1株分離于鈾礦的可利用玉米秸稈高效產氫的芽孢桿菌*

張曉，何曉銳，龐園濤，朱艷杰，黃建新

(西北大學生命科學學院，陜西西安，710069)

氫能是一種可再生的潔凈能源，具有重量輕、無污染、熱值高等特性，成為21世紀的理想能源［1－3］。目前制氫的方法有物理化學法和生物法。物理化學制氫方法是以礦物資源為原料，需要消耗大量的能源，制氫成本較高;生物制氫是利用可再生能源通過生物的轉化制取氫氣，這一過程既緩解了能源危機，又消除了環境污染，是一種理想的產能方式［4］。其中，厭氧發酵微生物制氫因其產氫效率高，對環境的適應性強，反應器設計簡單，能夠利用有機廢水、固體廢物進行發酵產氫等特點越來越受到青睞［5］。已報道的厭氧發酵產氫細菌包括梭菌(Clostridium)［6］、腸桿菌(Enterobacter)［7］、芽孢桿菌(Bacillus)［8］、埃希氏菌(Escherichia)［9］等幾大類，雖然有關梭菌類和腸桿菌類菌株的發酵制氫研究報道較多，但高效產氫菌種的獲得、降低制氫成本以及工業化生產仍是生物制氫技術中的難點。此外現有的生物制氫技術利用的基質主要集中在一些簡單碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及由這些簡單化合物構成的廢水等，對于纖維素類等難以降解物質的發酵產氫研究很少［10－15］。本文從鈾礦極端環境中分離獲得1株利用玉米秸稈酵解物發酵產氫的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)w-14，該菌株具有兼性厭氧特點，可以葡萄糖(10 g/L)為發酵底物，累積產氫量達1 071.4 mL/L培養基;以玉米秸稈酵解物為發酵基質，累積產氫量可達140.24 mL/g-cs，比已有文獻報道發酵秸稈的產氫效率高［16－17］，該研究對開發利用可再生生物質轉化生產潔凈氫能源具有理論和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產氫菌:從十紅灘砂巖型鈾礦巖芯中富集分離獲得。

秸稈降解用麩曲:本實驗室用康氏木霉(K-3)、黑曲霉(Q-2)固態發酵制備、保藏(以下簡稱KQ-麩曲)，使用前測定纖維素酶活為0.80～0.93 U/g(干曲)(酶活為單位為:1 h從底物溶液中分解產生1 mg葡萄糖的酶量)。

1.1.2 培養基

產氫菌富集培養基(g/L):蛋白胨8，牛肉膏3，酵母膏 1，NaCl 3，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.05，葡萄糖10，L-半胱氨酸0.3，1 000 mL，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

產氫菌的分離培養基:產氫菌富集培養基中加入瓊脂1.4%，用于二重疊皿法分離菌種。

玉米秸稈產氫發酵培養基(g/L):蛋白胨5，酵母膏0.5，L-半胱氨酸0.3，玉米秸稈酵解物200 mL，無機鹽營養液20 mL，蒸餾水780 mL，pH 7.0，115℃滅菌，30 min。

無機鹽營養液(g/L):NH4HCO32，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.01，Na2MoO4· 2H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.01，MnSO4·7H2O 0.015，FeCl20.002 5，起始 pH 5.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效產氫菌的分離篩選

鈾礦巖心樣在超凈工作臺中紫外照射20～30 min，去除四周表層約1.0～1.5 cm，取巖芯內部分于無菌研缽內磨成細粉，以5 g/100 mL的量，加入產氫菌富集培養基，無菌液體石蠟封液面，37℃深層富集培養。待培養瓶中的培養液渾濁并有大量氣體產生后，用100 μL氣密性進樣器抽取氣體于GC-SP 6890型氣相色譜儀檢測氣體組分，選取有氫氣產生的培養液，采用二重疊皿隔絕空氣培養法進行產氫菌分離、純化。分離獲得的可產氫菌株，接種于產氫菌富集培養基中，連接氣體收集裝置(圖1)，于37℃水浴進行深層發酵培養，根據單位培養基產氫量來比較菌株的產氫能力，篩選產氫能力高的菌株。重復進行3次。

