結構域中,主要由 2個基序與鈣離子共同作用完成對糖基分子的結合, 第一個典型的基序為 EPN或 QPD, 第二個典型的基序為WND。EPN可對甘露糖進行識別, QPD則可識別半乳糖(Drickamer, 1992; Kolatkaret al,1996)。本研究顯示, 文蛤 C-型凝集素基因糖基結合位點為 EPN, 表明文蛤 C-型凝集素可能對甘露糖進行識別并結合。

圖5 文蛤肝胰腺C-型凝集素在溶藻弧菌刺激后的RT-PCR電泳圖Fig.5 RT-PCR electrophoregrams of C-lectin gene in hemocytes of M. meretrix after V. alginolyticus challenge

圖6 文蛤肝胰腺C-型凝集素基因在不同鹽度刺激后的RT-PCR電泳圖譜Fig.6 RT-PCR electrophoregrams of C-lectin gene in hemocytes of M. meretrix in different salinities

圖7 文蛤肝胰腺C-型凝集素基因在不同溫度刺激后的RT-PCR電泳圖譜Fig.7 RT-PCR electrophoregrams of C-lectin gene in hemocytes in M. meretrix in different temperatures

貝類具有非特異免疫系統, 免疫系統比較簡單,易受外界脅迫影響。在通過先天免疫對病原菌感染的應答過程中, C-型凝集素扮演著重要的作用(Willmentet al, 2008)。吳彪等(2013)用鰻弧菌感染蝦夷扇貝后4h表達量顯著上升, 8h達到最高峰, 隨后下降, 16h后與對照基本無差異。胡鈺婷等(2011)在合浦珠母貝C-型凝集素基因研究中, 用溶藻弧菌刺激后的 4h至24 h表達量顯著上調。本實驗用溶藻弧菌感染文蛤,Mm-CTL在6h時表達量明顯上升, 在12h時達到最高值, 隨后有所下降, 72h時趨于穩定。說明Mm-CTL的表達量可受微生物刺激而誘導, 也表明 Mm-CTL參與對微生物入侵的免疫應答, 有助于提高文蛤的免疫防御能力。

溫度和鹽度是影響貝類生長, 攝食, 免疫應答等非常重要的環境因子(Kimet al, 2009)。有研究表明, 貝類病害的爆發與鹽度的變化有直接的關系, 這可能與鹽度脅迫導致貝類免疫能力下降有關。Cheng等(2004)研究鹽度對雜色鮑(Haliotis diversicolor supertexta)免疫能力的影響表明, 當雜色鮑由鹽度 30的環境, 轉移到鹽度20、25和35的環境中時, 其血細胞數量減少,酚氧化酶活力、吞噬活力、呼吸爆破活力和清除副溶血弧菌的能力降低, 雜色鮑容易受到致病菌的侵襲而死亡。鹽度變化不僅可以通過影響免疫因子活力的方式來影響機體的免疫能力, 還可以通過影響免疫因子表達量變化來影響機體免疫能力。本實驗在研究不同鹽度對 Mm-CTL表達量變化時發現, 鹽度 10、15和20時Mm-CTL的表達量相對較高。表明鹽度在一定的變化幅度內能誘導 Mm-CTL的表達, 起免疫保護作用, 但超出一定范圍則免疫功能將受到抑制。

Dang等(2012)的研究發現歐洲鮑螺(Haliotisrubra)在水溫由 18°C升至 21°C和 24°C時, 其抗菌活力和抗病毒活力上升, 但長時間脅迫, 會導致歐洲鮑螺抗菌活力和抗病毒活力受到抑制。李曉英等(2009)對青蛤(Cyclina sinensis)的研究表明, 短時間內, 溫度驟升能提升青蛤超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力, 但長時間的高溫刺激, 反而會抑制兩種酶活性。本實驗結果顯示, 在溫度高于25°C時, Mm-CTL的表達量隨溫度升高明顯上升, 表明溫度的變化可以誘導文蛤免疫因子的表達, 從而調節免疫反應。

4 結論

本研究從文蛤中克隆到一種 C-型凝集素的基因,通過蛋白序列分析, 發現在 Mm-CTL存在典型的糖基識別結構域。通過表達分析發現, Mm-CTL的表達不僅受到弧菌感染的影響, 同時也受環境溫度和鹽度變化的影響。由于貝類是一種海洋無脊椎動物, 其免疫系統極有可能對環境的變化做出響應。本研究結果將為貝類先天性免疫因子表達的調控以及貝類病害的防控奠定基礎。

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