圖1 氣體體積分析裝置示意圖Fig 1 A static equipment to measure the volume of hydrogen produced

1.2.2 產氫菌株的鑒定

依據《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)［18］、《常用細菌鑒定手冊》［19］及16S rRNA基因序列分析對菌種進行鑒定;擴增菌株的16S rRNA基因序列所用的引物為:27F:5-GAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'1495R:5'-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3'(上海sangon公司)。反應條件:95℃預變性5 min，30個循環(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min)72℃延伸 10 min，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物測序，測序工作委托上海Sangon公司完成;測序后將測序結果用BLAST軟件與GenBank中16S rRNA基因序列進行同源性比較。從GenBank中調取不同菌株的16S rRNA基因序列用于系統發育分析，16S rRNA基因序列用MEGA 5.1構建系統發育樹。

1.2.3 產氫菌生長曲線測定

采用間歇試驗測定菌株的生長曲線，將培養24 h的產氫細菌按5%的接種量接種于裝有800 mL液體產氫培養基的1 000 mL錐形瓶中，37℃恒溫水浴下培養，定時測其累積產氫量和活菌數的變化，繪制產氫菌的生長曲線。

1.2.4 秸稈的預處理

玉米秸稈水洗烘干，用微型粉碎機粉碎過80目的篩子，過篩的玉米秸稈粉用0.75%的氨水50℃浸泡預處理16 h，水洗至中性，烘干備用。

1.2.5 玉米秸稈酵解物的制備

取預處理后秸稈粉100 g，麩皮10 g，無機鹽營養液15 mL，蒸餾水 200 mL于 1 000 mL燒杯中，121℃，處理20 min，冷卻至45℃，再加入不同量(5，10，15，20，25 g/L)的 KQ-麩曲，加水補足至 500 mL，攪拌混勻，在45℃，pH為5.0條件下酵解84 h，酵解后100℃煮沸10 min，加水混勻，取1 mL浸提過濾測定還原糖含量，以酵解物還原糖濃度及產氫菌株利用不同KQ-麩曲濃度下的酵解物進行發酵作用的累積產氫量來確定玉米秸稈酵解最適KQ-麩曲用量，在此基礎上再確定出溫度(35，40，45，50 ℃)，時間(60，72，84，96 h)，pH(4.0，4.5，5.0，5.5)不同酵解條件的酵解物對產氫菌株發酵產氫的影響，依據產氫細菌利用不同酵解條件的酵解物累積產氫量確定出秸稈酵解最適條件。酵解物于4℃保存備用。

1.2.6 秸稈酵解物產氫發酵

250 mL錐形瓶中加入180 mL玉米秸稈產氫發酵培養基，接種經16 h培養活化的產氫菌(w-14)種子液，接種量為10%，于37℃下，深層靜置培養，定時檢測產氣量，分析氣相產物中氫氣濃度，平均產氫速率，做3個平行。

1.2.7 w-14菌株利用秸稈酵解物產氫條件的優化

采用L9(34)正交試驗對w-14菌株利用玉米秸稈酵解物發酵產氫條件即溫度、接種量、初始pH值和菌齡進行優化。

1.2.8 玉米秸稈酵解物發酵產氫5L放大實驗

玉米秸稈產氫發酵培養基3.5 L置于5 L間歇攪拌(90 r/min)深層發酵產氫反應器(圖2)，初始pH為7.0，接種經16 h培養活化w-14的種子液，密封發酵罐，連接濕式氣體流量計，調節反應溫度為(37±1)℃，用濕氏氣體流量計測量產氣量，定時取樣檢測生物氣中氫氣含量，計算出累積產氫量。

圖2 厭氧發酵產氫反應器及流程圖Fig 2 The general layout of batch stirring submerged fermentation to produce hydrogen bioreactor

1.2.9 分析測定

pH值用DELAT 320型酸度計測量。稀釋二重疊皿平板法測定活菌數。水解液中還原糖含量用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)測定。氣體的收集采用排水法。定期從發酵產生的氣體中取100 μL注入氣相色譜儀(型號GC-SP 6890)測定發酵氣體中氫氣的含量。氬氣為載氣，流速為40 mL/min，色譜柱為3 mm內徑不銹鋼柱(TDX分子篩填充柱)柱溫、汽化室和檢測室分別為90、130、130 ℃。

2 結果與討論

2.1 產氫菌的分離與篩選

經初篩和復篩，從鈾礦床中分離得到5株產氫能力較好的菌株，結果見表1，其利用產氫菌富集培養基單位體積產氫量為(928.3±90.24)mL/L，與相關文獻數據相比［20－22］，這些源于鈾礦極端環境的野生菌株具有較高的產氫量，其中菌株w-14的產氫量最高。靜態產氫試驗時，接種4 h后w-14菌株開始有氣泡產生。24 h后用氣相色譜對w-14菌株的氣相產物進行分析(產氫色譜圖見圖3)，氫氣含量達到86.72%。間歇產氫試驗中，w-14的產氫累積量達到1 071.4 mL/L，比李珊珊等［20］利用陰溝腸桿菌FMLC以葡萄糖為底物產氫的累積產氫量(1 032 mL/L)略高，故源于鈾礦極端環境的產氫菌株具有很好的應用潛力。

表1 篩選后的產氫菌株的產氫能力對比Table 1 The hydrogen production ability of hydrogen production bacteria after screening

圖3 純氫(左)，w-14菌株(右)的產氫色譜峰值Fig 3 The chromatogram curve of standard hydrogen(left)and the strain w-14(right)

2.2 w-14菌株鑒定

w-14菌株在肉汁胨培養基深層培養20h，菌體桿狀，大小(0.6～1)μm×(3.0～5.6)μm，革蘭氏染色陽性(圖4)，培養28～30 h產生芽孢，芽孢中生;專性或兼性厭氧，具運動性。生理生化反應結果見表2;16S rRNA序列用MEGA 5.1構建系統發育樹見圖5。

16S rRNA基因序列同源性比較可見，w-14和Clostridium butyricum strain W4同源性達到100%。根據菌株形態特征，生理生化及16S rRNA基因序列分析結果，w-14菌株鑒定為 Clostridium butyricum。GenBank登錄號為KM528123。

圖4 w-14革蘭氏染色(左)和掃描電鏡(右)照片Fig 4 Gram＇s staining(left)and scanning electron microscope image(right)of the strain w-14

圖5 菌株w-14的16S rRNA基因序列的系統發育樹狀圖Fig.5 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic position of the isolated strain w-14，based on the 16S rRNA gene sequences of the strain w-14

表2 菌株w-14的生理生化鑒定結果(一)Table 2 Physiological characteristics of the strain w-14

2.3 w-14菌株以玉米秸稈酵解物為基質的發酵產氫

2.3.1 w-14菌株生長與產氫規律

菌株w-14在產氫菌富集培養基的生長與產氫曲線如圖6所示

圖6 菌株w-14的生長與產氫曲線Fig.6 The curve of w-14 ’s growth and hydrogen production

由圖6可見，0～4 h菌數增加緩慢為延遲期。4～16 h為對數生長期，細菌數量從5.64×104CFU/mL增加到4.7×106CFU/mL，菌數呈指數遞增，16 ～20 h為穩定期，活菌數基本上沒有變化始終在5.6×106個上下，21 h之后為衰亡期，菌數有所下降。w-14菌株產氫從6 h開始，持續到24 h。并在6～18 h期間產氫量迅速增加。

2.3.2 不同KQ-麩曲濃度的秸稈酵解對w-14菌株產氫的影響

秸稈酵解加入KQ-麩曲的量對其酵解物中還原糖和w-14菌株生長及產氫影響結果見圖7。由圖7可見，隨著麩曲質量濃度的增加，還原糖含量逐漸增加，活菌數和菌株產氫量也隨著糖濃度的增加而增加，當麩曲質量濃度為20 g/L，還原糖含量、菌數和菌株的產氫量分別為403 mg/g-cs、6.03×106CFU/mL和99.7 g/g-cs，當麩曲濃度為30 g/L時，還原糖含量、菌數和菌株的產氫量變化不大，故確定的麩曲最適用量為20 g/L。

圖7 不同麩曲濃度下還原糖含量和菌株w-14生長、產氫量的變化曲線Fig.7 The curve of w-14 ’s growth，cumulative H2yield and reducing sugar content at different concentrations of bran koji

2.3.3 玉米秸稈酵解溫度、時間、pH對w-14菌株產氫的影響

預處理的秸稈粉經KQ-麩曲酵解，其酵解溫度、時間及pH對w-14菌株產氫的影響見圖8。

由圖8可見，w-14菌株以不同酵解作用條件下的玉米秸稈酵解物為基質累積產氫量隨時間的變化趨勢有相似性，均經過5～6 h的延遲期后開始產生氫氣，隨后累積產氫量隨酵解溫度、時間、pH的增加而迅速增加，結果表明w-14菌株利用在45℃，pH 5.0酵解84 h的秸稈酵解物的累積產氫量達99.7 mL/g-cs，其后隨著酵解溫度、pH、時間繼續增加，w-14菌的累積產氫量不再增加并呈下降趨勢，其原因是溫度、pH升高，影響了麩曲酶活性導致纖維素的降解率下降，還原糖減少，產氫量下降;以上結果與文獻［17］纖維素酶對玉米秸稈進行糖化酵解發酵產氫的研究相比，具有成本低，氫氣轉化率高，易于工業化生產的優勢。

2.3.4 w-14菌株以秸稈酵解物為基質產氫發酵條件優化結果

L9(34)正交試驗結果見表3。由表3可知，w-14菌株以秸稈酵解物為基質最佳產氫發酵條件為:接種量為10%，溫度為37℃，初始 pH值為7.0，菌齡16 h，在此條件下菌株的產氫量和平均產氫速率最大，分別為140.24 mL/g-cs和12.19 mL/(g-cs·h)。分別以產氫量和平均產氫速率為指標，其影響因素的均表現為:D(溫度)＞C(接種量)＞B(初始pH)＞A(菌齡)。優化后w-14菌株利用秸稈酵解物的產氫量比優化前提高40.66%。

2.3.5 w-14菌株利用玉米秸稈酵解物發酵產氫放大實驗

由圖9可見，5 L厭氧反應器中菌株w-14利用秸稈酵解物產氫的累積產氫量與氫氣濃度(累積產氫量占總氣體的百分含量)隨時間的變化，在0～36 h累積產氫隨著發酵時間增加迅速增加，累積氫產量達到142.65 mL/g-cs，其后產氫量增加的速度有所減緩，并逐漸趨于穩定;發酵培養至56 h時產氫基本結束，累積氫產量為149.09 mL/g-cs，與正交試驗結果140.24 mL/g-cs一致。其氫氣濃度也呈現是先增加后減少趨勢，24 h時氫氣濃度達到最高54.62%。隨著w-14菌進入穩定生長期，底物逐漸消耗，氫氣濃度開始緩慢下降，至56 h時發酵結束，氫氣濃度降到30.23%。

圖9 累積產氫量與氫氣濃度隨時間的變化曲線Fig.9 The curve of cumulative H2yield and H2 percentage of mix gas vs.time

3 小結

從鈾礦中分離獲得1株可利用玉米秸稈的高效產氫菌w-14，經生理生化及16S rRNA基因序列分析鑒定w-14為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，與已有研究的丁酸梭菌相比，該菌株非嚴格厭氧菌，深層培養即可，更利于工業化生物氫能源生產。w-14菌株以經KQ-麩曲發酵后的玉米秸稈酵解物為基質，進行5L深層厭氧發酵，在種齡16 h，接種量10%，pH值7.0，產氫發酵溫度37℃條件下累積產氫量達149.09 mL/g-cs。本研究獲得的利用秸稈酵解物發酵產氫的菌株w-14以及對玉米秸稈的酵解處理工藝對開發利用可再生生物質，轉化生產潔凈氫能源具有一定的理論研究意義和的應用價值。

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